专利名称：一种磁性介孔二氧化钛核壳式复合微球及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于功能材料技术领域，具体涉及一种磁性介孔二氧化钛核壳式复合微球及其制备方法和应用。
背景技术：
近年来，多功能的磁性复合微球受到人们的广泛关注。由于磁性复合微球同时具有无机磁性物质的磁性以及表面物质的功能性，可以在磁场的作用下快速、方便、高效地分离目标生物活性分子，从而在细胞分离、蛋白质和多肽的分离和纯化、靶向药物传递等领域有良好的应用前景。从应用的角度考虑，对于蛋白质和多肽的分离和纯化来讲，理想的磁性微球应该同时具有规整的核壳结构、表面富含功能基团、高磁响应性、尺寸均一等特性。目前，对于磷酸肽选择性富集的常用手段是用固定化金属离子(IMAC),例如固定Fe3+、Ti4+、Zr4+等。近年来研究发现一些金属氧化物，例如二氧化钛、二氧化锆以及二氧化铪等比常用的IMAC具有更好的选择性。而最近几年介孔二氧化钛更是由于其相比实心二氧化钛具有更好的选择性和更大的富集容量而倍受青睐。然而目前用于制备介孔二氧化钛的方法都需要通过使用类似模板法的方法来产生孔，而这样会使得形成的介孔二氧化钛微球的纯度不高，会因含有其他一些杂质从而导致选择性下降；另外这些介孔二氧化钛微球由于都没有含有磁性核，因此其需要很高的离心转速进行分离，分离相对比较繁琐并且在此过程中可能会使得一些大分子量的蛋白或多肽一起共沉淀下来。因此发明新的方法制备以高磁响应性磁核为核、100%纯度的介孔二氧化钛为壳的磁性二氧化钛微球对于能够更好的对于实际样品中极低浓度的磷酸肽进行选择性富集是十分必要的。
发明内容
本发明的目的在于提出一种制备过程简单、可控的，能够高磁响应性的，壳层具有介孔和高结晶性结构的核壳式磁性介孔二氧化钛复合微球及其制备方法，并将该微球用于富集和分离生物样本中极低浓度的磷酸肽。本发明针对背景技术中所存在的问题，提出了一种以磁性纳米晶团簇为核，具有介孔和结晶结构的纯二氧化钛为壳的磁性介孔二氧化钛核壳式复合微球。该复合微球的制备方法的具体步骤为
1、首先，以六水合三氯化铁、醋酸盐和含大量羧基的物质为原料制备表面羧基稳定的磁性纳米粒子团簇(简称磁簇);
2、接着，使用溶胶凝胶法在磁簇表面包覆一层无定型的二氧化钛壳层得到磁性二氧化钛核壳式复合微球；
3、最后，通过水热处理上述步骤得到的产物，得到以磁簇为核、具有介孔和结晶结构的二氧化钛为壳的磁性介孔二氧化钛核壳式复合微球。本发明上述步骤的具体操作如下步骤I.将0. 6-5. 4g六水合三氯化铁、I. 2-16g醋酸盐和0. 2-2g含大量羧基的物质溶解在20-80mL乙二醇中，在20-170°C下机械搅拌0. 5_2h，然后置于含有聚四氟乙烯内衬的不锈钢高压反应釜中，将反应釜放置于180-220°C的烘箱中16-48h，取出，用自来水使其冷却至室温；用磁分离分离出产物，并用无水乙醇洗涤除去未反应的反应物，最后将产物分散在无水乙醇中，备用；
步骤2.将10-500mg步骤I得到的磁簇、IO-IOOOmL无水乙醇、5-300mL乙腈、0. 05_10mL氨水以及0. 05-20mL含钛(IV)的前驱体加入三口烧瓶中，在反应温度为10_40°C下机械搅拌0. 5-4h ;反应结束后，用磁分离得到产物，并用无水乙醇和乙腈进行洗涤；
