用于体外全血灌流吸附低密度脂蛋白的吸附剂及制备方法

专利名称：：用于体外全血灌流吸附低密度脂蛋白的吸附剂及制备方法用于体外全血灌流吸附低密劍旨蛋白的吸附剂及制备方法S^领域本发明属于生物医药
技术领域：
。涉及用于体外全血灌流除去血液中的致病物质-低密劍旨蛋白的吸附剂。是以壳聚糖、纤维素或聚乙烯醇微球为载体，以磷酸盐为配基的吸附剂，具有良好的血液相容性和生物娃性。
背景技术：
1,来，在一些国家和地区心脑血管疾病fflil成为发病率和死亡率最高的疾病，例如高脂血症、动脉粥样硬化和再狭窄、冠心病、脑栓對n心肌^S等。现已知道，血液中的低密度脂蛋白(LDL-C)和樹氏密度脂蛋白(VLDL-C)7jC平的升高是诱^lft幾病的关键因素。琉，i殳法斷氏血液中的LDL-C水平可以有效離禾叻n速治愈战疾病，一般可以S3i^制饮食、改变生活方式(、戒酒、加强麟等)和服用陶旨药鹏制血液中的LDL-C7K平。对于用以上方法无效者和家族性高脂血症患者则可以ffliil&液净化的对妹降低LDL-C水平，此方法是用体外物理方S^清除血液中高水平的LDL-C。fflM^年的发展，1有血浆置换法、肝素体外沉淀法和血激血浆灌流法等几种。血浆置换法在一定禾號上比较有效，但人的血浆价格昂贵，去掉了致病物质的同时也去掉了血浆中的有用成分如HDL等，还有感染其它病毒的危险；肝素体外沉淀法虽克服了血浆置换的缺点，但仪器设备复杂，治疗费用昂贵；血液灌流法即将病人的血液引出体外，流^JfiL液净化吸附剂特异iWI每血激血浆中的LDL-C吸附掉，然后再将血液输回患者体内。有的吸附剂可以不用分离血浆，直接全血灌流。此种方法安全、',、较低的治疗费用以及患者的耐受性^，,来皿fflil。吸附去除LDL-C方法的核心是LDL-C吸附剂，不少研究机构和学^S行了很多相关的研究工作，主^W以下几种，的吸附剂(1)LDL《免疫吸附剂，Dr.StoffelBorberg和Greve率先运用免錢和色谱原理去除LDL-C;有用人的单克隆抗体制成的免疫吸附剂，对人的Apo-B具有很高的特异性，在俄罗斯的研究中心得到了細；1987年E.Richani研究了)l敏LDL抗体固载于琼脂的不同方法以及由此而弓胞的对免疫吸附的效率的影响；(2)阴离子型LDL-C吸附剂，它是舰LDL-C表面带正电荷的ApoB与阴离子舰静电作用结合而制得的一种吸附剂，1980年，Edwin等AW素-琼月識鹏制成吸附柱，并用两个柱子交割顿连衝瞿流，招艮;^lgJ^高了以LDL的清除效果。1985年和1987年日本的Asahi化学，有限公司和美国Nobataka分别以聚乙烯醇和ToyogerdHW55gel为载体，肝素为配体，制成了LDL吸附剂。由于阴离子多聚物同LDL的吸附作用，使得AX合成的阴离子聚^tl作为LDL吸附剂的使用早已实现。1984-1987年，日本学者用礎化葡聚糖为配基，以纤维素为载体的磺化葡聚糖-乡fi隹素吸附剂吸附LDL。E.Jamal和M.Fadul所作的用磺化葡聚糖对纯合家族性融旨血症患者的縱四年的5跟享观察和研究发现，这种LDL吸附剂可以长期《顿，病人的LDL及Lp(c)均^K病人的身微况得到了很大改善，同时延缓了此类病人动脉粥样硬化和心脏病的发生。另一类合成的阴离子聚^tf为聚丙烯,吸附剂。