专利名称：氯霉素分子印迹固相萃取小柱的制备方法
技术领域：
本发明涉及的是一种生物工程技术领域的方法，具体的说，是涉及动物源性食品和水产品中的氯霉素残留的高选择性分离、纯化、富集的氯霉素分子印迹固相萃取小柱的制备方法。
背景技术：
氯霉素(chloramphenicol，简称CAP)是1947年首次从委内瑞拉链丝菌(Streptomyces Venezuela)的培养液中分离得到的广谱抗生素，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌均有抑制作用。然而，由于其苯环上带硝基，其分解半衰期较长而且具有严重的毒副作用，对于氯霉素残留，存在多种检测方法，目前，发达国家对其检出限的要求越来越严格，欧盟由原来的10μg/kg降至0.1μg/kg，美国FDA规定的检出限也由原来的5μg/kg降为0.3μg/kg，且目前更为灵敏的方法，可使检出限达0.1μg/kg。因此，动物源性食品和水产品中的氯霉素残留已成为我国扩大农产品国际贸易的主要障碍。
目前，在氯霉素残留的检测中，样品的前处理过程是非常重要的，固相萃取技术是一种比液液萃取更好、更快速、更简便的分离技术，但是传统的固相萃取其目标物与吸附剂之间的作用力是非特异性的，限制了固相萃取技术的进一步发展，因此，新型高选择性识别能力填料基质的开发研制是非常重要的。而分子印迹聚合物具有与模板分子相匹配的结合位点与空穴，对模板分子具有专一的识别能力，同时具有抗恶劣环境能力、高稳定性和长的使用寿命等优点。
经对现有技术的文献检索发现，Mena等在《Anal Bioanal Chem》(生物分析化学)2003，376，18-25上发表的“Molecularly imprinted polymers foron-line clean-up and preconcentration of chloramphenicol prior to itsvoltammetric determination”(利用氯霉素分子印迹聚合物进行伏安法检测前的在线净化和前富集)中提出应用分子印记聚合物萃取小柱与伏安法相结合，可使氯霉素残留的富集因子达到500；具体采用本体聚合法制备的分子印迹聚合物装配萃取小柱，经上样、洗脱等步骤后，通过伏安法进行分析。其不足之处在于存在分子印迹聚合物颗粒大小不均一、颗粒形状不规则等缺点，对痕量氯霉素的富集效果较差。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种氯霉素分子印迹固相萃取小柱的制备方法，使其能够简单、快速、高效测定动物源性食品和水产品中氯霉素(CAP)残留量的选择性纯化和富集，可直接用于对氯霉素的特异选择性分离、高效富集。
本发明是通过以下技术方案实现的，本发明氯霉素分子印迹固相萃取小柱的制备，包括以下步骤(1)将模板分子氯霉素、功能单体甲基丙烯酸N，N-二乙基氨基乙酯(DAM)和交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)，按模板分子∶功能单体∶交联剂摩尔比＝1∶2～8∶25，通过悬浮聚合而成氯霉素分子印迹聚合物微球；(2)称量氯霉素分子印迹聚合物微球0.050～0.200g，填充于1ml-6ml聚丙烯固相萃取小柱内。填料的顶端和底端分别装上20μm孔径的聚乙烯筛板；采用甲醇∶异丙醇＝2∶1(v/v)作为装柱匀浆液体，抽真空状态下，将匀浆液装入聚丙烯固相萃取小柱，最后盖紧筛板。
所述的氯霉素分子印迹聚合物微球，其制备步骤如下1)将模板分子、功能单体和交联剂的摩尔比为1∶2～8∶25；稀释剂和交联剂的总体积与水的体积比为1∶6～14；将聚乙烯醇1788至于水中，80℃搅拌30min至其全部溶解；聚乙烯醇1788(PVA1788)的浓度为3～6％；将功能单体甲基丙烯酸N，N-二乙基氨基乙酯(DAM)和模板分子氯霉素溶解在稀释剂中，超声作用5～10min ；将交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)、引发剂(AIBN)和稀释剂混合，超声作用5～10min；将上述三种溶液混合，在60～75℃恒温350～450rpm恒速搅拌20～24h；2)反应结束后，将上述反应制备的分子印迹聚合物微球在80℃水中搅拌60min，然后降温过滤，过滤后用双蒸水洗涤3次，再用甲醇洗涤3次，丙酮洗涤2次，每次15min，最后通过索氏萃取进一步除去模板分子；3)将除去模板分子的聚合物真空干燥(50℃)，得到氯霉素分子印迹聚合物微球(平均孔径约为40～120μm)。
所述的稀释剂，为辛醇∶氯仿体积比＝5∶1的混合溶剂；所述的引发剂，为偶氮二异丁腈。
本发明上述方法制备的氯霉素分子印迹固相萃取小柱，应用于检测食品中氯霉素残留量的样品溶液的选择性纯化、富集，具体步骤如下(1)固相萃取小柱装填好后，首先用10ml丙酮、10ml甲醇冲洗；(2)加入样品溶液1ml；(3)用1ml 40％甲醇淋洗3次；(4)用0.5～1.5ml甲醇洗脱1次。
本发明制得的氯霉素分子印迹聚合物微球是一种具有固定孔穴大小、形状和有确定排列功能基团的高分子交联聚合物，对氯霉素分子的立体结构具有动态“记忆”功能。本发明采用其制备的氯霉素分子印迹固相萃取小柱，可应用于测定动物源性食品和水产品中氯霉素残留量的样品溶液的选择性纯化、富集，较普通的液-液萃取法、C18固相萃取法更为简单、快速、效率更高。
具体实施例方式
结合本发明的内容提供以下实施例实施例1.