步骤3.将10-500mg步骤2得到的产物、20_200mL无水乙醇、IO-IOOmL去离子水以及溶剂0-20mL氨水加入容量为50-500mL具有聚四氟乙烯内衬的不锈钢高压反应釜中，将反应釜放置于80-200°C的烘箱中8-48h，取出，用自来水使其冷却至室温；用磁分离分离出产物，并用无水乙醇进行洗涤。本发明中，所述的醋酸盐可为醋酸钠、醋酸钾、醋酸锂、醋酸镁和醋酸铵中的一种。本发明中，所述的含大量羧基的物质为柠檬酸、柠檬酸钠、聚丙烯酸、聚丙烯酸钠、聚谷氨酸、聚天冬氨酸中的一种。本发明中，所述的含钛(IV)的前驱体为四氯化钛、硫酸钛、钛酸四乙酯和钛酸四丁酯中的一种。本发明制备的磁性介孔二氧化钛核壳式复合微球可用于生物样品中极低浓度的磷酸肽的选择性富集和分离，效果非常好。为了检测微球对于生物样品中极低浓度的磷酸肽的选择性富集效果，将其加入到^酪蛋白与牛血清白蛋白摩尔比为1:1000的水解产物中，经过富集、洗涤、洗脱几个步骤后，检测洗脱产物的MALDI-T0F质谱。通过与未富集前的样品质谱进行比较，判断该微球富集磷酸肽的选择性效果。检测微球对于磷酸肽的富集容量是通过检测上清液中的磷酸肽信号进行评判。检测微球对于磷酸肽的回收率是通过同位素标记法进行确定。本发明中制备得到的磁性介孔二氧化钛核壳式复合微球具有结构规整、粒径分布均一、磁响应性快、比表面积和孔体积大以及二氧化钛壳层纯度和结晶性高等特点。另外，此制备方法还可以精确的控制二氧化钛壳层的平均孔尺寸从3到20 nm。微球中具有介孔和结晶结构的纯二氧化钛壳层使得该微球对于生物样本中极低浓度的磷酸肽有很高的选择性、灵敏度、富集容量以及回收率。而具有高磁响应性的磁性核的存在使得富集了磷酸肽的微球可以很方便和快速地被磁分离出来。因此，该磁性介孔二氧化钛核壳式复合微球是一种在选择性富集实际生物样本中极低浓度的磷酸肽方面具有良好应用前景的生物磁性分离材料。
图I磁性二氧化钛核壳式复合微球的透射电镜照片。图2磁性介孔二氧化钛核壳式复合微球的透射电镜照片。图3 (a)未经选择性富集的P酪蛋白与牛血清白蛋白摩尔比为1:1000的水解产物的质谱图；(b)用实施例I材料富集后的样品的质谱图。图中，和“★”分别代表磷酸肽及其脱磷酸化的部分。
具体实施例方式实施例I :磁核为300nm左右，二氧化钛壳层厚度为50nm左右、孔径为20nm左右的核壳式Fe3O4OmTiO2微球的制备及其用于选择性分离生物样品中极低含量的磷酸肽
1、柠檬酸稳定的磁簇的制备
将1. 2g六水合三氯化铁(FeCl3*6H20)，2. 4g醋酸铵(NH4Ac), 0. 3g柠檬酸溶解在70mL乙二醇中后，加入150mL三口烧瓶中，然后升温到140°C，保温反应Ih后，将烧瓶中液体转入容量为IOOmL的含有聚四氟乙烯内衬的高压反应釜中，再将反应釜放入200°C的烘箱反应24h后取出，用自来水使其冷却至室温。用磁分离分离出产物，并用无水乙醇洗涤除去未反应的反应物，最后将产物分散在无水乙醇中，备用。2、核壳式Fe3O4OTiO2的制备
将IOOmg制备得到的磁簇、80mL无水乙醇、40mL乙腈、5mL氨水以及ImL钛酸四丁酯加A 150mL三口烧瓶中，室温下反应2 h后，磁分离得到产物并用无水乙醇除去过量的反应物，然后将产物分散在无水乙醇中，备用。3、核壳式 Fe3O4OmTiO2 的制备
将以上制备得到的产物、50mL无水乙醇和30mL去离子水以及5mL氨水一起加入容量为IOOmL的含有聚四氟乙烯内衬的高压反应釜中，再将反应釜放入180°C的烘箱反应12h后取出，用自来水使其冷却至室温。磁分离分离出产物，并用无水乙醇进行洗涤。最终得到壳层厚度为50 nm左右，孔径为20 nm左右的核壳式Fe3O4OmTiO2微球。4、选择性分离生物样品中极低含量的磷酸肽