1987年，Kuroda用聚丙烯酸-聚乙烯,附剂进行人体血浆和体外动物实验，并对一个病AS行了治疗。1988年，KarstenThies用聚丙烯謝M亲和吸附剂，吸附试验中，没有发现副作用，且它的价衞驢，可以多爐复^顿，因lthS种吸附剂具有很大的应用价值。(3)非离子型LDL吸附剂，1975年，美国学者Maloval等Affl多孑LM作为LDL吸附剂，体外吸附和动物灌流实验均取得了明显的降胆固醇效果。1984年，日本的Asahi化学IQlk有限公司用大L，做LDL吸附剂，《她清中的LDLM^了82.5。/。。E.Behem石赠喊一种多孑L纤维素，它对LDL的吸附具有高度的选择性并且吸[5f懂随着纤维錢的增加而增加，吸Pf懂MJL液相容性好。在国际上用于吸附LDL及胆固醇的吸附齐,究开始于七+^代末，ffl31多年的研究，目前已有不少ldix:吸附剂产品在临床上应用，具有代表性的有以下几种(1)免疫型吸附剂(Immunoadsoiption，MA)，德国PlasmaSelect公司的Therasorb产品，其配基为抗LDL抗体ApoB100，縣统可以重复{顿进行40次以上的治疗，特异性吸附船有Apo-B的蛋白，对其《t!l^M分的吸附斜目对较低，价格和治疗费用也非常高。另外一种免疫吸附剂也用于临床治疗，即俄罗斯Pocard公司的lipoparkLDL吸附系统，它是将多克隆抗体Lp(a)抗体固定至摘聚麟体上得至啲免疫吸附剂，适用刊旨蛋白A浓度高的病人。免鄉吸附剂的选择性高，但雜不宜用热消毒、需进行血浆灌流、制作錢、成本高辦点，限制了雜临床上的广泛应用。(2)磺化葡聚糖吸附系统(Dextran-SulfateAdsorption,DSA):日本Kaneka公司的Liposorber产品，它是在多孔纤维素微球载体上固定磺化葡聚糖配基形成的阴离子型吸附剂，他们能吸附所有含ApoB柳旨蛋白，吸附容量大，选择性高，但治疗时需要血桨分离，仪器设备及治疗费用较高。(3)LDL血液灌流吸附系统(DirectAdsorptionofLipoproteins,DALI):德国Fresenius公司的DALI产品，它是在多孔聚丙烯鹏载体上固定聚丙烯麟配基形成的阴离子型吸附剂，具有很好的血液相容性。聚丙烯酸盐阴离子倉,效地结合胆固醇、LDL、脂蛋白A和甘油三酯。该吸附柱为一次性《顿，不倉giS行再生，突出优点是很好的选择性、可用于全血灌流和操作技术简单。这种吸附装置目前完成的病例还不多，尽管仪器设备简单，但吸附剂驢本身还是很昂贵。虽然,来我国很多学者在LDL吸附剂方面发表了不少相关的研究工作，但是我国还没Wl^品化的LDL吸附剂产品出现，国外进口的产品又价格昂贵，大大限制了此类产品在我国的鹏。因此急需开发一种价衞RH，制备过程简单，安全、有效的LDL吸附剂。
发明内容本发明目的是克服现有技术存在的，不足，,一种用于体外全血灌流吸附低密度脂蛋白的吸附剂及其制备方法。本发明涉及一种用于体夕哈血灌流清除ldl-c的吸附剂，它是以不溶于水的壳聚糖微球、纤维素微^聚乙烯醇微球为载体，ffl3i与三氯氧磷或磷酸吡多醛反应和后处理引入带负电荷的磷離配基得到的。本发明提供的吸附剂是一种新型的ldl吸附剂，可用于体外血液灌流清除血液中的低密度月旨蛋白。本发明提到的吸附剂所用载体的材料，它首先必须是不溶于水的，^W—定的机械^^而不易在血流的压力驱动下破碎，可以有多种皿，如粒状、片状和纤维^，tti4球状。