专利名称：石油降解菌固定化方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物固定领域，具体地，涉及一种石油降解菌固定化方法及其应用。
背景技术：
随着工业的不断发展，全球多数地表水和地下水都受到不同程度的污染，严重威胁人们的身体健康。据估计全世界每年约有10亿吨石油及其产品通过各种途径进入地下水、地表水及土壤中。石油中的难降解化学物质(如苯、甲苯、酚类等)可以通过食物链进入人体，引起急慢性中毒，损伤神经系统。石油中的多环芳烃类物质会影响皮肤、肝、肾等组织器官的正常功能，甚至会引发皮肤癌。关于水体中石油污染物的去除，目前使用较多的是采用人工湿地对受污染水体进行生物净化的方法。生物净化法是利用天然水中的微生物和植物，采用人工措施来创造更有利的生长繁殖的环境，从而可提高对污染水体有机物的降解效率，将废水中的有机物质转化为较稳定的或者矿质形态物质的过程。在自然条件下的净污能力十分有限，尤其是针对特殊污染物的降解，必须采取有效措施提高生物降解能力。微生物固定化技术是通过采用化学或物理的方法将游离微生物固定于限定空间区域内，保留其固有活性，且能够被重复和连续使用的现代生物工程工艺。由于微生物固定化技术具有处理效率高、运行稳定、可纯化和保持高效优势菌种、反应器生物量大、固液分离效果好以及运营成本低的优点，目前该技术在处理氮、氨等富含营养物质的生活和生产废水中应用广泛，但在涉及微生物降解水体中石油污染物的实际应用极少。专利 CN101768583A报道了一种以芦苇秸秆为载体的石油降解菌固定化方法，效果也并不好，20 天后对石油污染水的净化效果仅为71%，而且芦苇秸秆的使用寿命有限，不利于大规模产业化、商品化。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供了一种石油降解菌固定化方法，该方法具有成本低、利于大规模应用及净化效率高的优点。为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案 一种石油降解菌固定化方法，包括以下步骤
(1)石油降解菌的驯化、分离及纯化；
(2)石油降解菌在聚乙烯泡沫上的固定化。具体地，步骤(1)所述石油降解菌的驯化包括以下过程吸取石油污染的水加入液体富集培养基中，在25-35°C、80-120r/min的条件下于振荡摇床上培养7 10天，待培养液混浊后，吸取相同体积的培养液注入新的液体富集培养基中；重复上述操作至少五次。具体地，所述液体富集培养基包含以下重量分数的组分0.2-0.3% (NH4)2SO4, 0. 03-0. 05%酵母浸膏、1- 石油污染物及0. 1-0. 2%Na2HP04 ；所述液体富集培养基以石油污染物为唯一碳源，其PH为6. 8-7. 2，灭菌使用。
具体地，步骤(1)所述石油降解菌的分离及纯化包括以下过程取驯化后的液体富集培养基中单菌落稀释分离，涂布在固体营养琼脂培养基中，在30-35°C进行恒温培养 30-50小时，得到分离、纯化的石油降解菌株；将纯化菌株接入固体营养琼脂培养基试管斜面，30-35°C恒温培养M-48小时，待菌生长丰满后，放入4°C冰箱保存备用。具体地，所述固体营养琼脂培养基包含以下重量分数的组分8-10%蛋白胨，2-3% 牛肉浸膏，5_6%NaCl，1. 7- 琼脂；所述固体营养琼脂培养基的pH为7. 0，灭菌使用。具体地，步骤(2)所述石油降解菌在聚乙烯泡沫上的固定化包括以下过程将步骤(1)得到的石油降解菌接种于液体营养培养基中，在25-35°C、80-100r/min条件下培养 2-3天至培养基中石油降解菌的数量为IO8个/mL以上时，与灭菌后的聚乙烯醇泡沫充分混勻，继续振荡培养2-3天。具体地，所述液体营养培养基包含以下重量分数的组分8-10%蛋白胨、2-3%牛肉浸膏及 5-6%NaCl，pH 为 7. 0。具体地，所述聚乙烯醇泡沫是体积为Icm3的聚乙烯醇正方体泡沫。本发明提出的石油降解菌固定化方法在净化被石油污染的水体中的应用。在应用中，首先在污水中添加矿物盐(即尿素和磷酸铵)，使污水中的C:N: P=IOO 10 1 (质量比)，同时把pH调为6. 