一种高分子荧光微球的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种高分子荧光微球的制备方法，其特点是将1重量份的聚苯乙烯荧光微球分散在0.1?lmL超纯水中，在搅拌下，滴加到3?10mL的聚二烯丙基二甲基胺盐酸盐溶液1.0?4.Omg/mL中，持续搅拌1?4h后离心，去除上清液，用超纯水清洗一次，离心收集后振荡分散于1?2mL超纯水中，搅拌下滴加到5?50mL标记或未标记荧光分子的多糖类聚电解质高分子溶液1.0?6.Omg/mL中，持续搅拌1?4h后离心，去除上清液后，将沉淀分散于纯水中，离心收集沉淀物，再将其分散到超纯水中，获得多糖修饰的荧光微球。该高分子荧光微球粒径为1?10ym，荧光激发波长为350?800nm，具有良好的生物相容性和稳定性。
【专利说明】—种局分子荧光微球的制备方法
【技术领域】
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[0001]本发明涉及一种高分子荧光微球的制备方法。属于生物医用高分子材料领域。
【背景技术】
[0002]突光微球由于在单个微球中富集了能够发射突光的有机或无机突光物质，发光强度和荧光灵敏度都比较高，所以在临床检验和诊断、免疫分析、血液循环以及细胞学研究等生物医学领域得到了极其广泛的应用(Macromolecules2011, 44, 4801 ；Macromol.Chem.Phys.2005，206，2440)。在微球的各种特性中，影响其应用的重要因素是微球的尺寸、分散性及形貌，除此以外，对于它的生物相容性要求，也显得十分重要(MacromoIecules2005, 38, 8300)。
[0003]近几年来，合成单分散的预定尺寸的聚苯乙烯荧光微球有了突破性的进展，制备的微球具有形貌规则、粒径均一、良好的表面反应能力和易于功能化等优点(EuropeanPolymer Journal2009, 45，550)，在免疫技术和疾病早期诊断等领域具有很高的研究和应用价值。聚苯乙烯荧光微球的制备，通常是通过物理吸附或化学键合的方法，在微球内部包埋或表面连接荧光素分子。利用物理吸附的方法制备荧光微球是一种简单、直接的方法，但物理吸附的荧光分子在微球上的富集不稳定，且荧光素吸附效率低。化学键合法制备突光微球相对于物理吸附的方法(Journal of Colloid and InterfaceScience2011, 363，137)，其优点在于荧光分子是通过共价键连接到微球的表面，其物理化学性质都比较稳定，不易从微球表面解离。但是部分不稳定的荧光素分子裸露在微球表面，易受周围环境的影响。另外，聚苯乙烯微球表面缺乏一层生物相容性的包被材料。
【发明内容】
[0004]本发明目的是针对现有技术不足而提供一种高分子荧光微球的制备方法，其特点是以表面带负电并标记了荧光分子的聚苯乙烯微球为模板，通过自组装技术，将带有相反电荷的糖类聚电解质(如硫酸葡聚糖、透明质酸、海藻酸)连续沉淀到微球表面带电层上，自组装成功能微球，制备成多糖高分子包裹的突光微球。此突光微球可稳定分散于水相，光学性质稳定，并具有良好的生物相容性，且不与常规的聚合物发生反应，也不影响抗生素效价，这种方法的最大优点是可以把各种不同功能的大分子(如抗体)结合到组装层，制得的微球在流式细胞仪和细胞标记方面都有很好的应用前景。
[0005]本发明目的由以下技术措施实现，其中所述原料份数除特殊说明外，均为重量份数。
[0006]高分子荧光微球的制备方法包括以下步骤:
[0007]I)表面羧基化聚苯乙烯微球的制备
[0008](I)将引发剂0.04?0.06重量份，聚乙烯吡咯烷酮0.04?0.3重量份，聚乙二醇单辛基苯基醚0.05?0.1重量份和苯乙烯I重量份溶于无水乙醇:水=100: O?25体积比的混合溶液4?8份，加入带有搅拌器、温度计和回流冷凝装置的反应釜中，搅拌混和均匀，对反应体系通氮气脱氧处理，然后将上述反应釜置于油浴中，加热至40?80°C反应I ?2h ;
