专利名称：一种天然产物的分离方法
技术领域：
本发明涉及一种天然产物的分离方法。
背景技术：
天然来源成分的分离与制备一直是中药及天然药物研究过程中的一大瓶颈。由于天然产物是复杂体系，通常一个样品中包含了几十甚至几百种组分，而各组分之间量的差别通常又很大。因此，为了达到成分分离的目的，往往要结合多种色谱填料，进行反复的柱色谱分离操作。这一过程是繁琐、漫长而枯燥的首先用柱色谱对天然产物提取物进行分离并对分离的流份进行分段收集，通过TLC检测确定所需合并的流份，浓缩后再根据情况进行进一步的色谱柱分离(有时可能需要多次重复上述过程)。在这一过程中，涉及到溶剂浓缩和样品转移的操作，溶剂的浓缩不但耗时耗能，而且往往由于加热而使不稳定的结构发生变化；样品的转移过程也伴随样品的损失。最终，难以分离的样品用制备型高效液相进行分离，该工艺首先要将固体样品以合适的溶剂溶解，但对固体样品有较好溶解度的溶剂具往往有较强的溶剂效应，会大大降低制备型高效液相的分离效果；而溶剂效应弱的溶剂往往难以溶解固体样品。综上，采用传统的方法对天然产物分离制备，天然产物往往在冗长、 繁多的柱色谱分离、溶剂浓缩、样品转移和样品溶解操作中受到损失或者结构发生变化，研究者不得不加大投料量以求获得理想的结果。因此，如何最大限度减少人工操作、实现自动化分离，以提高效率、突破传统方法所形成的瓶颈，显得迫在眉睫。二维液相色谱是在高效液相色谱基础上发展起来的一项技术，它通过在技术上及设备上的改进，组合不同的分离模式构建二维系统。与一维液相色谱系统相比，二维液相色谱主要的优势在于提供了更大的峰容量，从而能够较有效地解决复杂体系样品的分析问题 (吴剑威，等.多维液相色谱及其在中药研究中的应用.中草药，2010，41 (6) :1020-1023)。现有的二维液相色谱技术虽然能够满足分析的需求，却无法直接应用于成分的分离制备。这是由于分离制备操作过程中需要处理的更大样品量，需要经过体积更大的流动相。分析操作时，样品进样量较低，一般为20 μ I ( μ g级别)，因此一般选择较小规模的分析液相色谱柱；而在制备操作中，一般要选择能处理更大样品量的中低压色谱柱。另外，分析过程中，由流动相所带来的溶剂效应，通过降低一维色谱流速、减少二维色谱的进样量的处理，基本可以忽略。但在制备色谱中，溶剂效应问题是必须要解决的，现有的二维液相色谱技术无法解决上述问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种天然产物的分离方法，以解决现有技术中存在的上述问题。本发明包括以下步骤I)上样工段将待分离的天然产物提取物溶液直接进样至第一维液相色谱柱，或将待分离的天然产物提取物溶液加入拌样填料中，搅拌均匀，干燥后加至所述第一维液相色谱柱的顶端;2)第一维液相色谱分离工段以第一维洗脱液对已上样的第一维液相色谱柱进行洗脱，所述第一维洗脱液通过第一维输液泵泵入第一维液相色谱柱中；3)第一维液相色谱柱洗脱液的稀释流经第一维液相色谱柱的洗脱液，在设于第一维液相色谱柱后的混合器内与稀释液进行混合，所述稀释液为对第一维液相色谱柱具有弱流脱能力的溶剂，通过稀释液加注泵泵入所述混合器中；4)稀释液的分段富集第一维液相色谱柱的洗脱液，经步骤3)稀释后，在切换阀的控制下，分段送入至少I个富集柱进行富集，每一次流过富集柱的第一维液相色谱柱洗脱液的体积为所述富集柱柱体积的O. 