一种琼脂凝胶微球的制备方法

专利名称：一种琼脂凝胶微球的制备方法
技术领域：
本发明涉及生物工程的生化分离和细胞及其蛋白载体领域。更具体地说，本发明涉及一种琼脂凝胶微球的制备方法。
背景技术：
高分子微球是指直径在纳米级至微米级，形状为球形或其他几何体的高分子材料。目前以天然高分子等为原料的凝胶微球主要有海藻酸钠凝胶微球、壳聚糖凝胶微球、葡聚糖凝胶微球和琼脂糖凝胶微球。其中琼脂糖凝胶微球主要作为一种色谱介质，用于蛋白质、肽类、核酸、糖类的分离，同时也可作为活细胞或药物载体。但目前琼脂糖凝胶的市场价格较为昂贵，如s印harose 6B可售700元/IOOml左右，经过交联修饰的CM Sepharose CL-6B可售2200 2500元，Superose系和Superdex系的价格更高，一般都上万元。虽然目前琼脂糖凝胶介质的制备已较成熟，但受到原料成本及设备要求的限制，所制得的凝胶介质只适用于实验室小规模使用，无法实现工业化放大。而琼脂作为提取琼脂糖的原料，其市场价格只有琼脂糖的2. 5 4%，如果能以琼脂为原料制备一种凝胶微球，且能达到与琼脂糖凝胶微球相当的效果，则可大大降低制备成本，使工业化制备琼脂糖类凝胶微球成为现实。琼脂是从海藻中提取的多糖体，含有碳水化合物、钙与硫酸盐，具有较好的凝固性和稳定性，并能与一些物质形成稳定的络合物，是目前世界上用途最广泛的海藻胶之一。琼脂主要由琼脂糖和硫琼胶组成，琼脂糖是由D-半乳糖和3，6-内醚-L-半乳糖组成的中性多糖，而硫琼胶为含有带负电的硫酸基和羧基的酸性多糖的酯，这些带负电的基团使琼脂凝胶微球可直接用于阳离子交换、重金属离子吸附，以及一些不受电荷影响的产物分离。此外，琼脂是一种天然多糖，具有生物相容性好，亲水性好，可再生，易于修饰配基等优点。因此，琼脂凝胶微球在酶固定化、细胞培养、药物载体、蛋白分离、天然产物分离和重金属离子吸附等方面具有广泛的应用前景。以琼脂为原料可以制成琼脂凝胶裸球和琼脂凝胶微球。琼脂凝胶裸球是以琼脂为原料，采用乳化-冷却固化法直接制备，包括水相和油相的制备、分散乳化、冷却固化、洗涤、干燥几个步骤。琼脂凝胶裸球强度较弱，在层析柱内会使流速降低，影响分离速度和分离效能，因而不适合用作分离介质。目前，琼脂凝胶裸球主要用于制备化妆品或药物载体。琼脂凝胶微球主要是以琼脂凝胶裸球为原料，采用化学交联法制备，包括琼脂凝胶裸球的溶胀、化学交联、洗涤、干燥几个步骤。该制备过程也可以直接以琼脂为原料，将乳化-冷却固化过程与化学交联过程进行有机结合，用于制备琼脂凝胶微球。交联后制得的琼脂凝胶微球的机械强度、热稳定性得到显著提高，可用于酶固定化、蛋白分离、天然产物分离和重金属离子吸附等方面。实际应用和制备过程中，根据具体用途和性能要求，通常需要对琼脂凝胶微球进一步进行功能化配基修饰，以便实现其应用。琼脂凝胶微球的功能化修饰，可以在琼脂凝胶裸球制备过程完成后，直接进行活化、交联和配基修饰；也可以在琼脂凝胶微球制备过程完
3成后，进行活化和配基修饰。专利US3959251主要是以溶胀的琼脂凝胶裸球或颗粒为原料，在碱性及50 90°C 条件下，以双环氧化合物(如环氧丙烷)、表卤代醇(如环氧卤丙烷)以及二乙烯基砜等为交联剂进行交联，反应进行20min 2h，反应过程中持续搅拌，并通过添加硼氢化物等还原剂以及维持无氧环境来避免琼脂在碱性条件下发生变色和分解，所制得的琼脂凝胶微球中琼脂含量为2 6%。该专利还直接以6%的琼脂为原料，以含乙酸乙酯的二氯乙烯作稳定剂，在有NaBH4存在的碱性及75 °C的条件下，采用控制搅拌的方法制成粒径为50 250 μ m 的琼脂凝胶裸球，然后在60°C条件下继续前述的交联反应以完成琼脂凝胶微球的制备。