专利名称：降解苯胺菌株5-1#的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种降解苯胺微生物的应用。
背景技术：
芳香族有机化合物对地表水和地下水的污染已成为人类面临的最大的环境问题之一。苯胺是最简单的一级芳香胺，也是最典型的芳香族化合物。在橡胶、除草剂、染料， 医药、有机树脂、油漆、香水、制革、石油加工、塑料等化工行业广泛被采用的原材料，是一种 “三致”物质，1989年已被中国列为“环境优先控制污染物”物质之一。随着工业化程度的加剧，全球对苯胺的需求也在不断上升，据资料显示，2003年全球苯胺的消费量约为2900kt， 全世界以各种形式排入环境中的废弃苯胺约为30kt。而苯胺废水的生物方法以其运行成本低利于管理而广泛推行。
发明内容
本发明的目的在于提供一株可处理含高浓度苯胺废水的降解苯胺菌株5_1#的应用。本发明所提供的降解苯胺菌株5_1#，为脑膜脓毒性伊丽莎白菌 5-1# (Elizabethkingia meningos印tica) CCTCC NO :M2010287，已于 2010 年 11 月 1 日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏号CCTCC NO :M2010287o降解苯胺菌株5_1#的应用，其特征在于所述菌株的应用为脑膜脓毒性伊丽莎白菌5-1#(Elizabethkingia meningos印tica)CCTCC NO :M201(^87应用于含高浓度苯胺废水的处理中。所述的脑膜脓毒性伊丽莎白菌5-1#(Elizabethkingia meningos印tica)CCTCC NO :M2010287应用于含高浓度苯胺废水的处理方法为挑取固体培养基上脑膜脓毒性伊丽莎白菌(Elizabethkingia meningos 印 tica) 5_1#CCTCC NO :M201(^87 的单菌落接种于 20ml生长培养基中，25 35°C、pH为6. 5 7. 5的条件下摇床振荡3 4天，待特征菌生长稳定后，得到菌浊液；按菌浊液含高浓度苯胺废水的体积比=1 (80 120)，取菌浊液接种于含高浓度苯胺废水中，25 35°C恒温培养，pH值为6. 5 7. 5，反应60-72小时。固体培养基牛肉膏0. 3g、蛋白胨1. 0g、氯化钠0. 5g、琼脂2g、自来水100mL、 ρΗ7· 0-7. 2。生长培养基磷酸氢二钾5. 17g/L，磷酸二氢钾1. 70g/L,硫酸铵2. 63g/L，pH值 7. 0 7. 2，Fe2+、Mg2+、Mn2+、Ca2+ 痕量，苯胺 2000mg/L。所述含高浓度苯胺废水是指含苯胺的浓度为1800_2200mg/L的废水。本发明是从城市污水处理系统脱水活性污泥中驯化、分离、筛选得到的一株在高浓度的苯胺废水中具有一定的生长能力的新菌株。并对其降解苯胺的能力及影响其活性的因素做了研究，结果表明，该菌株在高浓度的苯胺废水中，可利用苯胺作为唯一的碳源、氮源、能源，以1800-2200mg/L的苯胺溶液为例，该菌在7 内将其降解85%以上，该菌株可处理含高浓度苯胺废水。本发明获得的新菌株即可在高浓度的含苯胺废液中生存，也可将苯胺作为唯一的碳氮能源加以降解利用。
图1是降解苯胺菌株5_1#的PCR产物琼脂糖电泳图；图2是降解苯胺菌株5_1#在苯胺初始浓度不同条件下，对苯胺的降解效率图；图3是降解苯胺菌株5_1#在培养液PH值不同条件下，对苯胺的降解效率图；图4是降解苯胺菌株5_1#在培养温度不同条件下，对苯胺的降解效率图；图5是降解苯胺菌株5_1#在不同氮源供给条件下，对苯胺的降解能力特征图。具体方法如下一、降解苯胺菌株5_1#(苯胺降解特征菌)的筛选方法(1)培养基1)固体培养基牛肉膏0. 3g、蛋白胨1. 0g、氯化钠0. 5g、琼脂2g、自来水100mL、 ρΗ7· 0-7. 2。2)普通营养培养基胰化蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCllOg、自来水1000mL、 ρΗ7· 0-7. 2。