5 5倍；5)富集柱上富集物的洗脱分段富集在富集柱中的富集物，在所述切换阀的控制下，分段被第二维洗脱液洗脱，送入第二维液相色谱柱进行进一步的分离；6)第二维液相色谱分离工段以第二维洗脱液，对送入的第二维液相色谱柱的样品进行洗脱，所述第二维洗脱液通过第二维输液泵泵入该第二维液相色谱柱中，流出液通过检测器进行图谱检测，根据图谱收集相应色谱峰的流份。在步骤I)中，所述第一维液相色谱柱可采用中低压液相色谱柱；所述第一维液相色谱柱优选使用含水体系流动相的色谱填料，进一步优选为反相碳-18填料(ODS)。在步骤2)中，所述第一维输液泵可采用中低压泵。在步骤3)中，所述第一维液相色谱柱优选使用含水体系流动相的色谱填料，进一步优选为反相碳-18填料(ODS);所述稀释液可采用水；所述洗脱液与稀释液的体积比可为 I (O. 3 3)。在步骤4)中，所述切换阀可采用至少I个二位多通阀或多位阀；所述富集柱优选使用含水体系流动相的色谱填料，进一步优选为反相碳-18填料(ODS);所述富集柱的柱体积可为第一维液相色谱柱柱体积的O. I O. 5倍。在步骤5)中，所述第二维液相色谱柱可采用制备高效液相色谱柱。在步骤6)中，所述第二维输液泵可采用高压泵。在天然产物的分离方法中，样品首先经第一维液相色谱(优选中低压色谱)单元分离，分离流份与稀释液加注泵泵出的稀释液混合后，分段送入由切换阀控制的富集柱富集，富集柱中保留的样品，在切换阀的控制下，分段由第二维液相色谱(制备液相)泵送入制备液相色谱柱进行进一步的分离。通过该天然产物的分离方法，可实现复杂样品的自动化分离操作，具有分离效率高、峰容量大、操作简便等优点，能够极大节省人力和时间。本发明的分离过程采用中低压液相X制备型高效液相的全二维液相色谱方法， 可以很好地解决现有技术所存在的缺点，既保留了中低压液相的大容量样品制备能力，又保证了制备高效液相色谱的高效分离能力，减少了大量的中间处理环节。
图I为本发明实施例采用的分离装置结构组成示意图。在图I中，各标记为1、第一维输液泵；2、第一维液相色谱柱；3、稀释液加注泵；4、混合器；51、切换阀；6、富集柱；7、 第二维输液泵；8、第二维液相色谱柱；9、检测器。图2为实施例I采用的分离装置结构组成示意图。在图2中，各标记为1、第一维输液泵(高压)；2、第一维液相色谱柱(高压)；3、稀释液加注泵(高压)；4、混合器；52、二位六通阀；6、富集柱；7、第二维输液泵(高压)；8、第一维液相色谱柱(制备高效液相色谱柱)；9、检测器；11、第一维洗脱液；12、稀释液；13、第二维洗脱液。图3为实施例I的液相图谱。在图3中，横坐标为时间(min)，纵坐标为谱峰强度。图4为实施例2采用的分离装置结构组成示意图。在图4中，各标记为1、第一维输液泵(中低压)；2、第一维液相色谱柱(中低压)；3、稀释液加注泵(中低压)；4、混合器；53、二位十通阀；61、第一富集柱；62、第二富集柱；7、第二维输液泵(高压)；8、第一维液相色谱柱(制备高效液相色谱柱)；9、检测器；11、第一维洗脱液；12、稀释液；13、第二维洗脱液。图5为实施例2的液相图谱。在图5中，横坐标为时间(min)，纵坐标为谱峰强度。图6为实施例3采用的分离装置结构组成示意图。在图6中，各标记为1、第一维输液泵(中低压)；2、第一维液相色谱柱(中低压)；3、稀释液加注泵(中低压)；4、混合器；54、多位阀；6、富集柱；7、第二维输液泵(高压)；8、第一维液相色谱柱(制备高效液相色谱柱)；9、检测器；11、第一维洗脱液；12、稀释液；13、第二维洗脱液。图7为实施例3的液相图谱。在图7中，横坐标为时间(min)，纵坐标为谱峰强度。