适合用作载,料的可以是无机多孑L材料如多孑LM和多孔^;也可以是天然高^材料如琼月識、葡聚糖、壳聚糖和纤维,；还可以是合成高好材料如聚丙烯、棘乙烯、聚乙烯醇等。本发明优先选用的载体材料为天然高分子材料壳聚糖和纤维素以及合成高分子材料聚乙烯醇，因为它WTiW的生物相容性，容易制^^状载体，且含有^i供反应的活性位点。本发明《顿的载体为球形，微球的粒舰吸附剂的性能W^的影响，若粒敏大，贝微球的比表面积较小，^A吸附tt^球拉间的间隙也^:，这i^直接影响到吸附性能，若粒^1小，在吸附柱中的堆积过于紧密，会阻碍血液的快速流动，并且有泄漏的危险。综合来说粒径宜在50-800um，但在100-500um，。本发明{顿的，分样筛筛分并331光学显微镜自计算得到的。本发明f顿的载体为石顿多孔微球，照胃石顿是指材料不易溶胀，有一定的机械3跛，在一定的压力下不易变形，并且在吸附柱中液^^m和压力差几乎呈线性关系，这样的微球作为吸附剂是合适的，不易破碎和不会阻碍血液的稳定流动。载体又必须是多孔的，即比表面积不小于3m2/g，孔隙軒小于20%，而_§^、须^3^的駄直径的孔，孑L径大小魏制得飽，大到不能ihifiL液中的红细胞和白细胞等aAL内部，小至腰倉辦让LDix:微,顷利扩ifcit载体微球内部，与配基誠吸附作用，红细胞和白细胞等则可以ffl^微球之间的空隙顺利流出。本发明^ffl的载体必须含有或部M有反应活性基团-羟基，一方面，羟S^了载体一定的亲水性能，保证了材料良好的生物相容性；另一方面，活酵圣基有利于下一步的磷酸化鹏。本发明的载條进行磷酸化反应的,l敏该是^7jC的，因为本发明所用到的磷酸化反应试剂为三氯氧磷，iS7乂极易，，直接影响到磷酸化效率。因此发明所用的含7K^高的天然高M微,体壳聚糖和纤维素M^要Mii千燥，千燥的方法有很多，如高,干和冷冻千燥等，本发明所用至啲这两种载^J^方&^燥时会塌縮，所以本发明采用了梯度船ic的方法。聚乙烯醇共聚繊球采用直接烘干的方法。本发明所用至啲吸附剂的配基为阴离子形式，具体来说为磷鹏。磷離是人体舰的正常组分，且带有明显的负电荷，可以和带正电荷的ldl-c产生明显的电荷吸附作用而达到清除ldl-c的目的，并且即使吸附剂在血液灌'^:程中有微量的配基脱落也不会引臥#^的不适反应。本发明〗顿的隨为磷離，可以是单磷麟女P^HP03—禾0~^032-等，也可以为多聚磷酸盐，配基含量的多少可以舰磷酸化反应禾雖来控制。另外，本发明中吸附剂的齢量由ISM^比色法测定。，吸附剂的制备方法(1)、用浓度为2-8%(质量浓度)的壳聚糖/乙酸溶液喷射入氢氧化钠溶液中固化而帝喊壳聚糖微球，t^^7jC^P燥后悬浮于无水四氢呋喃中，在0-120。C,范围内与0.005-2倍^f只的磷酸化试剂三織磷反应，然后用5。/0(质量浓衝的碳體钠7K溶M行水解得到低密度脂蛋白吸附剂。或者，(2)壳聚糖微,体用^f只浓度为5%40%的乙二醇11^水甘油1^行交联和活化后再和磷酸口比多醛进行固定化反应，经硼氢化钠还原和^a^制得低密劍旨蛋白吸附剂。赫，(3)、棉纤维素溶解后悬浮分散于有机]#^,然后加热固化而制成纤维素微球，微球^7K^P燥后悬浮于^7乂吡啶中，在0-120°C温度范围内与0.005-2倍体积的磷酸化试剂三氯氧^4行磷酸化反应，然后用10%(质量浓衝的浓度的氢氧化钠水溶舰行水解得到低密度脂蛋白吸附剂。