一种苯并咪唑类hERG钾离子通道的小分子荧光探针及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于药物技术领域，具体涉及一种苯并咪唑类hERG钾离子通道的小分子 荧光探针及其制备方法与应用。
【背景技术】
[0002] 人类果幡相关基因 （human ether-a-go-go related gene，hERG)是从人类海马 基因中分离鉴定得出，与果蝇EAG基因具有同源性。hERG基因编码心脏快速激活延迟整流 (Ife)钾离子通道的α亚基，此通道主要存在于心脏组织及神经系统，在心脏动作电位复极 化过程中发挥重要作用。近来人们发现hERG在许多肿瘤细胞中高表达，对肿瘤细胞的增殖 和凋亡具有调节作用。hERG基因的突变或hERG通道被阻滞时，会造成遗传性或获得性长 QT间期综合征（LQTS)，进而引发尖端扭转型室性心动过速、心室纤颤甚至发生猝死。
[0003] 对于一些临床药物或新药候选药物所表现出的心脏毒性，许多研宄表明是由于对 心肌细胞的hERG钾离子通道产生阻滞从而导致LQTS。hERG通道作为III类抗心律失常药物 的作用靶点，对其产生抑制作用的主要为心脏用药，如抗心律失常药（多非利特）、抗心绞 痛药（苄普地尔）和强心药（哌克昔林），另外，其他一些非心脏药物也可阻断该通道，如抗 精神失常药（氯丙嗪）、抗组胺药（特非那定）、胃肠动力药（西沙比利）等。由于药物与 hERG钾离子通道较高的亲和力而产生长QT间期综合征，目前，在新药临床前研宄中都应进 行心脏毒性的安全性评价，而hERG钾离子通道已作为药物心脏毒性筛选的重要靶标。
[0004] 研宄表明，hERG基因的表达在许多肿瘤细胞系中显著上调，如结肠癌细胞 (HT-29)、神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y)、胃癌细胞（SGC7901)，人乳腺癌细胞（MCF-7)等。 hERG钾离子通道与肿瘤细胞增殖、凋亡、分化及侵袭性密切相关，而在相应来源的正常细胞 中低表达或不表达。另外，对hERG通道有特异性阻断作用的药物可以抑制肿瘤细胞的增 殖。因而hERG钾离子通道将有可能作为肿瘤治疗的药物靶标，并且可以作为肿瘤形成的生 物标记物。
[0005] 近年来，用于hERG钾离子通道的高通量筛选方法有放射性配体结合实验、电压膜 片钳技术、及基于荧光探针的检测方法等。放射性配体结合实验，会造成辐射污染。电压膜 片钳技术由于其技术要求高，需投入较大的人力和物力，不适合大批量化合物的筛选。荧光 探针检测方法灵敏度高，简便快捷、不需特殊设备，被广泛用于各种生物分析中。目前，用于 钾离子通道相关的荧光探针主要采用荧光蛋白标记技术、免疫荧光技术、电压敏感荧光探 针等，而高选择性、高灵敏度的小分子荧光探针在钾离子通道领域的应用较少。小分子荧光 探针具有快速、灵敏、高通量和易于自动化等特点，已经广泛应用于蛋白质、核酸等重要生 物分子的生物学和药理学检测中，对疾病机制探讨、临床诊断及药物筛选等领域的发展具 有重要的意义。小分子探针一般由两部分组成：药效基团部分和荧光基团部分。药效基团 与目标生物分子成高亲和力结合，荧光基团通过激发而发射荧光以标记蛋白质。因此，人们 开始尝试用小分子荧光探针来检测化合物对hERG离子通道的作用。
[0006] 研宄建立针对hERG钾离子通道的荧光探针高通量筛选与标记的方法，将直接反 映化合物对hERG钾离子通道的抑制活性，对药物研发及临床前药物的安全性评价具有重 要意义。近年来，人们发现一些肿瘤细胞高表达hERG钾离子通道，这为研宄肿瘤细胞及其 组织提供了新的启示。
【发明内容】
[0007] 为了解决上述现有技术中存在的问题，本发明的目的是一种苯并咪唑类hERG钾 离子通道的小分子荧光探针及其制备方法与应用。
[0008] 为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
[0009] 一种苯并咪唑类hERG钾离子通道的小分子荧光探针，该荧光探针的结构通式如 式（I )所示：
[0010]
[0011] 式中，R1为羟基、卤素、烷基或烷氧基的单取代或多取代基；R2为荧光团；η = 1-6。
[0012] 优选的，所述R1为对位卤素 ；R 2为香豆素类、萘二酰亚胺类、NBD类、Cy5类及异硫 氰酸荧光素类荧光团；η = 4。
[0013] 优选的，所述小分子荧光探针选自具有如下结构式的化合物：
[0014]
[0015] 所述苯并咪唑类小分子荧光探针在hERG钾离子通道及其高表达的肿瘤细胞或组 织标记中的应用。
[0016] 所述苯并咪唑类小分子荧光探针可直接反映化合物对hERG钾离子通道的抑制活 性。
[0017] 所述苯并咪唑类小分子荧光探针在hERG钾离子通道抑制剂的高通量筛选以及在 新药心脏毒性评价中的应用。
[0018] 所述苯并咪唑类小分子荧光探针在作为识别hERG钾离子通道的探针以及在hERG 钾离子通道生理、病理及相关疾病研宄中的应用。