[0009](2)将苯乙烯I重量份和烯丙酸0.02?0.06重量份溶于无水乙醇:水=100: O?25体积比的混合溶液4?8份，加入另一反应釜中，对反应体系通氮气脱氧处理，并加热至40?80°C;反应15?90min，将热的苯乙烯和烯丙酸溶液加入上述反应釜中，继续反应10?24h,通过离心除去未反应的单体,并重新分散在pH = 6?8.4的磷酸缓冲溶液中，获得表面羧基化聚苯乙烯微球；
[0010]2)高分子荧光微球的制备
[0011](I)突光微球的制备
[0012]将I重量份的表面羧基化聚苯乙烯微球溶液置于反应釜中，加入与聚苯乙烯微球表面羧基摩尔当量为I?10的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和聚苯乙烯微球表面羧基摩尔当量为I?10的N-羟基丁二酰亚胺，在室温下搅拌10?60min，将含有氨基官能团的荧光分子0.001?0.01摩尔当量加入反应体系，并继续搅拌反应6?24h，经透析袋(MW0 = 6000?8000)透析除去盐和未反应的荧光分子，获得荧光微球；
[0013](2)通过层层自组装制备表面修饰多糖高分子的微球
[0014]将I重量份的聚苯乙烯微球分散在0.1?ImL超纯水中，在搅拌下，滴加到浓度为
1.0?4.0mg/mL,体积为3?1mL的聚二烯丙基二甲基胺盐酸盐溶液中，持续搅拌I?4h，离心去除上清液，用超纯水清洗一次，离心收集沉淀，分散于I?2mL超纯水中，搅拌下再滴加到浓度为1.0?6.0mg/mL,体积为5?50mL标记或未标记突光分子的多糖类聚电解质高分子溶液中，持续搅拌I?4h，离心去除上清液，将沉淀再分散于纯水中，离心收集沉淀物，然后将沉淀物分散到超纯水中，获得表面修饰多糖高分子的微球。
[0015]所述引发剂为偶氮二异戊腈、偶氮二异丁腈或过硫酸钾中的任一种。
[0016]所述氨基官能团的荧光分子为荧光素，罗丹明，Cy5中的任一种，发射波长的范围涵盖350?800nm。
[0017]所述两步分散聚合法制备羧基化的聚苯乙烯微球为模板，平均粒径为I?ΙΟμπι。
[0018]高分子荧光微球制备方法制备得到的表面修饰多糖高分子的微球。
[0019]表面修饰多糖高分子的微球用于流式细胞仪和细胞标记。
[0020]结构表征与性能测试:
[0021]1.采用扫描电镜对表面羧基化聚乙烯微球的形貌、粒径分析测试，详见图1所示，
[0022]结果表明:制备的表面羧基化聚乙烯微球形貌规则，并呈单一分散；其粒径均一，分布较窄。
[0023]2.采用荧光分光光度计对表面FITC和Cy5功能化的聚苯乙烯荧光微球的荧光光谱分析测试，详见图3所示，
[0024]结果表明:表面FITC和Cy5功能化的聚苯乙烯荧光微球分别在最大激发/发射波长488/525nm和633/670nm处具有较强的相对荧光强度。
[0025]3.采用激光共聚焦对表面FITC和Cy5功能化的聚苯乙烯荧光微球的荧光分布分析测试，详见图4所示，
[0026]结果表明:表面FITC和Cy5功能化的聚苯乙烯荧光微球的荧光分布在微球表面，这主要是因为荧光分子通过化学键合的方式附着于聚苯乙烯微球表面。
[0027]4.采用Malvern纳米粒度仪对层层自组装制备的表面修饰多糖高分子的球的电位的变化分析测试，详见图5所示，
[0028]结果表明:层层自组装的成功，当带正电的电解质聚二烯丙基二甲基胺作为第一层吸附在原本带负电的聚苯乙烯微球上时，其表面的电位变为了+38mV左右，第二层聚阴离子硫酸葡聚糖的组装使表面电荷的变为_46mV。
[0029]5.采用配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪对表面FITC功能化的聚苯乙烯荧光微球的应用分析测试，详见图6所示，