3)驯化培养基牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，苯胺浓度逐渐增加至 2. 5g/L，营养成分逐渐减少，pH值7. 0。4)分离培养基牛肉膏2g/L，蛋白胨4g/L，氯化钠2g/L，苯胺lg/L，pH值7.0，苯胺 1.5g/L，琼脂 15 20g/L。5)筛选培养基磷酸氢二钾5. 17g/L，磷酸二氢钾1. 70g/L,硫酸铵2. 63g/L，pH值 7. 0 7. 2，Fe2+、Mg2+、Mn2+、Ca2+ 痕量，苯胺一定浓度(1800_2200mg/L)。6)生长培养基磷酸氢二钾5. 17g/L，磷酸二氢钾1. 70g/L,硫酸铵2. 63g/L，pH值 7. 0 7. 2，Fe2+、Mg2+、Mn2+、Ca2+ 痕量，苯胺 2000mg/L。
7)无机盐溶液磷酸氢二钾5. 17g/L，磷酸二氢钾1. 70g/L,硫酸铵2. 63g/L，pH值 7. 0 7. 2，Fe2+、Mg2+、Mn2+、Ca2+ 痕量。8)苯胺无机盐溶液磷酸氢二钾5. 17g/L，磷酸二氢钾1. 70g/L,硫酸铵2. 63g/L， pH 值 7. 0 7. 2，Fe2+、Mg2+、Mn2+、Ca2+ 痕量，苯胺 250_6000mg/L。以上培养基分别于121°C高压灭菌30min后备用，需添加苯胺的，将高浓度的苯胺母液(约10g/L)用无菌0. 45um滤膜过滤除菌后，按比例与已灭好菌的液体培养基混合。(2)实验仪器和设备台式高速离心机(安亭科学仪器厂TGL-16G)、紫外可见分光光度计(北京普析通用T6新世纪)、手提式蒸汽消毒器(上海三申、光照培养箱(重庆华茂仪器有限公司SHH150G)、光学显微镜(奥林巴斯ΒΧ40型)、超净工作台(苏州净化设备有限公司 SW-CJ-10)、菌落计数器(上海宏汇电器厂QL-901)、台式恒温摇床(太仓市华美生化仪器厂 TH2-C)、电泳仪及电泳槽等。(3)菌株的分离与筛选1)活化菌种来源于污水处理厂浓缩污泥样品，取污泥样品按水泥比100 1分散于水体中，在30°C，150r/min的条件下培养12小时后备用；2)驯化取活化菌浊液Iml接种于普通营养培养基中，梯度加入苯胺溶液，每 24小时取Iml菌液接种于驯化培养基中(苯胺溶液浓度梯度增加至约3g/L，苯胺浓度 1500mg/L后培养时间增至2天或以上)，备用；驯化培养基牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，苯胺浓度逐渐增加至2. 5g/L，营养成分逐渐减少，pH值7. 0 ；3)筛选取驯化后的菌浊液，无菌梯度稀释至约2.0X106个/L涂布于分离培养基上，30°C下恒温培养至菌落成熟，挑取菌落特征明显的单菌落划线与分离培养基上；4)纯化待分离培养基上的单菌落成熟后，挑取单菌落至生长培养基中培养3天； 取步骤1)中菌液接种于2000mg/L的生长培养基中，两天后划线于1000mg/L的分离培养基上，待菌落长出后，挑取单菌落划线于新的平板上，如此反复2-3次后，分离得纯种菌，即一株降解苯胺菌株5_1#。二、降解苯胺菌株5_1#的鉴定1.对降解苯胺菌株5_1#的鉴定对苯胺高效降解菌株5_1#进行了生理生化的鉴定以及16S rDNA分子的鉴定，从分子水平确定菌株的种属。16S rDNA序列分析主要按照以下步骤①细菌核DNA的提取1)用高压灭菌的牙签挑单菌落接种于普通营养培养基内培养过夜，取1. 5ml菌液于Eppendorf管内，8000rpm室温离心5min，彻底除去上清；2)加STE缓冲液1. 5ml洗涤一次，离心弃上清，再加入0. 567mlTE (lOmmol/ LTris-HCl，lmmol/LEDTA, pH8. 0)溶液，重悬细菌；3)加 IOwt% SDS30ul 和 20mg/ml 的的蛋白酶 K3ul，于 37°C水浴 Ih ；4)加入 5mol/L 氯化钠溶液 IOul，CTAB/NaCl 80ul，于 65°C育温 IOmin ；5)加入等积体酚氯仿/异戊醇(24 1)混勻，4°C、12000g/min离心5min,将上清液转入另一支Eppendorf管中；6)加入等体积的酚氯仿/异戊醇/(25 24 1)混勻，4°C、12000g/min离心 5min，提取上清液置于另一只管中，如此反复三次，直至看不到蛋白层为止；7)加入0. 6倍体积的异丙醇，轻柔混合，沉淀DNA，4°C、12000g/min离心5min，弃