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明做进一步的描述，但不构成对本发明的任何限制。图I给出本发明实施例采用的分离装置结构组成示意图。在图I中，各标记为1、 第一维输液泵；2、第一维液相色谱柱；3、稀释液加注泵；4、混合器；51、切换阀；6、富集柱； 7、第二维输液泵；8、第二维液相色谱柱；9、检测器。实施例I一种天然产物的分离制备方法，分离过程采用高压液相X制备型高效液相的全二维液相色谱方法，所述第一维液相色谱和第二维液相色谱间的切换阀为手动二位六通阀，其连接方式如图2所示，在图2中，各标记为1、第一维输液泵(高压)；2、第一维液相色谱柱(高压)；3、稀释液加注泵(高压)；4、混合器；52、二位六通阀；6、富集柱；7、第二维输液泵(高压)；8、第一维液相色谱柱(制备高效液相色谱柱)；9、检测器；11、第一维洗脱液；12、稀释液；13、第二维洗脱液。样品溶液大黄水提取物500mg，溶解于Iml水中。(I)上样工段取上述大黄水提取物的水溶液，直接进样至第一维液相色谱柱。(2)第一维液相色谱分离工段■第一维输液泵高压泵。
■色谱柱制备高效液相色谱柱，Φ2αιιΧ25αιι(柱体积78. 5ml)，填料为粒径 5 μ m 的 ODS。■流动相30%— 60%的甲醇/水梯度洗脱，共洗脱800ml，流速，O. 5ml/min。(3)第一维液相色谱柱洗脱液的稀释。■稀释液水。■混合比例1 : 2 (稀释液加注泵流速lml/min)。(4)稀释液的分段富集■切换阀手控二位六通阀■富集柱 个数1个 柱体积第二维液相色谱柱体积O. 14倍(Φ 3cmX I. 5cm, 10. 6ml) 填料5 μ m 的 ODS■分段富集周期第一维液相色谱柱的洗脱液每30ml (约富集柱柱体积的3倍) 通过富集柱分段富集。(5)富集柱上富集物的洗脱富集在富集柱中的富集物，通过手动切换二位六通阀的通路，关闭第一维输液泵， 开启第二维输液泵，被第二维洗脱液洗脱，送入第二维液相色谱柱进行进一步的分离。(6)第二维液相色谱分离工段■第二维输液泵高压泵■色谱柱制备高效液相色谱柱，Φ2αιιΧ15αιι(柱体积78. 5ml)，填料为粒径 5 μ m 的 ODS■流动相20%— 40%的乙腈/水梯度洗脱，60min/次,流速，8ml/min■检测器DAD检测器完成I个富集样品的分离后，手动切换二位六通阀的通路，开启第一维输液泵，关闭第二维输液泵，重复工段2 6的操作，直到样品被洗脱完全，所得到的液相图谱(第I 7次分离)如图3所示。实施例2一种天然产物的分离制备方法，分离过程采用中低压液相X制备型高效液相的全二维液相色谱方法，所述一维液相色谱和第二维液相色谱间的切换阀为电控二位十通阀，其连接方式如图4所示，在图4中，各标记为1、第一维输液泵(中低压)；2、第一维液相色谱柱(中低压)；3、稀释液加注泵(中低压)；4、混合器；53、二位十通阀；61、第一富集柱；62、第二富集柱；7、第二维输液泵(高压)；8、第一维液相色谱柱(制备高效液相色谱柱)；9、检测器；11、第一维洗脱液；12、稀释液；13、第二维洗脱液。样品溶液大黄水提取物500mg，溶解于Iml水中。(I)上样工段取上述大黄水提取物的水溶液，拌于I. Og的聚酰胺填料中，搅拌均匀，蒸干溶剂， 上样至第一维液相色谱柱的顶端。(2)第一维液相色谱分离工段■第一维输液泵中低压输液泵