(4)、单体醋酸乙烯酯和交联剂异濯MH烯丙酯(交職为2040%)以鹏孔剂乙酸乙酯、!E^分散于浓度为1.5%(质量浓度)的聚乙烯醇7K溶液中，在偶氮二异丁腈引发作用下聚合成微球，经脱除致孔剂和氢氧化锹甲,液酯交^得到聚乙烯醇微球，微球经千燥后悬浮^7jCDMF中，在0-120°C、鹏范围内与0.005-2倍^f只的磷酸化试剂三氯氧M行磷酸化鹏，然后用1oy。(质量浓衝的織化钠7jc溶^4行zK解得到低密度脂蛋白吸附剂。本发明的优点和积极鄉本发明制备的用于体外血液灌流的吸附低密度脂蛋白的吸附剂能有效去除血液中的低密度月旨蛋白，而对血液中的其它成分无明显作用。具体实^实施例1:^^为载体磷離为腿的吸附剂的制备a.壳聚糖m^体的制备将壳聚麟末4.0g溶于96g浓度为2%的乙酸中，得到浓度为4%的壳聚糖乙酸溶液，在高压氮气流作用下，舰鹏将此溶液喷入质量浓度为8%的織化钠溶液中。调节喷射鹏可得到粒径均匀、大小含适的壳聚糖微球，用蒸馏7jd,球洗至中性备用。壳聚糖微球载体的含水量为93.3%。b.磷M&KS的引入将一定mR的壳聚糖微^A洗涤柱中，依細乙醇、丙酮、四氢彌和^7K四氢彌、職，^W中的水^M渐,掉，得到不含水分的壳聚糖微球，置^P燥器中备用。称鹏aifeK的微球于三口MS内，加入四氢鹏、三乙ff安，搅拌使微,匀悬浮，冰浴下滴加三氯氧磷，在10min内加完，之后撤去冰浴，室温下反应3h。四氢,的#^只为微球#^只的5倍，三織磷的用量根据欲偶職酸的li十算。三乙胺的摩尔量为三織磷的3倍。反应完全后，缓侵滴加质量浓度为5%的碳,溶液，直到不冒气泡。倾去残液，微球依次用1mol/L的氯化钠溶液、蒸馏7jcmS中性，得到磷maM壳聚糖吸附剂，4'C保皿用。实施例2.壳聚糖,为载体，磷醚比多醛为S^的吸附剂的制备a.壳聚糖微職体的交联和活化向由^ffi例la制备的壳聚糖TO悬液中力口入10。/o(V:V)的乙二醇:ili水甘油醚(EGDE)，在7(TC下振荡;iS行3h的交联g，然后用蒸馏水充分洗涤备用。b.磷酸吡多^IBS的固定将0.58磷酸吡咳醛溶于？11戯3.6的酸缓冲溶液中，加入壳聚糖微球5.0g，在5(TC下振荡5h。然后用质量浓度为10%的硼氢化钠溶液还原，硼氢化钠的用量是磷酸吡哆醛的20倍，在lh内分两効卩完，4'C鹏3h，用蒸馏7K充分職，即得到吸附剂，4'C保絲用。实施例3.吸附剂体外静态吸附实验分别量取1.0ml由鄉例l、2制备的壳聚糖为载体的吸附剂，置于5.0ml的聚丙烯塑料管中，加A5SS的生aSk7K平衡3h，吸去游离的生鹏7K后加入3.0ml高脂血症病AlfiL浆，37T恒温振荡3h，静置片刻，吸社清液做TC、LDL-C、TG和HDL-C浓度观啶，并与未加吸附剂的血浆作对比。吸附量由下式计算AC=([C]b-[C]a)Vp/VA式中AC为吸Pf擅(mg/ml)，[C]b和[C]a分别为吸附前后浓度(mg/dl)，Vp和VA分别为吸附过程中所用血桨和吸附剂的^IR。