上清液；8)用70wt%的乙醇洗涤lmin，离心，弃上清，自然凉干，并将DNA溶于100 μ 1 1/10的TE溶液中；9)加入终浓度为 50 μ g/ml 的 RNase，37°C，30min,去除 RNA，_20°C保存备用。②16SrDNA基因的PCR扩增为了进一步确定筛选得到的细菌5_1#的种属，对其进行质粒DNA的提取，采用的引物序列为Pl正向引物(5 ‘ -AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3 ‘)和P2反向引物 (5 ‘ -TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3 ‘ )，PCR产物测序由上海某生物技术有限公司完成，同源性检索利用NCBI数据库，经比对相似序列，分析该菌与已知菌种同源性的高低，并作菌株的系统发育树对照，结合生理生化鉴定结果，进而判断两菌种的菌属。2、16S rDNA 序列测定
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本发明采用对16S rDNA序列测定和分析的方法对细菌进行分子水平的鉴定。以细菌的核DNA为模板，以16S rDNA基因的PCR扩增的通用引物为引物，进行PCR扩增，得到长度为1385bp的扩增带(用琼脂糖凝胶电泳检测)，如图1所示。PCR产物经纯化后，
测定其全序列如下。
gctaccatgcaagccgagcggtagattactttcgggtattggaaaggggcgtaggggggc60
gaaccacgtgggcacccggcctttatcggggggttaccctttcgaagggagaataattac120
ccattattattttattcggcttcgggggattttgaaaactacgggggataaaaaggggcc180
cccccaaaattacttagtgggggaggtaccggccccccagggcaacaatctttagggggc240
ttgaaggggtgttcccccccctgggtccggaaacccgaaccaaatccctacggaaggcac300
catggagaaatatggaacaaggggggaaacccggacccggccttcccgcgggcagaaaaa360
CggCCCtttggttggaaaccggtttttatcggggaataaccctccttccttgtaattact420
taagggtcccgaaaaaatagcccccggttaattcctggccgccgcccccggaattccgaa480
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aggggtgaattccaccgcttaactggtcaacttgcaattgttcttgtaatcctgaagaag600
ggtgaaggggccggaaataggagtggtgggggtaaattgcttaaatttaatttaaacccc660
aatttgcgaaggcgggcaattaagtctaaatgacgctgaggaccaaagcgggggaagcaa720
acaggataggatccccggtagtcccgccgtaaacgatgattactcgtttttggtttaatg780
atcaaagactagccaaagtgataagtaatccacctgggggagtacgttccgcaggatgaa840
actcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgatgat900
acgcgaggaaccttgccaagacttaaatgggaattgacagacgcagaaatgtgtttttct960
tcggacaattttcaaggtgctgcatggttgtcgtcagctcgtgccgtgaggtgttaggtt1020