■色谱柱Φ2. 2cmX20cm的中低压柱，以粒径100目的聚酰胺填充■流动相水％— 100%的甲醇/水梯度洗脱，共洗脱1000ml，流速，O. 3ml/min(3)第一维液相色谱柱洗脱液的稀释■稀释液冰■混合比例1 : O. 3 (稀释液加注泵流速0. lml/min)。(4)稀释液的分段切割与富集■切换阀电控二位十通阀■富集柱 个数2个 柱体积约第二维液相色谱柱体积的O. 5倍(Φ 3cmX 5cm, 35. 3ml) 填料5 μ M 的 ODS■分段富集周期第一维液相色谱柱的洗脱液每18ml (约富集柱柱体积的O. 5 倍)通过富集柱分段富集。(5)富集柱上富集物的洗脱富集在富集柱中的富集物，通过切换二位十通阀的通路，被第二维洗脱液洗脱，送入第二维液相色谱柱进行进一步的分离。(6)第二维液相色谱分离工段■第二维输液泵高压泵。■色谱柱制备高效液相色谱柱，Φ2αιιΧ25αιι(柱体积78. 5ml)，填料为粒径 5 μ m 的 ODS。■流动相30%— 70%的甲醇/水梯度洗脱，60min/次,流速,8ml/min。■检测器DAD检测器。该工段段进行的同时，另一支富集柱同时对由第一维液相色谱洗脱下来的样品进行富集。完成I个富集样品的分离后，切换二位十通阀的通路，重复工段2 6的操作，直到样品被洗脱完全，所得到的液相图谱(第I 7次分离)如图5所示。实施例3一种天然产物的分离制备方法，分离过程采用中低压液相X制备型高效液相的全二维液相色谱方法，所述一维液相色谱和第二维液相色谱间的切换阀为一对同步切换的六位阀，其连接方式如图6所示，在图6中，各标记为1、第一维输液泵(中低压)；2、第一维液相色谱柱(中低压)；3、稀释液加注泵(中低压)；4、混合器；54、多位阀；6、富集柱；7、 第二维输液泵(高压)；8、第一维液相色谱柱(制备高效液相色谱柱)；9、检测器；11、第一维洗脱液；12、稀释液；13、第二维洗脱液。样品溶液蟾酥甲醇提取物200mg，溶解于Iml甲醇中。(I)上样工段取上述蟾酥甲醇提取物的甲醇溶液，拌于I. Og的ODS填料中，搅拌均匀，蒸干溶剂，上样至第一维液相色谱柱的顶端。(2)第一维液相色谱分离工段■第一维输液泵中低压输液泵。
■色谱柱Φ IcmX 20cm的中低压柱，以粒径75 μ M的ODS填充。■流动相50%— 100%的甲醇/水梯度洗脱，共洗脱400ml，流速，O. lml/min。(3)第一维液相色谱柱洗脱液的稀释■稀释液水。■混合比例1 : 3 (稀释液加注泵流速0. 3 ml/min)。(4)稀释液的分段切割与富集■切换阀一对电控六位阀，同步切换。■富集柱。 个数6 个。 柱体积第二维液相色谱柱体积O. I倍(Φ IcmX I. 5cm, I. 18ml)。 填料5μπι 的 0DS。■分段富集周期第一维液相色谱柱的洗脱液每6ml (约富集柱柱体积的5倍)通过富集柱分段富集。完成一次富集后切换一次流路，继续下一次富集直到完成6次富集，或进行洗脱。(5)富集柱上富集物的洗脱完成6次富集后，关闭第一维输液泵，开启第二维输液泵，以第二维洗脱液洗脱， 分次送入第二维液相色谱柱进行进一步的分离。(6)第二维液相色谱分离工段■第二维输液泵高压泵。■色谱柱制备高效液相色谱柱，Φ IcmX 15cm(柱体积11. 8ml)，填料为粒径