该专利在室温及碱性条件下，用溴化氰对溶胀的脱硫琼脂凝胶微球活化处理6 9min，再在碳酸氢钠溶液中与半刀豆球蛋白A、核糖核酸酶A等反应，将蛋白质固定在琼脂凝胶微球上，实现琼脂凝胶微球的功能化修饰。王为超等人，“琼脂凝胶球载体吸附剂清除免疫球蛋白E的性能特征，[J],中国组织工程研究与临床康复，2007，11(1) 90 94”，将制好的6%的琼脂溶液，趁热缓慢倾倒于由甲苯/三氯甲烷混合溶液及少量吐温80制成的油相中，油相与水相的体积比为2 1， 持续搅拌，60°C条件下保温3 5min，室温下自然冷却，将所制得的产物用水洗净并筛选出 20 40目的琼脂凝胶裸球，加入湿态琼脂凝胶裸球体积0. 4倍量的环氧氯丙烷，在碱性及 40°C条件下，恒温震荡2.证，用水洗净，完成琼脂凝胶裸球的交联及活化，活化琼脂凝胶微球键联配基色氨酸及手臂制得免疫球蛋白E的免疫吸附剂。从国内外报道来看，关于琼脂凝胶微球的研究，多数是将之作为一种吸附基质或载体材料，而将其用作分离介质则由于受到凝胶微球机械强度和粒径的限制很难实现。目前提高琼脂凝胶微球机械强度的方法主要是化学交联法，交联后的琼脂凝胶微球机械强度有较大程度的提高，但是由于凝胶微球中琼脂含量较低(一般为2 6wt% )，交联后的琼脂凝胶微球用作分离介质其强度仍然不够理想，要进一步提高琼脂凝胶微球的机械强度只能通过增大凝胶微球中琼脂含量来实现。制备琼脂凝胶裸球的乳化-冷却固化过程是增大琼脂凝胶微球中琼脂含量的关键步骤。目前该过程主要是采用机械搅拌乳化-冷却固化法，用该方法制备的琼脂凝胶裸球中的琼脂含量均低于6wt%，当微球中琼脂含量大于6wt%时，由于浓度增大导致水相粘度遽增，致使水相很难均勻的分散到油相中形成均一的乳液，同时已形成的液滴也容易发生聚集使乳液不均勻，因此以目前的机械搅拌乳化-冷却技术很难制得粒径小且分布均一的琼脂凝胶裸球。除上述问题外，现有的机械搅拌乳化-冷却固化过程还存在乳化分散过程中不能控制液滴粒径，致使最终固化后得到的琼脂凝胶裸球粒径不均一的问题。凝胶微球粒径不均一，用作分离介质时，小的凝胶微球会进入大的凝胶微球之间的空隙中，致使分离压力增大，严重时导致分离无法进行。为得到粒径较为均一的分离介质，可以在琼脂凝胶裸球交联反应前后对其进行筛分，这不但会造成原材料的浪费和生产成本的提高，也会增加操作复杂性。采用超声、机械搅拌、均质乳化等普通乳化-冷却固化法以及喷射-冷却固化法的琼脂糖凝胶微球的制备过程也存在同样的问题。专利CN1640539A采用膜乳化-冷却固化法解决上述问题。该专利将加热条件下配制成的0. 1 20wt%的琼脂糖溶液作为水相用压
4力通过微孔膜压入油相中，并将所得到的尺寸均一的乳滴转入到冷却装置中，在IOOrmp的机械搅拌条件下，采用程序降温法冷却到15°C以下固化制得琼脂糖含量大于6%的尺寸均一的琼脂糖凝胶微球，其粒径在1 IOOym可控。该专利技术对膜要求很高，并需要增加若干配套设备，操作过程复杂，对设备要求高，生产成本也较高，难以实现工业化生产。因此，针对目前存在的问题，有必要开发一种制备过程简单、对设备要求不高、耗能低，并且所制得的产品中琼脂含量大于6%，机械强度高、凝胶微球粒径均一，且粒径可控的琼脂凝胶微球制备方法，用以制备成本低廉，分离性能良好的色谱介质用琼脂凝胶微球。

发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术的不足，提供一种琼脂凝胶微球的制备方法，该方法以简单的操作过程和工艺设备，制备出琼脂含量为4 20wt%，呈规则球形，粒径均一，且粒径在1 900 μ m范围内可控的琼脂凝胶微球，该琼脂微球机械强度好、热稳定性高、可再生性强，且成本低廉，可用作分离介质。