aagtcctgcaacgagcgcaacccctgtcactagttgctaacattaagttgaggactctag1080
tgagactgcctacgcaagtagagaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcacggccctt1140
acgtcttgggccacacacgtgctacaatggccggtacagagggcagctacctagtgatag1200
gatgcaaatctcgaaagccggtctcagttcggattggagtctgcaactcgactctatgaa1260
gctggaatcgctagtaatcgcgcatcagccatggcgcggtgaatacgttcCCgggCCttg1320
tacacaccgcccgtcaagccatggaagctgggggtacctgaagtcggtgaccgtaaaagg1380
agctg1385三、降解苯胺菌株5-1#的菌落形态、生理和生化特征见下表1所示。
表1，降解苯胺菌株5-1#的菌落形态特征以及主要的生理特征
权利要求
1.降解苯胺菌株5-1#的应用，其特征在于所述菌株的应用为脑膜脓毒性伊丽莎白菌 5-1#(Elizabethkingia meningoseptica)CCTCC NO :M201(^87应用于含高浓度苯胺废水的处理中。
2.根据权利要求1所述的降解苯胺菌株5-1#的应用，其特征在于所述的脑膜脓毒性伊丽莎白菌 5-1#(Elizabethkingia meningoseptica)CCTCC NO :M201(^87 应用于含高浓度苯胺废水的处理方法为挑取固体培养基上脑膜脓毒性伊丽莎白菌(Elizabethkingia meningoseptica) 5_1#CCTCC NO :M2010287 的单菌落接种于 20ml 生长培养基中，25 !35°C、 pH为6. 5 7. 5的条件下摇床振荡3 4天，待特征菌生长稳定后，得到菌浊液；按菌浊液含高浓度苯胺废水的体积比=1 (80 120)，取菌浊液接种于含高浓度苯胺废水中， 25 35°C恒温培养，pH值为6. 5 7. 5，反应60-72小时。
3.根据权利要求2所述的降解苯胺菌株5-1#的应用，其特征在于固体培养基牛肉膏0. 3g、蛋白胨1. 0g、氯化钠0. 5g、琼脂2g、自来水100mL、pH7. 0-7. 2。
4.根据权利要求2所述的降解苯胺菌株5-1#的应用，其特征在于生长培养基磷酸氢二钾 5. 17g/L，磷酸二氢钾 1. 70g/L，硫酸铵 2. 63g/L，pH 值 7. 0 7. 2，Fe2+、Mg2+、Mn2+、 Ca2+ 痕量，苯胺 2000mg/L。
5.根据权利要求1或2所述的降解苯胺菌株5-1#的应用，其特征在于所述含高浓度苯胺废水是指含苯胺的浓度为1800-2200mg/L的废水。
全文摘要
本发明涉及一种降解苯胺微生物的应用。降解苯胺菌株5-1#的应用，其特征在于所述菌株的应用为脑膜脓毒性伊丽莎白菌5-1#(Elizabethkingia meningoseptica)CCTCC NOM2010287应用于含高浓度苯胺废水的处理中。该处理方法为挑取固体培养基上脑膜脓毒性伊丽莎白菌(Elizabethkingia meningoseptica)5-1# CCTCC NOM2010287的单菌落接种于20ml生长培养基中，25～35℃、pH为6.5～7.5的条件下摇床振荡3～4天，待特征菌生长稳定后，得到菌浊液；按菌浊液∶含高浓度苯胺废水的体积比＝1∶(80～120)，取菌浊液接种于含高浓度苯胺废水中，25～35℃恒温培养，pH值为6.5～7.5，反应60-72小时。该菌在72h内将其降解85％以上，该菌株可处理含高浓度苯胺废水。
文档编号C02F3/34GK102168037SQ201010570849
公开日2011年8月31日 申请日期2010年12月3日 优先权日2010年12月3日
发明者孙红丽, 廉晶晶, 梁杏, 罗泽娇, 靳孟贵 申请人:中国地质大学(武汉)