5-7. 5，将固定于聚乙烯泡沫的石油降解菌放入柱形反应容器中形成固定床，该反应器主要包括一个水和矿物盐存储罐，一个石油污染物存储罐，一个充填了泡沫的柱状反应罐(固定床)，一个压缩空气泵，以及一个吸附挥发有机气体的活性炭小瓶。这样就可以通过一个来回活动的泵将石油污染物不断地注入水中，经由内置的搅拌系统将水与污染物充分混合，使污染液从反应罐的顶部流入，反应后液体从底部流出，被污染的水流过泡沫流动床，首先被其中的充填物吸收，然后被固定在填充物里面的微生物菌丛降解。压缩空气泵提供的空气逆流，给这些微生物的混合物带来氧气，在反应器的下游，安装有一个活性炭瓶，已经转化成气体的污染物在通过时可以被活性炭吸附。这种稳定、连续的处理方式能尽量降低将填充物内的淤积现象。污水在该柱形容器中的滞停时间根据污染物的种类和浓度设定为0. 5-2小时。本发明所提出的石油降解菌固定化方法具有以下有益效果
(1)使用固定化材料为聚乙烯醇泡沫，对微生物的固定作用效果好、寿命长、成本低，有利于商品化、产业化。(2)通过稳定、连续的处理方式，污染物首先被填充物吸收，然后被固定在填充物里面的微生物降解。这种方式的优势在于，能够保证固定物内部更好的物质转换，解决了目前石油生物降解中效率低下的技术问题。(3)经实地工程运作实践检验，使用固定床的设备和工艺操作方便、无需加热能耗小、固液分离效果好、运营维护成本低。具体的有益效果将体现在随后的实施例中。
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中
图1是本发明的应用的流程示意图。
具体实施例方式以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。固定化实施例 实施例1
(1)石油降解菌的驯化、分离及纯化
驯化吸取ImL石油污染的水加入液体富集培养基中，在30°c、100r/min的条件下于振荡摇床上培养8天；待培养液混浊后，吸取ImL培养液注入新的液体富集培养基中，重复上述操作五次完成石油降解菌的驯化；
其中，所述液体富集培养基包含以下重量分数的组分0. 2% (NH4)2SO4，0. 04%酵母浸膏，2%石油污染物，0. l%Na2HP04,调pH至7. 0，分装在250mL锥形三角摇瓶，每瓶装液量为 IOOmL,灭菌后冷却至室温。分离及纯化取驯化后的液体富集培养基中单菌落稀释分离，涂布在固体营养琼脂培养基中，在30°C进行恒温培养48小时，得到分离、纯化的石油降解菌株；将纯化菌株接入固体营养琼脂培养基试管斜面，3(TC恒温培养M小时，待菌生长丰满后，放入4°C冰箱保存备用。其中，固体营养琼脂培养基包含以下重量分数的组分8%蛋白胨二％牛肉浸膏， 5%NaCl，1. 8% 琼脂，pH=7. 0，灭菌使用。(2)石油降解菌在聚乙烯泡沫上的固定化
将步骤(1)得到的石油降解菌接种于液体营养培养基中，在25°C、80r/min条件下培养 3天至培养基中石油降解菌的数量为8 X IO8个/mL，与灭菌后的聚乙烯醇泡沫充分混勻，继续振荡培养2天，通过有机氮分析显示有大量细菌被固定于泡沫中。实施例2
(1)石油降解菌的驯化、分离及纯化
驯化吸取ImL石油污染的水加入液体富集培养基中，在25°C、80r/min的条件下于振荡摇床上培养10天；待培养液混浊后，吸取ImL培养液注入新的液体富集培养基中，重复上述操作七次完成石油降解菌的驯化；
其中，所述液体富集培养基包含以下重量分数的组分0. 3% (NH4)2SO4，0. 05%酵母浸膏，1%石油污染物，0. 2%Na2HP04,调pH至6. 8，分装在250mL锥形三角摇瓶，每瓶装液量为 IOOmL,灭菌后冷却至室温。分离及纯化取驯化后的液体富集培养基中单菌落稀释分离，涂布在固体营养琼脂培养基中，在35°C进行恒温培养30小时，得到分离、纯化的石油降解菌株；将纯化菌株接入固体营养琼脂培养基试管斜面，30°C恒温培养48小时，待菌生长丰满后，放入4°C冰箱保存备用。其中，固体营养琼脂培养基包含以下重量分数的组分10%蛋白胨，3%牛肉浸膏， 6%NaCl，1. 7% 琼脂，pH=7. 0，灭菌使用。(2)石油降解菌在聚乙烯泡沫上的固定化