为了实现上述目的，一种琼脂凝胶微球的制备方法，包括步骤A，将琼脂溶于水制成水相W，其中水相中琼脂的含量为4 20wt% ；步骤B，将油溶性表面活性剂溶于与水互不相容的有机溶剂中制成油相0，其中在油相中含有体积比为10 20%的油溶性表面活性剂；步骤C，将水相加入油相进行分散乳化得到W/0型乳滴，其中油相与水相的体积比为 1 1 10 1;步骤D，W/0型乳滴经冷却固化得到琼脂凝胶裸球；步骤E，琼脂凝胶裸球经化学交联得到琼脂凝胶微球。在本发明的一个优选实施例中，步骤A所述的水相中琼脂的含量为6 12wt %，优选为8 12wt%。步骤C中所述的油相与水相的体积比为1. 5 1 5 1。油相中与水互不相容的有机溶剂常温下呈液态，如环己烷、庚烷、苯、甲苯、二甲苯等。油溶性表面活性剂为能迅速降低油水界面张力的非离子型共聚物，如失水山梨醇三油酸酯(司班85)、失水山梨醇单油酸酯(司班80)、聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯(吐温80)寸。步骤C通过均质乳化器进行分散乳化，其中均质乳化器的起始转速为500 6000rpm，最终转速为1000 IOOOOrpm，反应过程中均质乳化器的转速维持稳定增长。乳化反应时间为1 30min。乳化反应温度为50 80°C，优选为55 75°C。冷却固化过程可根据所需孔径的大小选择自然冷却或迅速冷却的降温方式。步骤 D中均质乳化器的转速维持在1000 lOOOOrpm。步骤E包括在碱性条件下，以环氧氯丙烷作交联剂，将琼脂凝胶裸球进行交联，交联反应温度为25 60°C，浓度为20 60wt %的NaOH的加入量为琼脂凝胶体积量的0. 3 0. 8倍，优选为0. 4 0. 7倍。环氧氯丙烷的加入量为琼脂凝胶体积量的0. 45 0. 9倍，优选为0. 5 0. 8倍。为防止反应过程中琼脂变色和水解，上述交联反应是在0. 08 0. 25g/ ml Na2SO4和0· 005 0. 02g/ml NaBH4存在条件下进行的。在本发明的一个优选的实施例中，将用上述方法制好的琼脂凝胶裸球用水和50% 乙醇交替洗净后，与体积量是凝胶体积量0. 5 2倍的蒸馏水混合，加入0. 08 0. 25g/ml Na2SO4,在25 40°C条件下搅拌溶解，然后加入体积量是凝胶体积量0. 01 0. 05倍的20 60wt% NaOH 和 0. 005 0. 02g/ml NaBH4,接着以 0. 01 0. 5ml/min 的速率加入 20 60%NaOH，并同时以0. 05 0. 5ml/min速率加入环氧氯丙烷，持续搅拌1 2 后，增加水浴温度至45 70°C，并持续搅拌10 30h后，冷却至室温，加入体积量是凝胶体积量0. 5 3 倍的蒸馏水后，用10 90% (体积比)醋酸调节pH至3 10。最后用去离子水和50%乙醇交替洗净后，保存在20 %乙醇中。根据本发明的琼脂凝胶微球的制备方法还包括步骤F，交联后琼脂凝胶微球的配基修饰，修饰琼脂凝胶微球的配基为多糖类、烷基类、羟基类、胺基类、羧基类、磺酸基类物质中的一种或几种。在一个本发明的实施例中，采用由加热釜、乳化-固化反应釜、交联修饰反应釜构成的乳化-固化反应装置制备琼脂凝胶微球，其中加热釜可实现边加热边放液，且放液的速度可控；乳化-固化反应釜具有高速乳化装置，且其温度在0 100°C温度范围内可控。根据本发明方法制备的琼脂凝胶微球呈规则球形，以琼脂凝胶微球总重量计，微球中琼脂含量为4 20wt%，优选为6 12wt%，更优选为8 12wt%。所述的琼脂凝胶微球的粒径在1 900 μ m范围内可控，且粒径上下差值不超过150 μ m的琼脂凝胶微球体积分数大于65%。