5μ m 的 ODS。■流动相0 —30min 28 % — 54 % 乙腈，30min — 60min 54% 乙腈洗脱，流速， 2ml/min。■检测器DAD检测器。完成6个富集样品的分离后，切换多位阀的通路，重复工段6的操作，完成6次富集样品的分离后，重复工段2 6的操作，直到样品被洗脱完全，所得到的液相图谱(第I 7次分离)如图7所示。本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种天然产物的分离方法，其特征在于包括以下步骤1)上样工段将待分离的天然产物提取物溶液直接进样至第一维液相色谱柱，或将待分离的天然产物提取物溶液加入拌样填料中，搅拌均匀，干燥后加至所述第一维液相色谱柱的顶端；2)第一维液相色谱分离工段以第一维洗脱液对已上样的第一维液相色谱柱进行洗脱，所述第一维洗脱液通过第一维输液泵泵入第一维液相色谱柱中；3)第一维液相色谱柱洗脱液的稀释流经第一维液相色谱柱的洗脱液，在设于第一维液相色谱柱后的混合器内与稀释液进行混合，所述稀释液为对第一维液相色谱柱具有弱流脱能力的溶剂，通过稀释液加注泵泵入所述混合器中；4)稀释液的分段富集第一维液相色谱柱的洗脱液，经步骤3)稀释后，在切换阀的控制下，分段送入至少I个富集柱进行富集，每一次流过富集柱的第一维液相色谱柱洗脱液的体积为所述富集柱柱体积的O. 5 5倍；5)富集柱上富集物的洗脱分段富集在富集柱中的富集物，在所述切换阀的控制下，分段被第二维洗脱液洗脱，送入第二维液相色谱柱进行进一步的分离；6)第二维液相色谱分离工段以第二维洗脱液，对送入的第二维液相色谱柱的样品进行洗脱，所述第二维洗脱液通过第二维输液泵泵入该第二维液相色谱柱中，流出液通过检测器进行图谱检测，根据图谱收集相应色谱峰的流份。
2.如权利要求I所述的一种天然产物的分离方法，其特征在于在步骤I)中，所述第一维液相色谱柱采用中低压液相色谱柱；所述第一维液相色谱柱使用含水体系流动相的色谱填料，优选反相碳-18填料。
3.如权利要求I所述的一种天然产物的分离方法，其特征在于在步骤2)中，所述第一维输液泵采用中低压泵。
4.如权利要求I所述的一种天然产物的分离方法，其特征在于在步骤3)中，所述第一维液相色谱柱使用含水体系流动相的色谱填料，优选反相碳-18填料。
5.如权利要求I所述的一种天然产物的分离方法，其特征在于在步骤3)中，所述稀释液采用水；所述洗脱液与稀释液的体积比为I : O. 3 3。
6.如权利要求I所述的一种天然产物的分离方法，其特征在于在步骤4)中，所述切换阀采用至少I个二位多通阀或多位阀。
7.如权利要求I所述的一种天然产物的分离方法，其特征在于在步骤4)中，所述富集柱使用含水体系流动相的色谱填料，优选反相碳-18填料。
8.如权利要求I所述的一种天然产物的分离方法，其特征在于在步骤4)中，所述富集柱的柱体积为第一维液相色谱柱柱体积的O. I O. 5倍。
9.如权利要求I所述的一种天然产物的分离方法，其特征在于在步骤5)中，所述第二维液相色谱柱采用制备高效液相色谱柱。
10.如权利要求I所述的一种天然产物的分离方法，其特征在于在步骤6)中，所述第二维输液泵采用高压泵。
全文摘要
一种天然产物的分离方法，涉及一种天然产物的分离方法。上样工段，第一维液相色谱分离工段，第一维液相色谱柱洗脱液的稀释，稀释液的分段富集，富集柱上富集物的洗脱，第二维液相色谱分离工段。分离过程采用中低压液相×制备型高效液相的全二维液相色谱方法，可以很好地解决现有技术所存在的缺点，既保留了中低压液相的大容量样品制备能力，又保证了制备高效液相色谱的高效分离能力，减少了大量的中间处理环节。
文档编号B01D15/10GK102580352SQ20121002209
公开日2012年7月18日 申请日期2012年1月31日 优先权日2012年1月31日
发明者丘鹰昆, 吴振, 庄萍, 陈琳 申请人:厦门大学