(一)氯霉素分子印迹聚合物微球的制备(1)、模板分子、功能单体和交联剂的摩尔比为1∶2；稀释剂和交联剂的总体积与水的体积比为1∶6；聚乙烯醇1788(PVA1788)的浓度为3％；将0.8ml功能单体甲基丙烯酸N，N-二乙基氨基乙酯(DAM)和1mmol模板分子氯霉素溶解在稀释剂中，超声作用5min；将5ml交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)、120mg引发剂(AIBN)和15ml稀释剂(辛醇10ml、氯仿5ml)混合，超声作用5～10min；将上述三种溶液混合，在60℃恒温350rpm恒速搅拌20h；(2)、将上述反应制备的分子印迹聚合物微球在80℃水中搅拌60min，然后降温过滤，过滤后用双蒸水洗涤3次，再用20ml甲醇洗涤3次，20ml丙酮洗涤2次，每次15min，最后通过索氏萃取进一步除去模板分子；(3)、将除去模板分子的聚合物，真空干燥(50℃)，得到氯霉素分子印迹聚合物微球(80～100μm)。
(二)氯霉素固相萃取小柱的制备首先用5ml甲醇冲洗柱内壁，然后称取0.050g的MIPs(甲醇∶异丙醇＝2∶1v/v)装柱(1ml固相萃取小柱)，装填高度约为1cm，填料的顶端和底端分别装有20μm孔径的聚乙烯筛板；采用甲醇∶异丙醇＝2∶1(v/v)作为装柱匀浆液体，抽真空状态下，将匀浆液装入聚丙烯固相萃取小柱，然后盖紧筛板。
(三)氯霉素分子印迹固相萃取小柱应用于检测食品中氯霉素残留量的样品溶液的选择性纯化、富集，具体步骤如下固相萃取小柱装填好后，首先用10ml丙酮、10ml甲醇冲洗；然后加入样品溶液1ml；用1ml 40％甲醇淋洗3次；用0.5～1.5ml甲醇洗脱1次。
(四)固相萃取小柱性能分析评价(1)、用3ml甲醇润洗柱子，并保持2min，然后用3ml磷酸缓冲液上样溶液(每次1ml)润洗柱子，除去残留的液体，保持湿润，上样前勿让填料流干；(2)、上样，取1ml上样溶液；上样溶液有氯霉素标准品及其类似物(土霉素、链霉素以及四环素)；其中氯霉素标准溶液配制0.016g氯霉素溶于5.0mL甲醇中配制一系列浓度梯度(0.01，0.05，0.5，2.5，5，25μg/ml)的氯霉素标准溶液，采用磷酸缓冲液稀释；流速为0.20ml/min，真空泵抽真空以除去柱中残留的液体(＜1min)。收集流出液体，0.22μm滤膜过滤后上样；(3)、淋洗，3×1ml淋洗液(40％甲醇)淋洗，流速＜1min/ml；(4)、洗脱，首先加入0.25ml甲醇静止2min，然后加入0.25ml甲醇抽真空洗脱，收集洗脱液体，加入1.5ml磷酸缓冲液，0.22μm滤膜过滤后上样，HPLC分析。
以上试剂均为分析纯，购自美国sigma公司；其他试剂甲醇、丙酮(分析纯，购自中国国药集团)其发明效果为，该固相萃取小柱对氯霉素具有专一选择性，对氯霉素标准样品的回收率为85.6％，对其它类似物无特异性吸附。
实施例2.
