生物炭固定化复合污染降解菌颗粒制备及用途、使用方法
【专利摘要】本发明公开一种生物炭固定化复合污染降解菌颗粒制备及用途、使用方法；所述制备方法包括：将风干、粉碎的农林废弃物及动物粪便热裂解，研磨过筛，得生物炭；将复合污染降解菌的菌种接入液体培养基中进行培养，待菌种生长到对数生长期后，离心富集降解菌，得复合污染降解菌菌体；将复合污染降解菌菌体加入生物炭，得吸附有复合污染降解菌的生物炭；将吸附有复合污染降解菌的生物炭加至载体溶胶中得复合溶胶；将复合溶胶滴至交联液，低温交联固定，干燥即得。本发明生物炭固定化复合污染降解菌具有良好的生物活性和化学稳定性，可有效去除复合污染土壤中多环芳烃、加速土壤功能微生物恢复，成本低，制备工艺简单，对污染土壤修复效果明显。
【专利说明】生物炭固定化复合污染降解菌颗粒制备及用途、使用方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物炭固定化微生物修复污染领域，具体涉及生物炭固定化复合污染 降解菌颗粒制备及用途、使用方法。
【背景技术】
[0002] 多环芳径（Polycyclic Aromatic Hydrocarbons, PAHs)是土壤中典型的持久性 有机污染物之一，具有强烈的"三致"效应，严重威胁着土壤的生态安全和人类健康，因此， 修复土壤PAHs污染已成为国内外共同关注的热点问题。微生物修复作为一种经济有效的 去除有机污染的手段，已经成为目前最具潜力的治理方法，尤其固定化微生物技术为土壤 PAHs污染修复提供了新的途径。然而，目前土壤微生物修复技术尚存在单位体积内有效降 解菌浓度低、反应速度慢、作用不持久、对环境条件敏感，在土壤中与土著微生物竟争不能 形成优势菌群、适应能力差等缺点；另外，土壤环境中污染物的成分十分复杂，很少遇到单 一的PAHs污染，而PAH混合物中还可能发生相互作用及与重金属发生复合污染效应。尤 其是重金属可能通过对参与生物降解的酶或者参与一般代谢过程的酶的直接作用来抑制 PAHs的生物降解，这些因素限制了土壤微生物修复技术的实际应用。
[0003] 生物炭是一种利用生物质在一定温度下通过无氧或缺氧热解制备的含碳有机固 体物质，含有大量的C、N等营养元素，其表面所具有的微孔结构与极强的吸附力，为微生物 栖息与繁殖提供了良"避难"场所，使它们免受侵袭和失水干燥的影响，同时减少了微生物 之间的生存竞争，同时也为它们提供了不同的碳源、能量和矿物质营养，从而对土壤中微生 物的生长与繁殖会起到积极的促进作用。生物炭材料来源广泛，生产成本低，这些特性使生 物炭成为一种新型的微生物固定化载体。
[0004] 经文献检索，中国专利"一种利用生物炭修复多环芳烃污染土壤的方法"（公开专 利号：CN 101618394A)涉及使用一种利用畜禽便制备生物炭修复多环芳烃污染土壤的方 法，利用畜禽养殖业产生的有机废物为制备生物炭的材料，然后将生物炭直接投加到污染 土壤中。这些技术均利用了生物炭对污染物的吸附功能，事实上，生物炭对污染物的吸附本 质上是一种物理吸附，将生物炭用于土壤中不仅存在吸附饱和后的失效问题，而且，与常规 钝化剂一样，土壤中吸附了污染物的生物炭在环境条件改变时也存在重新释放成为土壤 "定时炸弹"的风险，因此，无法从根本上消除土壤污染。
【发明内容】
[0005] 针对现有技术中的缺陷，本发明的目的在于利用农林废弃物及动物粪便制备生物 炭固定化复合污染降解菌颗粒去除土壤多环芳烃，以提出一种生物炭固定化复合污染降解 菌颗粒制备及用途、使用方法。该方法克服了现有土壤多环芳烃生物修复技术存在的不足， 不仅节约了成本，而且具有高效、安全环保、适合规模化推广等特点。
[0006] 本发明是通过以下技术方案实现的：
[0007] 第一方面，本发明提供一种生物炭固定化复合污染降解菌颗粒的制备方法，所述 制备方法包括如下步骤：
[0008] 步骤一、将待固定化的复合污染降解菌的菌种接入液体培养基中进行微生物培 养，待菌种生长到对数生长期后，离心富集降解菌，得复合污染降解菌菌体；
[0009] 步骤二、将复合污染降解菌菌体加入生物炭，混合均匀，得吸附有复合污染降解菌 的生物炭；
[0010] 步骤三、将吸附有复合污染降解菌的生物炭加至载体溶胶中，混匀，得复合溶胶；
[0011] 步骤四、将复合溶胶滴至交联液中，低温条件下交联固定18?24h，洗涤，干燥，即 得生物炭固定化复合污染降解菌颗粒。