根据本发明方法，以价格低廉的琼脂为原料制备琼脂凝胶裸球，可以通过调节温度、油相中表面活性剂的浓度、油相与水相的体积比、起始转速、最终转速和乳化时间，实现对所制备的琼脂凝胶微球的粒径及其均一性的控制；在转速控制过程中，维持转速的稳定增长，可以很好的改善琼脂凝胶微球的均一性，使所制得的琼脂凝胶微球的粒径分布在较窄的范围内；在降温过程中采取不同的降温方式可以获得不同孔径的微球，采用自然冷却的方式可得到孔径较大的微球，采用迅速冷却的方式可得到孔径较小的微球。与现有制备琼脂糖凝胶微球的技术相比，根据本发明方法制得的琼脂凝胶微球， 其明显的优点是凝胶微球呈规则球形，具有较窄的粒径分布，粒径在1 900 μ m范围内可控；同时，以本发明方法制得的琼脂凝胶微球中琼脂的浓度为4 20wt%，该凝胶微球具有机械强度好、热稳定性强、可再生等优点，可作为一种色谱介质，用于生化分离。琼脂本身带有负电基团，使其可直接用于阳离子交换或重金属离子吸附，同时可用于一些不受电荷影响的产物分离；此外，琼脂目前的市场价格只有琼脂糖价格的2. 5 4%，因此采用本发明方法制备琼脂凝胶微球，生产成本大大降低，且制备过程简单，对设备要求不高，耗能低，易于实现工业化生产。琼脂凝胶微球的制备方法可采用由加热釜、乳化-固化反应釜、交联修饰反应釜构成的乳化-固化反应装置进行制备。


图1为实施例1中制备的琼脂凝胶裸球的光学显微照片(放大倍数为400倍)。图2为实施例1中制备的琼脂凝胶裸球的粒径分布曲线。图3为实施例1中制备10%琼脂凝胶微球的压力-流速曲线。图4为实施例10中用寡聚环糊精修饰后的琼脂凝胶柱分离葛根粗品的色谱图。
具体实施例方式下面将结合实施例和附图来详细说明本发明，这些实施例和附图仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围。
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实施例实施例1 通过加热的方式制备200ml IOwt%的琼脂水溶液，在温度为70°C，初始搅拌转速为4500rpm的条件下，将琼脂水溶液趁热缓慢加入到600ml由84v%的环己烷和16v%司班 85按混合组成的油相中。在乳化过程中，调节增加搅拌转速，使最终搅拌转速为SOOOrpm， 持续搅拌15min，然后采用程序降温的方式使乳液冷却至室温，冷却过程中保持最终搅拌速度。将制得的琼脂凝胶裸球先后用水、50%乙醇、水洗净，采用OLYMPUS CX41(奥林巴斯有限公司,日本)光学显微镜观察产品形态，结果如图1所示；采用MASTERSUER 2000激光粒度分析仪(马尔文仪器公司，英国)分析产品的粒度，结果如图2所示。从图1中的光学显微照片(放大倍数为400倍)可以看出，按上述方法制备出的10%琼脂凝胶裸球球形规则， 粒径分布均一；图2中的粒径分布曲线显示按上述方法制备出的10%琼脂凝胶裸球粒径范围在45 160 μ m的凝胶裸球的体积分数为88. 5%。取200ml凝胶裸球，加入MOml蒸馏水后，放入35°C的水浴中，在160rpm的搅拌转速下，加入 28. Og Na2SO4,溶解 l.Oh，然后加入 anl 50% NaOH 和 2. 8g NaBH4,接着以 0. Iml/ min的速率加入96ml 50%的氢氧化钠和140ml环氧氯丙烷。增加水浴温度至50°C，并持续搅拌20h后，冷却至室温，再加入400ml蒸馏水，用60%醋酸调节pH至5 6。最后先后用水、50%乙醇、水洗净凝胶微球，保存在20%乙醇中，所制得的10%琼脂凝胶微球粒径分布与对应的琼脂凝胶裸球相同。将琼脂凝胶微球放入高压蒸汽灭菌锅内进行高温处理(121°C，25min)后，凝胶微球的球形不发生任何破坏。将制得的10%琼脂凝胶微球粒装入300X IOmm的凝胶色谱柱中，考察其压力与流速的关系，结果如图3所示。从图3中的压力-流速曲线可以看出，当流速从0. lml/min增加到0. 