[0019] 一种苯并咪唑类小分子荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
[0020] ⑴识别基团的制备：2_氯苯并咪唑在碱性条件（pH = 10~14)下，与对氟苄溴 反应3~5h生成1-对氟苄基-2-氯苯并咪唑，再与4-氨基-1-乙氧甲酰基哌啶在微波 (35~50W，150~180°C )的条件下反应0· 5~lmin，生成4- ((1-对氟苄基-1H-2-苯并咪 唑基）氨基）-1-哌啶甲酸乙酯，再与质量分数为30 %~60 %氢溴酸于80~100°C回流生成 1-对氟苄基-N- (4-哌啶基）-1H-2-氨基苯并咪唑溴酸盐，接着与N- (4-溴丁基）邻苯二甲 醜亚胺在喊性条件（pH = 9~13)下反应8~9h，生成N-(4_ ((4_ ((1_对氣苄基-1H-2-苯 并咪唑基）氨基U-哌啶）丁基）邻苯二甲酰亚胺，再与质量分数为70%~80%水合肼反 应4~5h，得到N- (1- (4-氨丁基）哌啶基）-1-对氟苄基-1H-2-氨基苯并咪唑；
[0021] (2)探针分子的制备：制备各种荧光团，通过在荧光团上引入羧基，然后与 N- (I- (4-氨丁基）哌啶基）-1-对氟苄基-1H-2-氨基苯并咪唑在EDCI/HOBT/Et3N的 作用下发生缩合反应，室温反应12~14h，制得探针分子；或者在荧光团上引入卤素，与 N- (1- (4-氨丁基）哌啶基）-1-对氟苄基-1H-2-氨基苯并咪唑，碳酸钾作缚酸剂，乙腈作溶 剂，于70~80°C回流反应6~7h，发生取代反应，制备探针分子。
[0022] 优选的，所述步骤（1)中，2-氯苯并咪唑、对氟苄溴以及4-氨基-1-乙氧甲酰基哌 啶的加入的摩尔比为0. 5~1. 2 :1~1. 8 :1~2。
[0023] 优选的，所述步骤（1)中，4-氨基-1-乙氧甲酰基哌啶、氢溴酸、N-(4_溴丁基）邻 苯二甲酰亚胺以及水合肼加入的摩尔比为1~1. 8 :50~70 :1. 2~2 :60~80。
[0024] 优选的，所述步骤（1)中，回流时间为30~40h。
[0025] 优选的，所述步骤（2)中N-(1-(4-氨丁基）哌啶基）-1-对氟苄基-1H-2-氨基苯 并咪唑、含羧基的荧光团、EDCI、HOBT以及三乙胺加入的摩尔比为0. 5~1. 2 :0. 5~1. 2 : 1 ~2 :1 ~2 :1· 5 ~3〇
[0026] 优选的，所述步骤（2)中，N-(1-(4-氨丁基）哌啶基）-1-对氟苄基-1H-2-氨基 苯并咪唑、含卤素的荧光团、碳酸钾的摩尔比为0. 5~1. 2 :1~2 :1. 5~3。
[0027] 本发明的有益技术效果为：
[0028] 本发明的苯并咪唑类小分子荧光探针对hERG钾离子通道具有高选择性和高灵敏 度，可以用于hERG钾离子通道的识别，以及hERG钾离子通道生理、病理及相关疾病的研宄； 可用于hERG钾离子通道抑制剂的筛选，直接反应化合物对hERG钾离子通道的抑制活性，用 于新药心脏毒性评价的研宄中。
【附图说明】
[0029] 图1为Ll与hERG转染的HEK293细胞及加入抑制剂的成像结果；
[0030] 图2为Ll与神经母细胞瘤细胞及加入抑制剂的成像结果。
【具体实施方式】
[0031] 下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步的说明。
[0032] 实施例1 :香豆素类荧光团探针的制备：
[0033]
[0034] 具体合成路线如下：
[0035]
[0036] (1)中间体1的制备：
[0037] 向2-氯苯并咪挫（5g，32. 7mmol)中加入30ml乙腈和氢氧化钾（2. 62g，46. 6mmol， 加热至80°C，搅拌30min，溶液澄清；冷却至室温后，加入对氟节溴（9. 29g，49. lmmol)， 升温至80°C回流5h，反应液呈白色混浊液；将反应液用二氯甲烷萃取三次（100mLX3)， 蒸馏水洗涤，合并有机层，无水硫酸镁干燥，抽滤，浓缩，得白色固体，固体用丙酮/石 油醚重结晶，冷藏，抽滤，干燥，得白色固体，收率为91.1%。 1H-Nmrgoomhz,dmso): δ =7. 64(d, J = 6. 6Hz, 2H), 7. 32-7. 24(m, 4H), 7. 19(t, J = 4. 9Hz, 2H), 5. 53 (s, 2H)； ESI-MS: ([M+H]+) :261. 6〇
[0038] (2)中间体2的制备：
[0039] 将中间体I (0. 5g，I. 9mmol)与无色油状物4-氨基-I-乙氧甲酰基哌啶 (0. 495g，2. 8mmol)加入至微波管中，搅拌均匀，微波180°C反应lmin，冷却至室温，呈 红棕色固体，用甲醇15mL与二氯甲烷5mL溶解后拌样，过柱纯化，得白色固体，收率为 34.0 %。1H-Nmr(SooMHz1