[0012] 优选地，步骤一中，所述复合污染降解菌为耐重金属的多环芳烃降解菌，包括阴 沟肠杆菌，中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCC NO:M 2012240(已在申请号为 201210385520. X的专利申请中公开），可在复杂污染环境下对多种多环芳烃进行降解。
[0013] 优选地，步骤二中，所述生物炭的制备包括：将风干、粉碎的农林废弃物及动物粪 便在300-70(TC高温条件下，热裂解1?5小时，冷却到室温，研磨过筛，得生物炭。
[0014] 优选地，所述农林废弃物包括稻壳等，动物粪便包括牛粪等。
[0015] 优选地，所述过筛采用80?100目筛。
[0016] 优选地，步骤二中，所述复合污染降解菌菌体与生物炭的重量比为1?10 :100。
[0017] 优选地，步骤三中，所述载体溶胶的组分及重量含量包括：聚乙烯醇（PVA)5? 15%、海藻酸钠（SA)O. 5?5%，余量为水。
[0018] 更优选地，所述聚乙烯醇（PVA)、海藻酸钠（SA)在应用前于20°C左搅拌使充分溶 胀，然后升温到95 °C，最后冷水中浸泡过夜。
[0019] 优选地，步骤四中，所述交联剂为含有20?60g/L CaCl2的硼酸饱和溶液，pH为 6?7〇
[0020] 优选地，步骤四中，所述低温包括4°C。
[0021] 优选地，步骤四中，所述洗涤包括用无菌生理盐水洗涤，如用0. 9 %的无菌生理盐 水洗涤3遍。
[0022] 优选地，步骤四中，所述生物炭固定化污染降解菌颗粒为球状，粒径2. 5?3. 5mm， 复合污染降解菌含量为1. 〇 X IO6个/g。
[0023] 本发明制备的生物炭固定化复合污染降解菌小球，适当干燥后可放入冰箱于4°C 下保存待用。
[0024] 第二方面，本发明提供一种生物炭固定化复合污染降解菌颗粒在原位修复多环芳 烃污染土壤中的用途。
[0025] 第三发面，本发明提供一种生物炭固定化复合污染降解菌颗粒在原位修复多环芳 烃污染土壤中的使用方法，所述使用方法包括：将生物炭固定化污染降解菌颗粒按照重量 比0. 5?10 :100的加至多环芳烃污染土壤中混合。
[0026] 与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果
[0027] (1)制备生物炭的原料来源广泛，可实现对废弃资源的再利用；
[0028] (2)本发明制备的生物炭固定化复合污染降解菌颗粒，由于生物炭对复合污染降 解菌的吸附及载体的保护，所以复合污染降解菌的寿命长度增加，更能适应自然环境，去除 多环芳烃的效果好，生物炭固定化复合污染降解菌颗粒的原位修复效果持续期相应的明显 增强，经实际应用得多环芳烃污染土壤中使用寿命可达三个月以上；
[0029] (3)本发明方法引入生物炭固定化复合污染降解菌颗粒，修复期长，效果好，成本 低，无毒，修复后亦可提高土壤微生物的活性，是一种环境效益和经济效益并举的环境修复 方法。
【专利附图】
【附图说明】
[0030] 通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、 目的和优点将会变得更明显：
[0031] 图1为是生物炭固定化复合污染降解菌颗粒制备及用途、使用方法示意图。
【具体实施方式】
[0032] 下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术 人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术 人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明 的保护范围。
[0033] 实施例1
[0034] 本实施实例生物炭固定化复合污染降解菌修复多环芳烃污染土壤方法的工艺流 程如图1所示，利用稻壳生物炭处理多环芳烃的污染土壤的具体步骤如下：
[0035] 生物炭的制备：温度在350°C条件下，采用稻壳烘干粉碎物在无氧条件下，利用炭 化炉热解4小时制备生物炭，研磨，过80目筛；
[0036] 降解微生物的选择：选择菌种为阴沟肠杆菌属菌株CCTCC NO:M 2012240,所用菌 株为购买得到的耐重金属的多环芳烃降解菌株，购自中国典型培养物保藏中心。