[0030]结果表明:表面FITC功能化的聚苯乙烯荧光微球相比于聚苯乙烯微球，其阳性为100 %，其荧光强度可满足流式细胞仪对其的要求。
[0031]本发明具有如下优点:
[0032]1.本发明操作简单，根据原料投料比调控球粒径大小，微球壳厚度及组分很容易地通过改变自组装循环的次数和所用材料来控制，同时，壳的尺寸与形状由所用核的尺度预先确定。
[0033]2.本发明制备的高分子突光微球,粒度分布均一、具有良好的表面反应能力，易于功能化；
[0034]3.本发明制备的多糖类高分子荧光微球，较聚苯乙烯微球具有更好的生物相容性；
[0035]4.本发明制备的多糖类高分子荧光微球，能实现多个荧光编码，发射波长的范围涵盖350?800nm。荧光微球具有良好的光学性质，广泛应用于流式细胞仪的分析；
[0036]5.本发明制备的多糖类高分子荧光微球，能保护不稳定的荧光素分子，免受周围环境的影响。
【专利附图】
【附图说明】
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[0037]图1 (a)为1.1 μ m粒径的表面羧基化的聚苯乙烯微球的扫描电镜，
[0038]图1 (b)为2.1 μ m粒径的表面羧基化的聚苯乙烯微球的扫描电镜
[0039]图1 (C)为2.6 μ m粒径的表面羧基化的聚苯乙烯微球的扫描电镜
[0040]图1 (d)为3.6 μ m粒径的表面羧基化的聚苯乙烯微球的扫描电镜
[0041]图2为以聚苯乙烯微球为模板的自组装示意图。
[0042]图3 (a)为表面FITC功能化的聚苯乙烯荧光微球的荧光光谱图。
[0043]图3 (b)为表面Cy5功能化的聚苯乙烯荧光微球的荧光光谱图。
[0044]图4(a)为表面FITC功能化的聚苯乙烯荧光微球的激光共聚焦图。
[0045]图4(b)为表面Cy5功能化的聚苯乙烯荧光微球的激光共聚焦图。
[0046]图5为聚苯乙烯微球在层层自组装聚电解质高分子后电位的变化。
[0047]图6为表面FITC功能化的聚苯乙烯荧光微球的流式分析图。
[0048]具体实施方法:
[0049]以下通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是本实施例只用于本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据本发明的内容作出一些非本质的改进和调整。
[0050]实施例1
[0051]1.表面羧基化的聚苯乙烯微球的制备
[0052]采用两步分散聚合法制备表面羧基化的聚苯乙烯微球。首先将引发剂偶氮二异戊腈(AMBN)0.12g，稳定剂聚乙烯吡咯烷酮PVP360(Mw = 360000g/mol)0.135g，助稳定剂TX3050.15g，和苯乙烯单体3.0g溶于无水乙醇16.15mL和0.85mL超纯水混合溶液中，加入带有搅拌器、温度计和回流冷凝装置的反应釜中，搅拌混和均匀，对反应体系通氮气脱氧处理，然后将上述反应釜置于油浴中，加热至60°C反应Ih ;将苯乙烯3g和烯丙酸0.06g溶于无水乙醇7.6mL和0.4mL的超纯水的混合溶液中，加入另一反应釜中，对反应体系通氮气脱氧处理，并加热至60°C;反应60min,将热的苯乙烯和烯丙酸溶液加入上述反应爸中，继续反应18h,通过离心(3000rpm, 20min)除去未反应的单体,并重新分散在pH = 7.4的磷酸缓冲溶液中，获得表面羧基化聚苯乙烯微球；通过扫描电镜观察，其粒径大小为1.1±0.Ιμ--，且分布均一，如图1(a)所示；
[0053]2.聚苯乙烯荧光微球的标记制备