先将P酪蛋白与牛血清白蛋白摩尔比为1:1000的水解产物溶解在200ML含有1%三氟乙酸、50%乙腈的水溶液中，再加入2ML Fe3O4OmTiO2微球的分散液，室温下混合5分钟。用磁分离(磁分离速度15s)将结合了磷酸肽的微球分离出来，然后用200ML含有1%三氟乙酸、50%乙腈的水溶液进行洗涤，接着用IOML 5%的氨水进行洗脱，最后将洗脱液用MALTI-T0F质谱进行分析。结果表明选择性效果非常好，富集之前由于大量非磷酸肽的存在，磷酸肽的信号很弱，检测到的质谱图几乎都是非磷酸肽的信号。而富集之后磷酸肽的信号很强，且其他非磷酸肽的信号非常弱。富集容量的表征是配置不同浓度的P酪蛋白的水解产物，然后用已知质量的Fe3O4OmTiO2微球进行富集，当上清中开始检测到磷酸肽信号时就认为已经达到材料饱和吸附量，本例中富集容量约为120mg/g。回收率的表征是将一定量的标准肽平均分成两份，一份用18O进行标记，另外一份保持不变。18O标记的肽段在质谱图中相比未标记的会引起4Da的增加，从而可以很方便的与未标记的进行辨别。未标记的一份用于富集，收集洗脱产物与标记的一份混合后进行质谱分析，通过峰的强度来进行回收率的表征。本例中，磷酸肽的回收率可以达到94 %。实施例2 :磁核为150nm左右，二氧化钛壳层厚度为50nm左右、孔径为20nm左右的核壳式Fe3O4OmTiO2微球的制备及其用于选择性分离生物样品中极低含量的磷酸肽
1、柠檬酸稳定的磁簇的制备同实施例1-1中所述。所不同的是烧瓶中的反应温度由140°C变为 20°C。2、核壳式Fe3O4OTiO2的制备同实施例1_2中所述。所不同的是钛酸四丁酯的用量由ImL变为0. 6mL。
3、核壳式Fe3O4OmTiO2的制备同实施例1_3中所述。4、选择性分离生物样品中极低含量的磷酸肽的测试方法同实例1-4中所述。在本例中微球对于磷酸肽的选择性及回收率同实例1，本实例中由于磁核较小，所以磁分离速度较实例I慢(磁分离速度由15s变为Imin)，而富集容量则较实例I大(由120 mg/g变为210 mg/g)。实施例3 :磁核为300nm左右，二氧化钛壳层厚度为IOOnm左右、孔径为20nm左右的核壳式Fe3O4OmTiO2微球的制备及其用于选择性分离生物样品中极低含量的磷酸肽
I、柠檬酸稳定的磁簇的制备同实施例1-1中所述。2、核壳式Fe3O4OTiO2的 制备同实施例1_2中所述。所不同的是钛酸四丁酯的用量由ImL变为2mL。3、核壳式Fe3O4OmTiO2的制备同实施例1_3中所述。4、选择性分离生物样品中极低含量的磷酸肽的测试方法同实例1-4中所述。在本例中微球对于磷酸肽的选择性同实例1，磁分离速度为30s，富集容量约为250 mg/g,回收率为93%。实施例4 :磁核为300nm左右，二氧化钛壳层厚度为IOOnm左右、孔径为IOnm左右的核壳式Fe3O4OmTiO2微球的制备及其用于选择性分离生物样品中极低含量的磷酸肽
I、柠檬酸稳定的磁簇的制备同实施例3-1中所述。2、核壳式Fe3O4OTiO2的制备同实施例3-2中所述。3、核壳式Fe3O4OmTiO2的制备同实施例3_3中所述。所不同的是氨水的用量为2mL。4、选择性分离生物样品中极低含量的磷酸肽的测试方法同实例1-4中所述。在本例中微球对于磷酸肽的选择性同实例1，磁分离速度同实例3，富集容量约为200 mg/g,回收率为89%。实施例5 :磁核为300nm左右，二氧化钛壳层厚度为IOOnm左右、孔径为3nm左右的核壳式Fe3O4OmTiO2微球的制备及其用于选择性分离生物样品中极低含量的磷酸肽
I、柠檬酸稳定的磁簇的制备同实施例3-1中所述。2、核壳式Fe3O4OTiO2的制备同实施例3-2中所述。3、核壳式Fe3O4OmTiO2的制备同实施例3-3中所述。所不同的是氨水用量为OmL，反应温度80°C。4、选择性分离生物样品中极低含量的磷酸肽的测试方法同实例1-4中所述。在本例中微球对于磷酸肽的选择性同例1，磁分离速度同实例3，富集容量约为60 mg/g，回收率为 68%。
权利要求