(一)氯霉素分子印迹聚合物微球的制备(1)、将模板分子、功能单体和交联剂的摩尔比为1∶4；稀释剂和交联剂的总体积与水的体积比为1∶8；聚乙烯醇1788(PVA1788)的浓度为4％；将0.8ml功能单体甲基丙烯酸N，N-二乙基氨基乙酯(DAM)和1mmol模板分子氯霉素溶解在稀释剂中，超声作用5～10min；将5ml交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)、120mg引发剂(AIBN)和15ml稀释剂(辛醇10ml、氯仿5ml)混合，超声作用5～10min；将上述三种溶液混合，在65℃恒温400rpm恒速搅拌22h；(2)、将上述反应制备的分子印迹聚合物微球在80℃水中搅拌60min，然后降温过滤，过滤后用双蒸水洗涤3次，再用20ml甲醇洗涤3次，20ml丙酮洗涤2次，每次15min，最后通过索氏萃取进一步除去模板分子；(3)、将除去模板分子的聚合物，真空干燥(50℃)，得到氯霉素分子印迹聚合物微球(80～100μm)；(二)氯霉素固相萃取小柱的制备首先用5ml甲醇冲洗柱内壁，然后称取0.200g的MIPs(甲醇∶异丙醇＝2∶1v/v)装柱(6ml固相萃取小柱)，装填高度约为1cm，填料的顶端和底端分别装有20μm孔径的聚乙烯筛板；采用甲醇∶异丙醇＝2∶1(v/v)作为装柱匀浆液体，抽真空状态下，将匀浆液装入聚丙烯固相萃取小柱，然后盖紧筛板。
(三)氯霉素分子印迹固相萃取小柱应用于检测食品中氯霉素残留量的样品溶液的选择性纯化、富集，具体步骤如下固相萃取小柱装填好后，首先用10ml丙酮、10ml甲醇冲洗；然后加入样品溶液1ml；用1ml 40％甲醇淋洗3次；用0.5～1.5ml甲醇洗脱1次。
其发明效果，该固相萃取小柱对氯霉素具有专一选择性，对氯霉素标准样品的回收率为82.6％，对其它类似物无特异性吸附。
实施例3(一)氯霉素分子印迹聚合物微球的制备(1)、将模板分子、功能单体和交联剂的摩尔比为8∶25；稀释剂和交联剂的总体积与水的体积比为114；聚乙烯醇1788(PVA1788)的浓度为6％；将0.8ml功能单体甲基丙烯酸N，N-二乙基氨基乙酯(DAM)和1mmol模板分子氯霉素溶解在稀释剂中，超声作用10min；将5ml交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)、120mg引发剂(AIBN)和15ml稀释剂(辛醇10ml、氯仿5ml)混合，超声作用10min；将上述三种溶液混合，在75℃恒温450rpm恒速搅拌24h；(2)、将上述反应制备的分子印迹聚合物微球在80℃水中搅拌60min，然后降温过滤，过滤后用双蒸水洗涤3次，再用20ml甲醇洗涤3次，20ml丙酮洗涤2次，每次15min，最后通过索氏萃取进一步除去模板分子；(3)、将除去模板分子的聚合物，真空干燥(50℃)，得到氯霉素分子印迹聚合物微球(60～80μm)；(二)氯霉素固相萃取小柱的制备首先用5ml甲醇冲洗柱内壁，然后称取0.300g的MIPs(甲醇∶异丙醇＝2∶1v/v)装柱(6ml固相萃取小柱)，装填高度约为1cm，填料的顶端和底端分别装有20μm孔径的聚乙烯筛板；采用甲醇∶异丙醇＝2∶1(v/v)作为装柱匀浆液体，抽真空状态下，将匀浆液装入聚丙烯固相萃取小柱，然后盖紧筛板。
(三)氯霉素分子印迹固相萃取小柱应用于检测食品中氯霉素残留量的样品溶液的选择性纯化、富集，具体步骤如下固相萃取小柱装填好后，首先用10ml丙酮、10ml甲醇冲洗；然后加入样品溶液1ml；用1ml 40％甲醇淋洗3次；用0.5～1.5ml甲醇洗脱1次。
其发明效果，该固相萃取小柱对氯霉素具有专一选择性，对氯霉素标准样品的回收率为85.6％，对其它类似物无特异性吸附。
权利要求