[0054]量取5mL表面羧基化的聚苯乙烯微球溶液(60mg/mL)于反应釜中，加入1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI) 0.54mg和N-羟基丁二酰亚胺(NHS) 1.62mg,在室温条件下搅拌15min后，将末端含有氨基功能团的罗丹明0.3mg加入反应体系，室温条件下搅拌反应10h。经透析袋(MW0 = 6000?8000)透析除去盐和未反应的荧光分子，获得突光微球；
[0055]3.通过层层自组装技术修饰微球表面特性
[0056]层层自组装的示意图如图2。将5mg聚苯乙烯微球分散在0.1mL超纯水中，在磁力搅拌条件下，滴加到3mL的聚二烯丙基二甲基胺盐酸盐溶液(TODA，2.0mg/mL)中，持续搅拌2h，离心去除上清液，用超纯水清洗一次,离心收集沉淀,分散于2mL超纯水中，搅拌下再滴加到15mL标记或未标记突光分子的硫酸葡聚糖溶液(4.0mg/mL)中多糖类聚电解质高分子溶液，持续搅拌2h，离心去除上清液，将沉淀再分散于纯水中，离心收集沉淀物，然后将沉淀物分散到超纯水中，获得表面修饰多糖高分子的微球。
[0057]实施例2
[0058]1.表面羧基化的聚苯乙烯微球的制备
[0059]采用两步分散聚合法制备表面羧基化的聚苯乙烯微球。首先将引发剂偶氮二异戊腈(AMBN)0.175g，稳定剂聚乙烯吡咯烷酮PVP55 (Mw = 55000g/mol) 0.7g，助稳定剂TX3050.245g，和苯乙烯单体3.125g溶于无水乙醇13mL中，加入带有搅拌器、温度计和回流冷凝装置的反应釜中，搅拌混和均匀，对反应体系通氮气脱氧处理，然后将上述反应釜置于油浴中，加热至60°C反应Ih ;将苯乙烯3.125g和烯丙酸0.125g溶于无水乙醇13mL中，加入另一反应釜中，对反应体系通氮气脱氧处理，并加热至60°C;反应90min，将热的苯乙烯和烯丙酸溶液加入上述反应爸中，继续反应18h,反应完毕后,通过离心(2000rpm, 20min)除去未反应的单体，并重新分散在缓冲溶液中。通过扫描电镜观察，其粒径大小为2.1 ±0.2 μ m，且分布均一，如图1(b)所示。
[0060]2.聚苯乙烯荧光微球的标记制备
[0061]量取5mL表面羧基化的聚苯乙烯微球溶液(60mg/mL)于反应釜中，加入1-(3- 二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI) 6.54mg和N-羟基丁二酰亚胺(NHS) 11.56mg,在室温条件下搅拌15min后,将末端含有氨基功能团的Cy50.3mg加入反应体系,室温条件下搅拌反应10h。经透析袋(MWO = 6000?8000)透析除去盐和未反应的荧光分子，获得荧光微球；图3(b)是Cy5标记的突光微球在激发波长635nm下的发射光谱。图4(b)为Cy5标记的荧光微球的激光共聚焦图。
[0062]3.通过层层自组装技术修饰微球表面特性
[0063]将5mg聚苯乙烯微球分散在0.2mL超纯水中，在磁力搅拌条件下,滴加到5mL的聚二烯丙基二甲基胺盐酸盐溶液(TODA，1.0mg/mL)中，持续搅拌2h，离心去除上清液，用超纯水清洗一次，离心收集沉淀，分散于2mL超纯水中，搅拌下再滴加到25mL标记或未标记荧光分子的硫酸葡聚糖溶液(2.0mg/mL)中多糖类聚电解质高分子溶液，持续搅拌2h，离心去除上清液，将沉淀再分散于纯水中，离心收集沉淀物，然后将沉淀物分散到超纯水中，获得表面修饰多糖高分子的微球。
[0064]实例3
[0065]1.表面羧基化的聚苯乙烯微球的制备
[0066]采用两步分散聚合法制备表面羧基化的聚苯乙烯微球。首先将引发剂偶氮二异戊腈(AMBN)0.125g，稳定剂聚乙烯吡咯烷酮PVP55 (Mw = 55000g/mol) 0.5g，助稳定剂TX3050.175g，和苯乙烯单体3.125g溶于无水乙醇25mL中，加入带有搅拌器、温度计和回流冷凝装置的反应釜中，搅拌混和均匀，对反应体系通氮气脱氧处理，然后将上述反应釜置于油浴中，加热至60°C反应Ih ;将苯乙烯3.125g和烯丙酸0.125g溶于无水乙醇25mL中，加入另一反应釜中，对反应体系通氮气脱氧处理，并加热至60°C;反应60min，将热的苯乙烯和烯丙酸溶液加入上述反应爸中，继续反应18h,反应完毕后,通过离心(1000rpm,20min)除去未反应的单体，并重新分散在缓冲溶液中。通过扫描电镜观察，其粒径大小为2.6±0.2 μ m，且分布均一，如图1(c)所示。