9ml/min时，柱压仅增加了约0. IMPa，说明根据本发明方法制得的琼脂凝胶微球球形规则，分布均一，在分离过程中产生的柱压较小，有利于工业化放大分离。实施例2 制备与实施例1相同的琼脂水溶液，在温度为72°C，初始搅拌转速为5000rpm的条件下，将琼脂水溶液趁热缓慢加入到800ml由82v%的环己烷和18v%司班85混合组成的油相中。在乳化过程中，调节增加搅拌转速，使最终搅拌转速为9500rpm，持续搅拌20min， 制得的产品采用与实施例1相同的方法冷却、洗净，并观察产品形态、分析产品粒度。结果表明，按此方法制备出的10%琼脂凝胶裸球球形规则，粒径范围在30 90 μ m的凝胶裸球的体积分数为81.2%。琼脂凝胶裸球的交联过程与实施例1不同的是搅拌转速为180rpm，Na2SO4用量为 32g，NaBH4用量为3. 2g，50% NaOH总加入量为130ml，环氧氯丙烷加入量为160ml，其他反应条件与实施例1相同，所制得的10%琼脂凝胶微球粒径分布与对应的琼脂凝胶裸球相同。将琼脂凝胶微球放入高压蒸汽灭菌锅内进行高温处理(12rC，25min)后，凝胶微球的球形不发生任何破坏。实施例3 制备与实施例1相同的琼脂水溶液，在温度为68°C，初始搅拌转速为1 IOOrpm的条件下，将琼脂水溶液趁热缓慢加入到400ml由86v%的环己烷和14v%司班85混合组成的油相中。在乳化过程中，调节增加搅拌转速，使最终搅拌转速为ISOOrpm，持续搅拌25min， 制得的产品采用与实施例1相同的方法冷却、洗净，并观察产品形态、分析产品粒度。结果表明，按此方法制备出的10%琼脂凝胶裸球球形规则，粒径范围在450 600 μ m的凝胶裸球的体积分数为80.5%。琼脂凝胶裸球的交联过程与实施例1不同的是搅拌转速为140rpm，Na2SO4用量为 24g, NaBH4用量为2. 4g，50 % NaOH总加入量为90ml，环氧氯丙烷加入量为120ml，其他反应条件与实施例1相同，所制得的10%琼脂凝胶微球粒径分布与对应的琼脂凝胶裸球相同。将交联后的琼脂凝胶微球放入高压蒸汽灭菌锅内进行高温处理(12rC，25min) 后，凝胶微球的球形不发生任何破坏。实施例4 采用与实施例1相同的方式制备12%的琼脂水溶液，在温度为75°C，初始搅拌转速为6000rpm的条件下，将琼脂水溶液趁热缓慢加入到IOOOml由80v %的环己烷和 20v%司班85混合组成的油相中。在乳化过程中，调节增加搅拌转速，使最终搅拌转速为 IOOOOrpm，持续搅拌30min，制得的产品采用与实施例1相同的方法冷却、洗净，并观察产品形态、分析产品粒度。结果表明，按此方法制备出的12%琼脂凝胶裸球球形规则，粒径范围在150 250 μ m的凝胶裸球的体积分数为80. 2%。琼脂凝胶裸球的交联过程与实施例1不同的是将凝胶裸球加入蒸馏水后，放入 30°C水浴中，搅拌转速为200rpm，Na2SO4用量为36g，NaBH4用量为3. 6g,50% NaOH总加入量为140ml，环氧氯丙烷加入量为160ml，增加水浴温度至70°C，其他反应条件与实施例1相同，所制得的12 %琼脂凝胶微球粒径分布与对应的琼脂凝胶裸球相同。将交联后的琼脂凝胶微球放入高压蒸汽灭菌锅内进行高温处理(12rC，25min) 后，凝胶微球的球形不发生任何破坏。实施例5 采用与实施例1相同的方式制备15%的琼脂水溶液，在温度为80°C，初始搅拌转速为6000rpm的条件下，将琼脂水溶液趁热缓慢加入到1600ml由80v %的环己烷和 20v%司班80混合组成的油相中。在乳化过程中，调节增加搅拌转速，使最终搅拌转速为 IOOOOrpm，持续搅拌20min，制得的产品采用与实施例1相同的方法冷却、洗净，并观察产品形态、分析产品粒度。