1.一种氯霉素分子印迹固相萃取小柱的制备方法，其特征在于包括以下步骤(1)将模板分子氯霉素、功能单体甲基丙烯酸N，N-二乙基氨基乙酯和交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯，按模板分子∶功能单体∶交联剂摩尔比＝1∶2～8∶25，通过悬浮聚合而成氯霉素分子印迹聚合物微球；(2)称量氯霉素分子印迹聚合物微球，填充于聚丙烯固相萃取小柱内，填料的顶端和底端分别装上聚乙烯筛板；采用甲醇∶异丙醇体积比＝2∶1作为装柱匀浆液体，抽真空状态下，将匀浆液装入聚丙烯固相萃取小柱，最后盖紧筛板。
2.根据权利要求1所述的氯霉素分子印迹固相萃取小柱的制备方法，其特征是，称量氯霉素分子印迹聚合物微球0.050～0.200g，填充于1ml-6ml聚丙烯固相萃取小柱内。
3.根据权利要求1所述的氯霉素分子印迹固相萃取小柱的制备方法，其特征是，所述的聚乙烯筛板，其孔径为20μm。
4.根据权利要求1所述的氯霉素分子印迹固相萃取小柱的制备方法，其特征是，所述的氯霉素分子印迹聚合物微球，其制备步骤如下1)模板分子、功能单体和乙二醇二甲基丙烯酸酯的摩尔比为1∶2～8∶25；稀释剂和乙二醇二甲基丙烯酸酯的总体积与水的体积比为1∶6～14；将聚乙烯醇1788至于水中，搅拌至其全部溶解；将功能单体和模板分子溶解在稀释剂中，超声作用；将乙二醇二甲基丙烯酸酯、引发剂和稀释剂混合，超声作用；将上述三种溶液混合，恒温恒速搅拌；2)反应结束后，将上述反应制备的分子印迹聚合物微球在水中搅拌，然后降温过滤，过滤后用双蒸水、甲醇、丙酮依次洗涤，最后通过索氏萃取进一步除去模板分子；3)将除去模板分子的聚合物真空干燥，得到氯霉素分子印迹聚合物微球。
5.根据权利要求4所述的氯霉素分子印迹固相萃取小柱的制备方法，其特征是，步骤中，所述的稀释剂，为辛醇∶氯仿体积比＝5∶1的混合溶剂；所述的引发剂，为偶氮二异丁腈。
6.根据权利要求4所述的氯霉素分子印迹固相萃取小柱的制备方法，其特征是，步步骤1)中，聚乙烯醇1788的浓度为3～6％，80℃搅拌30min至其在水中全部溶解。
7.根据权利要求4所述的氯霉素分子印迹固相萃取小柱的制备方法，其特征是，步骤1)中，超声作用时间均为5～10min；恒温恒速搅拌是指在60～70℃恒温350～400rpm恒速搅拌20～24h。
8.根据权利要求4所述的氯霉素分子印迹固相萃取小柱的制备方法，其特征是，步骤2)中，分子印迹聚合物微球在80℃水中搅拌60min，然后降温过滤，过滤后用双蒸水洗涤3次，再用甲醇洗涤3次，丙酮洗涤2次，每次15min。
9.根据权利要求4所述的氯霉素分子印迹固相萃取小柱的制备方法，其特征是，步骤3)中，真空干燥温度为50℃，得到平均孔径为40～120μm氯霉素分子印迹聚合物微球。
全文摘要
一种氯霉素分子印迹固相萃取小柱的制备方法，属于生物工程技术领域。本发明将模板分子氯霉素、功能单体甲基丙烯酸N，N－二乙基氨基乙酯和交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯，按模板分子功能单体交联剂摩尔比＝1∶2～8∶25，通过悬浮聚合而成氯霉素分子印迹聚合物微球；再称量氯霉素分子印迹聚合物微球，填充于聚丙烯固相萃取小柱内，制得氯霉素分子印迹固相萃取小柱。本发明制得的氯霉素分子印迹固相萃取小柱用于检测食品中氯霉素残留的样品溶液的选择性纯化、富集。本发明较普通液－液萃取法、C18固相萃取法具有更为简单、快速，净化效率更高等特点。
文档编号B01J20/281GK1811409SQ20061002390
公开日2006年8月2日 申请日期2006年2月16日 优先权日2006年2月16日
发明者张大兵, 武爱波, 史西志, 李荣秀 申请人:上海交通大学