[0067]2.聚苯乙烯荧光微球的标记制备
[0068]量取5mL表面羧基化的聚苯乙烯微球溶液(60mg/mL)于反应釜中，加入1-(3- 二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI) 6.54mg和N-羟基丁二酰亚胺(NHS) 11.56mg,在室温条件下搅拌15min后，将末端含有氨基功能团的FITC0.3mg加入反应体系，室温条件下搅拌反应10h。经透析袋(MW0 = 6000?8000)透析除去盐和未反应的荧光分子，获得荧光微球；其荧光性质通过荧光分光光度计以及共聚焦表征，图3(a)是FITC标记的荧光微球在激发波长488nm下的发射光谱，图4 (a)为FITC标记的荧光微球的激光共聚焦图。
[0069]3.通过层层自组装技术修饰微球表面特性
[0070]将5mg聚苯乙烯微球分散在ImL超纯水中，在磁力搅拌条件下,滴加到1mL的聚二烯丙基二甲基胺盐酸盐溶液O3DDA, 4.0mg/mL)中，持续搅拌4h，离心去除上清液，用超纯水清洗一次，离心收集沉淀，分散于2mL超纯水中，搅拌下再滴加到50mL标记或未标记荧光分子的硫酸葡聚糖溶液(6.0mg/mL)中多糖类聚电解质高分子溶液，持续搅拌2h，离心去除上清液，将沉淀再分散于纯水中，离心收集沉淀物，然后将沉淀物分散到超纯水中，获得表面修饰多糖高分子的微球。通过测量微球电位的变化监测自组装的结果，如图5所示。
[0071]实例4
[0072]1.表面羧基化的聚苯乙烯微球的制备
[0073]采用两步分散聚合法制备表面羧基化的聚苯乙烯微球。首先将引发剂偶氮二异戊腈(AMBN) 0.125g，稳定剂聚乙烯吡咯烷酮PVP55 (Mw = 55000g/mol) 0.375g，助稳定剂TX3050.175g，和苯乙烯单体3.125g溶于无水乙醇15mL中，加入带有搅拌器、温度计和回流冷凝装置的反应釜中，搅拌混和均匀，对反应体系通氮气脱氧处理，然后将上述反应釜置于油浴中，加热至60°C反应Ih ;将苯乙烯3.125g和烯丙酸0.187g溶于无水乙醇15mL中，加入另一反应釜中，对反应体系通氮气脱氧处理，并加热至60°C;反应60min，将热的苯乙烯和烯丙酸溶液加入上述反应爸中，继续反应18h,反应完毕后,通过离心(1000rpm,20min)除去未反应的单体，并重新分散在缓冲溶液中。通过扫描电镜观察，其粒径大小为3.6±0.2 μ m，且分布均一，如图1(d)所示。
[0074]2.聚苯乙烯荧光微球的标记制备
[0075]量取5mL表面羧基化的聚苯乙烯微球溶液(60mg/mL)于反应釜中，加入1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI) 3.54mg和N-羟基丁二酰亚胺(NHS) 7.08mg,在室温条件下搅拌15min后，将末端含有氨基功能团的FITC0.3mg加入反应体系，室温条件下搅拌反应10h。经透析袋(MW0 = 6000-8000)透析除去盐和未反应的荧光分子，获得荧光微球；
[0076]3.通过层层自组装技术修饰微球表面特性
[0077]将5mg聚苯乙烯微球分散在0.2mL超纯水中，在磁力搅拌条件下,滴加到5mL的聚二烯丙基二甲基胺盐酸盐溶液(TODA，2.0mg/mL)中，持续搅拌lh，离心去除上清液，用超纯水清洗一次，离心收集沉淀，分散于ImL超纯水中，搅拌下再滴加到25mL标记或未标记荧光分子的硫酸葡聚糖溶液(4.0mg/mL)中多糖类聚电解质高分子溶液，持续搅拌2h，离心去除上清液，将沉淀再分散于纯水中，离心收集沉淀物，然后将沉淀物分散到超纯水中，获得表面修饰多糖高分子的微球。