[0037] 生物炭固定化微生物制备：在200mL蒸馏水中加入20g PVA和2g SA浸泡过夜后在 室温下子动搅拌15分钟，通过水浴锅加热至95°C并保持在该温度下，连续以80?IOOrpm 速度搅拌约直至完全溶解。同时在锥形瓶中加入IOOmLLB培养基1 %接种菌株，150转/分 摇床培养过夜，5000r · HiirT1离心富集降解菌，称取热解温度为350°C的稻壳制生物炭倒入 锥形瓶与菌体混合，菌液与吸附载体材料的比例为5 % (W/W)，加入无菌水定容至20mL，静 置吸附2小时后，将生物炭吸附完全的菌液加入冷却至低于40°C的PVA，SA混合溶液，充分 混合，保持温度备用。配制交联剂溶液：在500mL蒸馏水添加硼酸溶解直至饱和，然后加入 20gCaCl 2，搅拌均匀，用lmol/L NaOH溶液调节pH至6. 7。将生物炭吸附菌液PVA及SA的 混合溶液用带有针头的注射器滴入交联剂溶液中，注意针头与交联液液面距离至少15cm， 以保证液滴在空中收缩成球状。于4°C下放置24h，取出后先用生理盐水洗3遍，置于滤纸 上干燥数分钟，保存在4°C冷藏室中备用。
[0038] 本实施实例的生物炭固定化微生物修复多环芳烃污染土壤方法，使用过程如下：
[0039] 1、取350°C制备的稻壳生物炭，生物炭固定化复合污染降解菌颗粒及降解菌，4% (w/w)分别加入500g取自焦化厂多环芳烃复合污染土壤。
[0040] 2、经GC-MS检测其多环芳烃初始浓度为浓度达到4. 91 ±0. 53mg/kg。
[0041] 3、将处理好的复合污染土壤样品充分混合密封后，置于25°C条件下，保持一定土 壤
[0042] 湿度。
[0043] 4、添加处理90天后，经GC-MS检测土壤中多环芳烃的去除率。
[0044]
【权利要求】
1. 一种生物炭固定化复合污染降解菌颗粒的制备方法，其特征在于，所述制备方法包 括如下步骤： 步骤一、将待固定化的复合污染降解菌的菌种接入液体培养基中进行微生物培养，待 菌种生长到对数生长期后，离心富集降解菌，得复合污染降解菌菌体； 步骤二、将复合污染降解菌菌体加入生物炭，混合均匀，得吸附有复合污染降解菌的生 物炭； 步骤三、将吸附有复合污染降解菌的生物炭加至载体溶胶中，混匀，得复合溶胶； 步骤四、将复合溶胶滴至交联液中，低温条件下交联固定18?24h，洗涤，干燥，即得生 物炭固定化复合污染降解菌颗粒。
2. 根据权利要求1所述的生物炭固定化复合污染降解菌颗粒的制备方法，其特 征在于，步骤一中，所述复合污染降解菌为耐重金属的多环芳烃降解菌阴沟肠杆菌 (Enterobacter cloacae)CCTCC N0:M 2012240〇
3. 根据权利要求1所述的生物炭固定化复合污染降解菌颗粒的制备方法，其特征在 于，步骤二中，所述复合污染降解菌菌体与生物炭的重量比为1?10 :1〇〇。
4. 根据权利要求1所述的生物炭固定化复合污染降解菌颗粒的制备方法，其特征在 于，步骤二中，所述生物炭的制备包括：将风干、粉碎的农林废弃物及动物粪便在300? 700°C高温条件下，热裂解1?5小时，冷却到室温，研磨过筛，得生物炭。
5. 根据权利要求1所述的生物炭固定化复合污染降解菌颗粒的制备方法，其特征在 于，步骤三中，所述载体溶胶的组分及重量含量包括：聚乙稀醇5?15%、海藻酸钠0. 5? 5%，余量为水。
6. 根据权利要求1所述的生物炭固定化复合污染降解菌颗粒的制备方法，其特征在 于，步骤四中，所述交联剂为含有20?60g/L CaCl2的硼酸饱和溶液，pH为6?7。
7. 根据权利要求1所述的生物炭固定化复合污染降解菌颗粒的制备方法，其特征在 于，步骤四中，所述低温包括4 °C。
8. 根据权利要求1所述的生物炭固定化复合污染降解菌颗粒的制备方法，其特征在 于，步骤四中，所述生物炭固定化复合污染降解菌颗粒为球状，粒径2. 5?3. 5mm，复合污染 降解菌含量为1.0X106个/g。
9. 一种根据权利要求1所述制备方法制备的生物炭固定化复合污染降解菌颗粒在原 位修复多环芳烃污染土壤中的用途。
10. -种根据权利要求1所述制备方法制备的生物炭固定化复合污染降解菌颗粒在原 位修复多环芳烃污染土壤中的使用方法，所述使用方法包括：将生物炭固定化污染降解菌 颗粒按照重量比0. 5?10 :100加至多环芳烃污染土壤中混合。
【文档编号】B09C1/10GK104475444SQ201410614051
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2014年11月4日 优先权日:2014年11月4日
【发明者】刘亮, 沈国清, 陈平, 付盼, 李蓝青 申请人:上海交通大学