1.一种磁性介孔二氧化钛核壳式复合微球的制备方法，其特征在于具体步骤为 (1)首先，以六水合三氯化铁、醋酸盐和含大量羧基的物质为原料，制备表面羧基稳定的磁性纳米粒子团簇，简称磁簇； (2)接着，使用溶胶凝胶法在磁簇表面包覆一层无定型的二氧化钛壳层得到磁性二氧化钛核壳式复合微球； (3)最后，通过水热处理上述步骤得到的产物制备得到以磁簇为核、具有介孔和结晶结构的二氧化钛为壳的磁性介孔二氧化钛核壳式复合微球。
2.根据权利要求I所述的制备方法，其特征在于步骤(I)的操作如下将0.6-5. 4g六水合三氯化铁、I. 2-16g醋酸盐和0. 2-2g含大量羧基的物质溶解在20-80mL乙二醇中，在20-170°C下机械搅拌0. 5-2h，然后置于具有聚四氟乙烯内衬的不锈钢高压反应釜中，将反应釜放置于180-220°C的烘箱中16-48h，取出，用自来水使其冷却至室温；用磁分离分离出产物，并用无水乙醇洗涤除去未反应的反应物，最后将产物分散在无水乙醇中，备用。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤(2)的操作如下将10-500mg步骤(I)中得到的磁簇、IO-IOOOmL无水乙醇、5-300mL乙腈、0. 05_10mL氨水以及0. 05_20mL含钛(IV)的前驱体加入三口烧瓶中，在反应温度为10-40°C下机械搅拌0. 5-4h ;反应结束后，用磁分离得到产物，并用无水乙醇和乙腈进行洗涤。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于步骤(3)操作如下将10-500mg步骤(2)中得到的产物、20-200mL无水乙醇、IO-IOOmL去离子水以及0_20mL氨水加入50_500mL含有聚四氟乙烯内衬的不锈钢高压反应釜中，将反应釜放置于80-200°C的烘箱中8-48h，取出，用自来水使其冷却至室温；用磁分离分离出产物，并用无水乙醇进行洗涤。
5.根据权利要求I一4之一所述的制备方法，其特征在于所述的醋酸盐为醋酸钠、醋酸钾、醋酸锂、醋酸镁和醋酸铵中的一种。
6.根据权利要求I一4之一所述的制备方法，其特征在于所述的含大量羧基的物质为柠檬酸、柠檬酸钠、聚丙烯酸、聚丙烯酸钠、聚谷氨酸、聚天冬氨酸中的一种。
7.根据权利要求I一4之一所述的制备方法，其特征在于所述的含钛(IV)的前驱体为四氯化钛、硫酸钛、钛酸四乙酯和钛酸四丁酯中的一种。
8.由权利要求I一4之一所述的制备方法制备获得的磁性二氧化钛核壳式复合微球和磁性介孔二氧化钛核壳式复合微球。
9.由权利要求I一4之一所述的制备方法获得的磁性介孔二氧化钛核壳式复合微球。
10.由权利要求9所述的磁性介孔二氧化钛核壳式复合微球在选择性富集生物样本中极低浓度的磷酸肽方面的应用。
全文摘要
本发明属于功能材料技术领域，具体为一种磁性介孔二氧化钛核壳式复合微球及其制备方法和应用。本发明的核壳式复合微球的核为磁性四氧化三铁纳米粒子团簇，壳为具有高结晶性的介孔二氧化钛。制备方法如下首先制备柠檬酸稳定的磁性纳米粒子团簇，接着采用溶胶凝胶法，在磁簇表面包覆一层无定型的二氧化钛壳层，最后通过水热处理制备得到磁性介孔二氧化钛核壳式复合微球。该复合微球中具有高结晶性的介孔二氧化钛壳层使得微球对于磷酸肽具有高选择性、高富集容量、高灵敏度以及高回收率的特点；磁性核的存在使得富集了磷酸肽的微球可以很方便和快速地被磁分离出来。本发明方法操作简单、过程可控，制备的复合微球可用于分析和鉴定生物样品中极低浓度的磷酸肽。
文档编号B01J13/02GK102614818SQ201210084029
公开日2012年8月1日 申请日期2012年3月27日 优先权日2012年3月27日
发明者张莹, 汪长春, 陆豪杰, 马万福 申请人:复旦大学