将步骤(1)得到的石油降解菌接种于液体营养培养基中，在25°C、80r/min条件下培养 3天至培养基中石油降解菌的数量为2X IO8个/mL，与灭菌后的体积为Icm3的聚乙烯醇正方体泡沫充分混勻，继续振荡培养3天，通过有机氮分析显示有大量细菌被固定于泡沫中。 其中，液体营养培养基包含以下重量分数的组分8%蛋白胨、2%牛肉浸膏及5%NaCl，pH为 7. 0。实施例3
(1)石油降解菌的驯化、分离及纯化
驯化吸取ImL石油污染的水加入液体富集培养基中，在30°C、120r/min的条件下于振荡摇床上培养7天；待培养液混浊后，吸取ImL培养液注入新的液体富集培养基中，重复上述操作六次完成石油降解菌的驯化；
其中，所述液体富集培养基包含以下重量分数的组分0. 3% (NH4)2SO4，0. 03%酵母浸膏，2%石油污染物，0. l%Na2HP04,调pH至7. 2，分装在250mL锥形三角摇瓶，每瓶装液量为 IOOmL,灭菌后冷却至室温。分离及纯化取驯化后的液体富集培养基中单菌落稀释分离，涂布在固体营养琼脂培养基中，在32°C进行恒温培养40小时，得到分离、纯化的石油降解菌株；将纯化菌株接入固体营养琼脂培养基试管斜面，35°C恒温培养32小时，待菌生长丰满后，放入4°C冰箱保存备用。所用固体营养琼脂培养基成分与实施例2相同。(2)石油降解菌在聚乙烯泡沫上的固定化
将步骤(1)得到的石油降解菌接种于液体营养培养基中，在30°C、90r/min条件下培养 3天至培养基中石油降解菌的数量为6X IO8个/mL，与灭菌后的体积为Icm3的聚乙烯醇正方体泡沫充分混勻，继续振荡培养3天，通过有机氮分析显示有大量细菌被固定于泡沫中。 其中，液体营养培养基成分与实施例2相同。应用实施例实施例4
石油降解菌由实施例1固定化；
污水水与汽油充分混合配制成污水，其中，污水中石油烃含量为50000ppb，苯含量为 IOOppb,甲苯含量为lOOOppb，乙苯含量为500ppb，二甲苯含量为400ppb。在污水中添加尿素和磷酸铵，使使污水中的C =N =P (质量比)为100 10 :1，同时把 pH调为7. 0。如图1所示，图1为本发明应用的流程示意图，将固定于大量聚乙烯泡沫的石油降解菌放入柱形反应容器中形成固定床，压缩空气泵将污水以及水和矿物盐抽入并进行充分混合，混合后的污染液从固定床的顶部流入，被其中的充填物吸收，然后被固定在填充物里面的微生物菌丛降解，反应后液体从底部流出，首先被其中的充填物吸收，然后被固定在填充物里面的微生物菌丛降解。在固定床的下端，压缩空气泵提供的空气逆流给微生物提供氧气，在固定床的下游顶端，安装有一个活性炭瓶，已经转化成气体的污染物在通过时可以被活性炭吸附。污水在10升的柱形容器中的滞停时间设定为0. 5小时，控制该过程中的温度在M°C，压缩空气泵提供的空气的通气量0. 12VVM。对处理前和处理后水中的石油烃和BETX (苯、甲苯、乙苯、二甲苯)定期(每周两次) 进行分析发现，石油烃去除率达92%，BETX去除率达96%。在连续系统中进行5周试验，处理结果相当稳定。
实施例5
与实施例4不同的是
石油降解菌由实施例2固定化；
控制该过程中的温度在12°C，通气量0. 15VVM。对处理前和处理后水中的石油烃和BETX (苯、甲苯、乙苯、二甲苯)都定期(每周两次)进行分析。石油烃去除率达89%，BETX去除率达84%。在连续系统中进行了 5周试验， 在整个运行过程中，处理结果相当稳定。实施例6
与实施例4不同的是 石油降解菌由实施例3固定化；
污水在10升的柱形容器中的滞停时间设定为1小时，通气量0. 13VVM。对处理前和处理后水中的石油烃和BETX (苯、甲苯、乙苯、二甲苯)都定期(每周两次)进行分析。处理结果为石油烃去除率达98%，BETX去除率达98%。对该结果作了进一步物质平衡的分析对于石油烃，生物降解占92. 6%，出水残留占1. 7%，基质吸附占5. 7% ；对于 BETX 生物降解占78. 1%，挥发占20. 3%，出水残留占1. 5%，基质吸附0. 8%。在连续系统中进行了 5周试验，在整个运行过程中，处理结果相当稳定。实施例7 实地检测
石油降解菌由实施例2固定化；