结果表明，按此方法制备出的15%琼脂凝胶裸球球形规则，粒径范围在300 400 μ m的凝胶裸球的体积分数为65. 4%。琼脂凝胶裸球的交联过程与实施例1不同的是将凝胶裸球加入蒸馏水后，放入 30°C水浴中，搅拌转速为200rpm，Na2SO4用量为40g，NaBH4用量为4. Og,50% NaOH总加入量为160ml，环氧氯丙烷加入量为180ml，增加水浴温度至70°C，其他反应条件与实施例1相同，所制得的15 %琼脂凝胶微球粒径分布与对应的琼脂凝胶裸球相同。将交联后的琼脂凝胶微球放入高压蒸汽灭菌锅内进行高温处理(12rC，25min) 后，凝胶微球的球形不发生任何破坏。实施例6 采用与实施例1相同的方式制备20%的琼脂水溶液，在温度为80°C，初始搅拌转速为6000rpm的条件下，将琼脂水溶液趁热缓慢加入到2000ml由80v %的环己烷和 20v%司班80混合组成的油相中。在乳化过程中，调节增加搅拌转速，使最终搅拌转速为IOOOOrpm，持续搅拌15min，制得的产品采用与实施例1相同的方法冷却、洗净，并观察产品形态、分析产品粒度。结果表明，按此方法制备出的20%琼脂凝胶裸球球形规则，粒径范围在500 μ m以上的凝胶裸球的体积分数为65. 3%。琼脂凝胶裸球的交联过程与实施例1不同的是将凝胶裸球加入蒸馏水后，放入 30°C水浴中，搅拌转速为200rpm，Na2SO4用量为50g，NaBH4用量为4. Og,50% NaOH总加入量为160ml，环氧氯丙烷加入量为180ml，增加水浴温度至70°C，其他反应条件与实施例1相同，所制得的20 %琼脂凝胶微球粒径分布与对应的琼脂凝胶裸球相同。将交联后的琼脂凝胶微球放入高压蒸汽灭菌锅内进行高温处理(12rC，25min) 后，凝胶微球的球形不发生任何破坏。实施例7 采用与实施例1相同的方式制备8%的琼脂水溶液，在温度为65°C，初始搅拌转速为IOOOrpm的条件下，将琼脂水溶液趁热缓慢加入到300ml由86v%的环己烷和14v%司班85混合组成的油相中。在乳化过程中，调节增加搅拌转速，使最终搅拌转速为1500rpm， 持续搅拌lOmin，制得的产品采用与实施例1相同的方法冷却、洗净，并观察产品形态、分析产品粒度。结果表明，按此方法制备出的8%琼脂凝胶裸球球形规则，粒径范围在100 250 μ m的凝胶裸球的体积分数为80. 2%。琼脂凝胶裸球的交联过程与实施例1不同的是将凝胶裸球加入蒸馏水后，放入 25°C水浴中，搅拌转速为120rpm, Na2SO4用量为20g, NaBH4的用量为2. Og, 50% NaOH总加入量为80ml，环氧氯丙烷加入量为100ml，增加水浴温度至45°C，其他反应条件与实施例1 相同，所制得的8 %琼脂凝胶微球粒径分布与对应的琼脂凝胶裸球相同。 将交联后的琼脂凝胶微球放入高压蒸汽灭菌锅内进行高温处理(121°C，25min) 后，凝胶微球的球形不发生任何破坏。实施例8 采用与实施例1相同的方式制备6 %的琼脂水溶液，在温度为55°C，初始搅拌转速为800rpm的条件下，将琼脂水溶液趁热缓慢加入到300ml由88v%的环己烷和12v%吐温80混合组成的油相中。在乳化过程中，调节增加搅拌转速，使最终搅拌转速为1200rpm， 持续搅拌5min，制得的产品采用与实施例1相同的方法冷却、洗净，并观察产品形态、分析产品粒度。结果表明，按此方法制备出的6%琼脂凝胶裸球球形规则，粒径范围在150 250 μ m的凝胶裸球的体积分数为76. 8%。琼脂凝胶裸球的交联过程与实施例1不同的是将凝胶裸球加入蒸馏水后，放入 25°C水浴中，搅拌转速为120rpm, Na2SO4用量为16. Og, NaBH4的用量为1. 6g,50% NaOH总加入量为60ml，环氧氯丙烷加入量为90ml，增加水浴温度至45°C，其他反应条件与实施例1 相同，所制得的6%琼脂凝胶微球粒径分布与对应的琼脂凝胶裸球相同。将交联后的琼脂凝胶微球放入高压蒸汽灭菌锅内进行高温处理(12rC，25min) 后，凝胶微球的球形不发生任何破坏。实施例9 采用与实施例1相同的方式制备4%的琼脂水溶液，在温度为50°C，初始搅拌转速为500rpm的条件下，将琼脂水溶液趁热缓慢加入到200ml由90v%的环己烷和10v%吐温80混合组成的油相中。在乳化过程中，调节增加搅拌转速，使最终搅拌转速为lOOOrpm，