由实施例1、2制备的吸附剂吸附性能测试结果如表1戶标表1壳聚糖微球为载体的吸附剂小样吸附性能测试结果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>实施例4.,素微球为载体磷^为,的吸附剂的制备a.,素,的制备100g短織帛剪碎，力口入800mU9yo质量浓度的氢氧化钠水溶液，微均匀，室温下浸泡2h,賊部分碱液，S5CA广口瓶中力口塞，腿于28。C老化72h。加入50ml二硫化碳，室温下反应8h，棉花由浅黄&^渐^红色，加入845ml质量浓度为6n/。的NaOH溶液，并进行机拌，棉花鄉溶解，得至啦红色粘胶液，纤维素浓度为8%。500ml三口娜中力口入200ml氯苯，34ml四氯化碳，0.78g油酸钾，机W^30射中待油酸钾溶解，缓f勤卩入i:^粘胶液80ml，调节M^Ni度，使液滴分散均匀，粒径合适，在lh内均匀升M90。C，,此M和^ffil^3h，^4P后倾去有mffi，用大量水充分冲洗得到的,抽干水份备用。b.磷maiss的引入由^M例4a得至啲纤维素微球駄洗涤柱，依細30%的乙醇、70%的乙醇、5￡7乂乙醇、30%的吡P忠乙醇、70%的吡啶乙醇、卩比啶和处ffil的^7jC吡啶梯度皿，得至赃吡啶中悬浮的不含7]C分的纤维素微球，密封保##用。不含7K分的纤维素微球5.0ml置于100ml三口烧瓶中，加入^7K吡啶15ml，搅拌使其均匀悬浮，并缓漫升驢120。C。保温30射中后，缓漫滴加三織磷0.5ml，滴加完毕后维挣鹏反应30射中，然后滴加质量浓度为10。/。的NaOH溶^7K解，1^7JC解完全。得到的微球过滤后m洗涤棚7K充分mM中性，得至似纤维素微球为载体以磷麟为配基的吸附剂，4。C保絲用。由^ffi例4得至啲纤维素微球为载体的吸附剂的吸附性能测试结果如表2戶标表2纤维素微球为载体的吸附剂的吸附性能测试结果吸附剂吸,(mg/ml)TCLDL-CHDL-C实施例41.303.120.10实施例5.聚乙烯醇为载体磷酸盐为配剂的吸附剂的制备a.聚乙烯醇鹏的制备在500ml三口烧瓶中分别加入24g醋酸乙烯酯，6g异fUB^H烯丙酯，15ml乙酸乙酯，15ml!E^体系升温至4o。c，机Wt半，加入a3g引发剂偶m^异丁腈，待引发剂溶解后往体系中加入300ml水(按Mi十算，含有1.5%的聚乙烯醇和3%的氯化钠)，调整搅mS使^^商均匀分散，大小合适，缓優升温至65。C，《親鹏和ltffiiS聚合3h，然后升温至75。C再维持3h，得至ij一种白色粒状共聚物。过滤，用热7jC洗涤，再用丙酮在索氏提取器中提取12h，晾干。将J^^共聚tT微粒加入到12gNaOH和500ml甲醇组成的溶液中，机W^下在40。C进行18h的酯交换反应(醇解反应)，鹏完鹏抽滤，用甲麟涤，晾干，得到以聚乙烯醇为主要结构单元的交联多孔共聚物微球。平均粒径为450um，比表面积为66.89m2/ml，羟基含量约10.Ommol/g。b.磷M&lfiS的引入将由鄉例5a得至啲千燥的多孑L聚乙烯醇微球5.0ml置于100ml三口中，力口入15ml无水DMF，,使其均匀悬浮，并缓I"新驢120。C。保温30溯后，缓漫滴加三氯氧磷0.51111，滴加完毕后维持，^30射中，然后滴加质量浓度为10n/。的NaOH溶^7K解，JSdC解完全。得到的微球过滤后駄洗涤棚水充分^中性，得到磷M&M聚乙烯醇吸附剂，与4t保存备用。