污水取自汽油、柴油存储地的地下水，石油烃浓度为7000 ppb, BETX浓度为50ppb。在污水中添加尿素和磷酸铵，使使污水中的C =N =P=IOO :10 :1，同时把pH调为7， 污水在500升柱形容器中的滞停时间设定为2小时，该过程中的温度在25°C之间，通气量 35L / ho对处理前和处理后水中的石油烃和BETX (苯、甲苯、乙苯、二甲苯)实时进行分析。处理结果为石油烃去除率为92%，主要为生物降解，BETX去除率为96%，其中挥发占1%，生物降解占76%，吸附占m。该项目共处理370吨污水，时间为10周，在整个运行过程中，处理结果相当稳定。最后应说明的是以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明， 尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。 凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种石油降解菌固定化方法，其特征在于，包括以下步骤(1)石油降解菌的驯化、分离及纯化；(2)石油降解菌在聚乙烯泡沫上的固定化。
2.根据权利要求1所述的石油降解菌固定化方法，其特征在于，步骤(1)所述石油降解菌的驯化包括以下过程吸取石油污染的水加入液体富集培养基中，在25-35°C、80-120r/ min的条件下于振荡摇床上培养7 10天，待培养液混浊后，吸取相同体积的培养液注入新的液体富集培养基中；重复上述操作至少五次。
3.根据权利要求2所述的石油降解菌固定化方法，其特征在于，所述液体富集培养基包含以下重量分数的组分0. 2-0. 3% (NH4)2SO4^O. 03-0. 05%酵母浸膏、1- 石油污染物及 0. 1-0. 2%Na2HP04 ；所述液体富集培养基以石油污染物为唯一碳源，其pH为6. 8-7. 2，灭菌使用。
4.根据权利要求1所述的石油降解菌固定化方法，其特征在于，步骤(1)所述石油降解菌的分离及纯化包括以下过程取驯化后的液体富集培养基中单菌落稀释分离，涂布在固体营养琼脂培养基中，在30-35°C进行恒温培养30-50小时，得到分离、纯化的石油降解菌株；将纯化菌株接入固体营养琼脂培养基试管斜面，30-35°C恒温培养M-48小时，待菌生长丰满后，放入4°C冰箱保存备用。
5.根据权利要求4所述的石油降解菌固定化方法，其特征在于，所述固体营养琼脂培养基包含以下重量分数的组分8-10%蛋白胨，2-3%牛肉浸膏，5-6%NaCl，l. 7- 琼脂；所述固体营养琼脂培养基的PH为7. 0，灭菌使用。
6.根据权利要求1所述的石油降解菌固定化方法，其特征在于，步骤(2)所述石油降解菌在聚乙烯泡沫上的固定化包括以下过程将步骤(1)得到的石油降解菌接种于液体营养培养基中，在25-35°C、80-100r/min条件下培养2_3天至培养基中石油降解菌的数量为IO8 个/mL以上时，与灭菌后的聚乙烯醇泡沫充分混勻，继续振荡培养2-3天。
7.根据权利要求6所述的石油降解菌固定化方法，其特征在于，所述液体营养培养基包含以下重量分数的组分8-10%蛋白胨、2-3%牛肉浸膏及5-6%NaCl，pH为7. 0。
8.根据权利要求6所述的石油降解菌固定化方法，其特征在于，所述聚乙烯醇泡沫是体积为Icm3的聚乙烯醇正方体泡沫。
9.权利要求1-8任意一项所述石油降解菌固定化方法在净化被石油污染的水体中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种石油降解菌固定化方法，属于微生物固定领域，具体地，包括石油降解菌的驯化、分离及纯化以及石油降解菌在聚乙烯泡沫上的固定化。同时，本发明公开了其在净化被石油污染的水体中的应用。本发明所提出的石油降解菌固定化方法及其应用具有成本低、利于大规模应用及净化效率高的优点。
文档编号C02F3/34GK102433318SQ201210006059
公开日2012年5月2日 申请日期2012年1月10日 优先权日2012年1月10日
发明者李建洲, 雷继雨 申请人:江苏麦可博生物环保工程技术有限公司