9持续搅拌lmin，制得的产品采用与实施例1相同的方法冷却、洗净，并观察产品形态、分析产品粒度。结果表明，按此方法制备出的4%琼脂凝胶裸球球形规则，粒径范围在100 200 μ m的凝胶裸球的体积分数为75. 8%。琼脂凝胶裸球的交联过程与实施例1不同的是将凝胶裸球加入蒸馏水后，放入 25°C水浴中，搅拌转速为IOOrpm, Na2SO4用量为16. 0g, NaBH4的用量为1. Og,50% NaOH总加入量为60ml，环氧氯丙烷加入量为90ml，增加水浴温度至45°C，其他反应条件与实施例1 相同，所制得的4%琼脂凝胶微球粒径分布与对应的琼脂凝胶裸球相同。将交联后的琼脂凝胶微球放入高压蒸汽灭菌锅内进行高温处理(12rC，25min) 后，凝胶微球的球形不发生任何破坏。实施例10 (1)寡聚环糊精(poly-β-Ο))的制备。将95ml 50%的NaOH,95ml水和0. 2g NaBH4混合后加入90g β -环糊精，在转速为500rpm条件下持续搅拌12h。然后加入30ml水，以降低反应液的黏度，接着加入62. 5ml 环氧氯丙烷，在30°C，IOOOrpm条件下搅拌4h。接着加入IOOml丙酮以终止反应，然后用 6mol/L的HCl调节pH至12左右。然后升高温度至50°C，搅拌6h后，用lmol/L的HCl调节PH至7。将反应液过夜后，加入3倍体积蒸馏水稀释后，用分子量为3000和10000的超滤膜除去反应液中分子量大于10000的大分子和分子量小于3000的小分子，将剩余的溶液干燥、粉碎，制得寡聚环糊精。(2) poly- β -CD-agar 凝胶柱的制备将实施例1中制备的10%琼脂凝胶用100目和250目的金属筛筛选后，得到60 150 μ m范围内的琼脂凝胶微球。取出25ml筛选后的琼脂凝胶微球，用上述过程制备的寡聚环糊精对其进行修饰，其方法如下在25ml琼脂凝胶微球中加入2g寡聚环糊精和35ml水，在35°C，200rpm条件下加 Λ 3. 875g Na2SO4搅拌溶解lh，然后加入Iml 50% NaOH和0. 3g NaBH4,接着分别以7ml/h 和9ml/h的速率加入50% NaOH和环氧氯丙烷，持续滴加105min后，升高温度至50°C，搅拌 18h后，加入50ml水，用60% HAc调节pH至5 6。最后用50%乙醇和水交替洗净后，将制得的poly- β -CD-agar凝胶装入300 X IOmm的凝胶色谱柱中。(3)将上述poly- β -⑶-agar凝胶柱用于葛根粗品的分离。分离结果如图4，其分离条件为流动相-0 68min :0. 5%醋酸，68 Iianin 体积比为1 1的甲醇和0. 5%醋酸的混合溶液，112min以后0. 5%醋酸；流速-lml/min ；样品-2mg/ml的葛根粗品；上样量-300 μ L。从图4可以看出，采用10% poly- β -CD-agar凝胶柱对葛根粗品中的葛根素能实现很好的分离。对比例1 与实施例1不同的是，将琼脂水溶液趁热缓慢加入到200ml由94v%的环己烷和 6v%司班85混合组成的油相中，反应过程中的初始搅拌转速为SOOrmp，最终搅拌转速为 1500rmp，其他反应条件与实施例1相同，制得的产品采用与实施例1相同的方法洗净，并观察产品形态、分析产品粒度。结果表明，按此方法进行制备，琼脂凝胶不成球，产品大小分布不均勻。对比例2:
与实施例1不同的是，将琼脂水溶液趁热缓慢加入到400ml由92v%的环己烷和 8v%司班85混合组成的油相中，反应过程中维持搅拌转速为1500rmp，其他反应条件与实施例1相同，制得的产品采用与实施例1相同的方法洗净，并观察产品形态、分析产品粒度。 结果表明，按此方法制备，琼脂凝胶部分成球，球形不规则，分布不均一。由实施例1、对比例1和对比例2可以看出，当增加油相与水相的体积比、油相中表面活性剂浓度以及起始转速等条件时，可以增加琼脂凝胶的成球率。
权利要求
1.一种琼脂凝胶微球的制备方法，包括步骤A，将琼脂溶于水制成水相W，其中水相中琼脂的含量为4 20wt % ；步骤B，将油溶性表面活性剂溶于与水互不相容的有机溶剂中制成油相0，其中在油相中含有体积比为10 20%的油溶性表面活性剂；步骤C，将水相加入油相进行分散乳化得到W/0型乳滴，其中油相与水相的体积比为1 1 10 1;步骤0， W/0型乳滴经冷却固化得到琼脂凝胶裸球；步骤E，琼脂凝胶裸球经化学交联得到琼脂凝胶微球。
2.根据权利要求1所述的琼脂凝胶微球的制备方法，其特征在于步骤A所述的水相中琼脂的含量为6 12wt%，优选为8 12wt%。
3.根据权利要求1或2所述的琼脂凝胶微球的制备方法，其特征在于步骤C中油相与水相的体积比为1.5 1 5 1。
4.根据权利要求1 3中任意一项所述的琼脂凝胶微球的制备方法，其特征在于 步骤C中水相与油相通过均质乳化器进行乳化，其中均质乳化器的起始转速为500 6000rpm，最终转速为1000 lOOOOrpm，反应过程中均质乳化器的转速维持稳定增长。
5.根据权利要求4所述的琼脂凝胶微球的制备方法，其特征在于乳化反应时间为 1 30mino
6.根据权利要求1所述的琼脂凝胶微球的制备方法，其特征在于步骤D中均质乳化器的转速维持在1000 lOOOOrpm。
7.根据权利要求1所述的琼脂凝胶微球的制备方法，其特征在于步骤E包括在碱性条件下，以环氧氯丙烷作交联剂，将琼脂凝胶裸球进行交联，交联反应温度为25 60°C，浓度为20 60wt%的NaOH的加入量为琼脂凝胶体积量的0. 3 0. 8倍，环氧氯丙烷的加入量为琼脂凝胶体积量的0. 45 0. 9倍。
8.根据权利要求1所述的琼脂凝胶微球的制备方法，其特征在于琼脂凝胶微球的制备方法还包括步骤F，交联后琼脂凝胶微球的配基修饰，修饰琼脂凝胶微球的配基为多糖类、烷基类、羟基类、胺基类、羧基类、磺酸基类物质中的一种或几种。
9.一种根据权利要求1 7中任意一项所述的制备方法制备的琼脂凝胶微球，其特征在于所述琼脂凝胶微球呈规则球形，以琼脂凝胶微球总重量计，微球中琼脂含量为4 20wt%，优选为6 12wt%，更优选为8 12wt%。
10.根据权利要求8或9所述的琼脂凝胶微球，其特征在于所述的琼脂凝胶微球的粒径在1 900 μ m范围内可控，且粒径上下差值不超过150 μ m的琼脂凝胶微球体积分数大于 65%。
全文摘要
本发明涉及一种琼脂凝胶微球的制备方法，该方法以琼脂为原料，经油相和水相的制备、分散乳化、冷却固化、交联以及配基修饰过程制得琼脂含量为4～20wt％的呈规则球形，粒径均一，且在1～900μm范围内可控的琼脂凝胶微球，该琼脂凝胶微球机械强度好、热稳定性高、可再生性强，且成本低廉，可用作分离介质。该方法操作过程简单，对设备要求低，耗能少，能实现工业化制备。
文档编号B01J13/02GK102389755SQ20111022032
公开日2012年3月28日 申请日期2011年8月2日 优先权日2011年8月2日
发明者杨自信, 胡瑜, 谭天伟, 陈艳敏, 魏军 申请人:北京化工大学