[0078]应用实例I
[0079]将制备的表面修饰多糖高分子的荧光微球，分散于超纯水中，浓度大约为16个/mL，置于流式细胞仪中检测，其激发波长为488nm，微球个数设置为50000个，并以为标记荧光的表面修饰多糖高分子的微球为对照组。经数据分析得到结果，如图6所示。流式细胞仪分析结果表明，FITC标记的荧光微球，能满足流式细胞仪对其的检测。
【权利要求】
1.一种高分子荧光微球的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤: 1)表面羧基化聚苯乙烯微球的制备 (1)将引发剂0.04?0.06重量份，聚乙烯吡咯烷酮0.04?0.3重量份，聚乙二醇单辛基苯基醚0.05?0.1重量份和苯乙烯I重量份溶于无水乙醇:水=100: O?25体积比的混合溶液4?8份，加入带有搅拌器、温度计和回流冷凝装置的反应釜中，搅拌混和均匀，对反应体系通氮气脱氧处理，然后将上述反应釜置于油浴中，加热至40?80°C反应I?2h ； (2)将苯乙烯I重量份和烯丙酸0.02?0.06重量份溶于无水乙醇:水=100: O?25体积比的混合溶液4?8份，加入另一反应釜中，对反应体系通氮气脱氧处理，并加热至40?80°C ;反应15?90min，将热的苯乙烯和烯丙酸溶液加入上述反应釜中，继续反应10?24h，通过离心除去未反应的单体，并重新分散在pH = 6?8.4的磷酸缓冲溶液中，获得表面羧基化聚苯乙烯微球； 2)高分子荧光微球的制备 (1)突光微球的制备 将I重量份的表面羧基化聚苯乙烯微球溶液置于反应釜中，加入与聚苯乙烯微球表面羧基摩尔当量为I?10的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和聚苯乙烯微球表面羧基摩尔当量为I?10的N-羟基丁二酰亚胺，在室温下搅拌10?60min，将含有氨基官能团的荧光分子0.001?0.01摩尔当量加入反应体系，并继续搅拌反应6?24h，经透析袋(MWO = 6000?8000)透析除去盐和未反应的荧光分子，获得荧光微球； (2)通过层层自组装制备表面修饰多糖高分子的微球 将I重量份的聚苯乙烯微球分散在0.1?ImL超纯水中，在搅拌下，滴加到浓度为1.0?4.0mg/mL,体积为3?1mL的聚二烯丙基二甲基胺盐酸盐溶液中，持续搅拌I?4h，离心去除上清液，用超纯水清洗一次，离心收集沉淀，分散于I?2mL超纯水中，搅拌下再滴加到浓度为1.0?6.0mg/mL,体积为5?50mL标记或未标记突光分子的多糖类聚电解质高分子溶液中，持续搅拌I?4h，离心去除上清液，将沉淀再分散于纯水中，离心收集沉淀物，然后将沉淀物分散到超纯水中，获得表面修饰多糖高分子的微球。
2.如权利要求1所述高分子荧光微球制备方法，其特征在于引发剂为偶氮二异戊腈、偶氮二异丁腈或过硫酸钾中的任一种。
3.如权利要求1所述高分子荧光微球制备方法，其特征在于氨基官能团的荧光分子为荧光素，罗丹明，Cy5中的任一种，发射波长的范围涵盖350?800nm。
4.如权利要求1所述高分子荧光微球制备方法，其特征在于两步分散聚合法制备羧基化的聚苯乙烯微球为模板，平均粒径为I?10 μ m。
5.如权利要求1?4之一所述高分子荧光微球制备方法制备得到的表面修饰多糖高分子的微球。
6.如权利要求5所述表面修饰多糖高分子的微球用于流式细胞仪和细胞标记。
【文档编号】B01J13/02GK104209071SQ201410387816
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2014年8月8日 优先权日:2014年8月8日
【发明者】艾华, 王丹 申请人:四川大学