由鄉例5得到的聚乙烯醇微球为载体的吸附剂的吸附性能测试结果如表3戶标:表3聚乙烯醇微球为载体的吸附剂的吸附性能测试结果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>权利要求1、一种用于体外全血灌流吸附低密度脂蛋白的吸附剂，其特征是该吸附剂以壳聚糖微球、纤维素微球或以聚乙烯醇微球为载体，通过与三氯氧磷或磷酸吡多醛反应和后处理引入带负电荷的磷酸盐配基得到。2、根据权利要求i戶;n兑的吸附剂，，征在于皿的磷为磷,，可以是单磷酸盐女P"HP03國fP~P032—等，也可以是多聚磷麟。3、根据权利要求l或2戶;fi兑的吸附剂，赚征在于戶诚的载体的粒径为50-800um，tl:^面积不小于3m2/g,孔隙率不小于20%，其L径大于LDL-C微粒的粒径、小于M胞和白细鹏卜径。4、根据权利要求3戶形兑的吸附剂，，征在于自的载体的粒径皿100-500um。5、权利要求l附兑的吸附剂的制备方法，，征在于(1)、月^K后的壳聚糖微職体悬浮^5zK四氢彌中，在0-12(TC驢范围内与0.005-2倍1^只的磷酸化试剂三氯氧磷反应后，^7K解和后处理得到低密度脂蛋白吸附剂；或，(2)、壳聚糖tl^体用^f只浓度为5%40%的乙二醇17尺甘油行的交联和活化后再和磷働比多醛进行固定化反应，经硼氢化钠还原和处,制得低密度脂蛋白吸附剂；或，(3)、月^7jC后的纟书隹素微球载体悬浮^7jCfl比啶中，在0-12(fCa^范围内与0.005-2倍l^只的磷酸化试剂三氯氧行磷酸化反应，g7jC解和后处理即制得低密度脂蛋白吸附剂；或，(4)、千燥的聚乙烯醇微職体悬浮于^7jCDMF中，在0-120。C鹏范围内与0.005-2f辦积的磷酸化试剂三氯氧^S行磷酸化反应，飽K解和后^S得至U低密度脂蛋白吸附剂。6、根据权利要求5附兑的吸附剂的帝恪方法，辦征在于戶腿的壳聚糖微職体的制备方法是用质量浓度为2-8%的壳聚糖/乙酸溶液喷射入氢氧411钠溶液中固化^而成。7、根据权利要求5船兑的吸附剂的制备方法，^#征在于戶腿的纤维素微職体的制备方法是棉辩隹素溶解后悬浮分散于有机皿J，然后加热固化而成。8、根据权利要求5附兑的吸附齐啲制备方法，^!t征在于臓的聚乙烯醇微纖体的制备方法是单体醋酸乙烯酯和交为2040。/。的交联剂异ttMH烯丙酯以^t孔剂乙酸乙酯、im^散于质量浓度为1.5。/。的聚乙烯醇7K溶液中，在偶m^异丁腈引发作用下聚合i^微球，经脱除致孔剂和氢氧化钠/甲醇溶液酯交换后得到交联聚乙烯醇共聚物微球，羟基含量约为10mmol/gc全文摘要一种用于体外全血灌流吸附低密度脂蛋白的吸附剂及其制备方法。它是由不溶于水的壳聚糖、纤维素或聚乙烯醇微球为载体，固定磷酸盐配基制得的。本吸附剂表面带有大量的负电荷，以有利于和表面带正电荷的LDL作用而产生吸附作用。本发明制备的吸附剂能选择性地除去血液中的低密度脂蛋白，而对血液中的有益成分如高密度脂蛋白等无明显吸附作用。并且载体材料选用生物相容性好的壳聚糖、纤维素和聚乙烯醇，配基为磷酸盐，为人体体液中所含有的成分，吸附剂有极好的血液相容性，可用于体外全血灌流治疗高脂血症。文档编号B01J20/286GK101224415SQ20071006132公开日2008年7月23日申请日期2007年9月30日优先权日2007年9月30日发明者俞耀庭,孔德领,欧来良,王为超,王深琪,王连永申请人:南开大学