专利名称：鸡痘病毒弱毒疫苗株7.3Kb片段的基因组分析的制作方法
技术领域：
本发明是一段可以作为构建表达载体的中国鸡痘病毒(FPV)鹌鹑化弱毒282E4疫苗株基因组DNA中BamHI片段中的一部分核苷酸序列，属于生物技术领域。
中国鸡痘病毒282E4株在我国应用多年来，有效地控制了我国鸡痘的发生，收到了满意的效果。研究和开发FPV现已成为国内外学者关注的焦点，FPV基因组DNA中病毒复制非必需区(nonessential region，NER)的筛选和优化，是开发FPV做为重组病毒载体的首要前提条件。1982年以来，用痘苗病毒作载体获得了表达多种外源基因的重组痘苗病毒载体。受该项研究的启发，人们开始研究开发较痘苗病毒更加具有安全性的宿主特异的痘病毒作为载体，但此项研究要获得成功，必须首先找到非必需区(nonessential region，NER)，寻找到了非必需区才能加入启动子和外源基因。国内外学者一直在从事此项非必需区(NER)的寻找工作，但至今仍未获得成功。另外，FPV是目前已知的最大的病毒，基因组长达约300kb，比痘苗病毒197kb长约1/2，现已知痘苗病毒至少可容纳25kb的外源基因，足可预见FPV将载入的外源基因的容量的颇具潜力和开发应用价值。
目前，筛选FPV的NER的方法主要有定向克隆法和鸟枪法两种，应用前者需建立在对FPV的基因背景有一定了解的基础之上，但由于目前FPV基因组全序列尚未见报道，故定向克隆法虽然成功率高，但明显地受到限制。采用鸟枪法随机克隆筛选FPV的非必需区已逐渐为国内外学者所接受。
本发明的目的是对中国FPV282E4弱毒疫苗株进行非必须区(NER)的筛选，然后在筛选的非必需区能够采用生物技术的方法加入带有启动子和外源基因，获得更有应用价值或者效果更好的重组基因和重组病毒疫苗株。
本发明提供了一种新的鸡痘病毒基因，该病毒基因组成如表1。
本发明提供了一种鸡痘病毒基因的生产方法，用限制性内切酶BamHI消化中国鸡痘病毒282E4弱毒疫苗株基因组，获得7.3kb片段；在该片段经亚克隆后获得的A、B、C和D四个片段；在B和D片段的BglII和EcoRV位点插入含有相应启动子的外源基因后，共同转染鸡胚成纤维细胞；导入FPV中，可使目的基因执行表达，并将其制备成免疫制剂或者重组疫苗，可作为人或者动物预防多种细菌、寄生虫或病毒性疾病的基因重组免疫原。
该新的鸡痘病毒为中国鸡痘病毒FPV鹌鹑化弱毒282E4疫苗株基因组DNA7.3kb BamHI片段全序列，此序列位于FPV基因组末端重复序列附近，其长度为7394bp，含11个开放读码框架，ORF9编码的蛋白为跨膜蛋白。
外源基因可是细菌、寄生虫或者病毒的保护性抗原。
外源基因可是P11P7.5-LacZ报告基因。
本序列来源于我国FPV282E4弱毒疫苗株基因组DNA7.3kbBamHI片段全序列，其特征是位于FPV基因组的末端重复序列附近。在左侧EcoRV位点和右侧BglII位点插入外源基因后，在相应启动子的作用下，可使目的基因得到表达，从而实现构建重组病毒载体的目的。
本发明申请人将所测的核酸序列同GenBank中报道的FPV序列和痘苗病毒全基因组序列比较结果发现其中1-3000bp和3001-6000bp同英国HP-438分离株1-2998bp和2999-5995bp的同源性高达99.6％和99.7％，即除在2385和2681bp处插入一个A，3088和3089bp处插入AAC，40和1350bp处由T突变为A，379和5100bp处由T突变为G，1568和4518bp处由C突变为G，2162bp处由C突变为T，4675bp处由G突变为T，5728bp处由C突变为A外，其余均完全一致。但6001-7394bp同英国HP-438分离株5996-7384bp的同源性仅为54％，但同痘苗病毒Copenhagen株基因组全序列进行最大同源性分析，未见任何同源性。
本序列的核苷酸组成和读码框架(open reading frames，ORF)分析见表1，6001-7394bp，同英国HP-438分离株5996-7384bp的最大同源性比较见表2，相对应的等点(PI)、分子量(Mr)、信号肽、疏水区预测等分析见表3。
本发明的优点和积极效果在于本发明申请人在现有的鸡痘病毒FPV中，筛选出了NER非必需区，筛选出的非必需区，可以加入启动子，将外源基因导入FPV中，并可生产出适合人类需求的各种新基因，而且使目的基因能够执行表达。通过该非必需区，也可导入各种抗病基因，并将其制备成各种免疫制剂或者重组疫苗，可作为人或者动物预防多种细菌、寄生虫或者病毒性疾病的基因重组免疫原。
图1至11为开放读码框架(ORF)编码氨基酸的疏水性分析图。
下面详细叙述
具体实施例方式本发明的可作为携带外源基因的载体的鸡痘病毒基因，该病毒基因组成如表1。
本发明的导入方法是利用限制性内切酶BamHI消化中国鸡痘病毒(FPV)282E4弱毒疫苗株基因组，获得7.3kb片段。在该片段经亚克隆后获得的A、B、C和D四个片段，在其中B和D片段的BglII和EcoRV位点分别插入P11P7.5-LacZ报告基因，与FPV共转染鸡胚成纤维细胞，经X-gal显色后进行蓝斑筛选，证明此二片段为FPV非必需区(NER)。该片段基因全长7394bp，其中B和D片段分别位于该片段的两侧，长度分别为1535和2798bp。该片段中共含11个开放读码框架(open reading frames，ORF)，其中ORF9编码蛋白为跨膜蛋白。
本发明提供的一种新的鸡痘病毒基因的生产方法如下1、病毒的培养与DNA的提取(1)病毒的培养将FPV282E4株以3pfu/cell接种于长成单层的鸡胚成纤维细胞(CEF)，并设对照。37℃培养，每天早晚各观察一次，当细胞病毒变达80％以上，收毒。在显微镜了见单层细胞拉网，细胞变圆，脱壁，折光性增强等病变。
(2)病毒粒子的纯化收毒的细胞培养物，反复冻融3次，10KHZ超声处埋5min，3000r/min离心30min，弃沉淀，上清于4℃ 18000r/min离心30min，沉淀重悬于TE缓冲液(10mmol/L Tris-HCL，EDTA 1mmol/L pH8.0)中，10KHZ超声处理5min，加于36％蔗糖溶液(W/V)上，于4℃ 18000r/min离心30min，弃上清。将沉淀重悬于TE缓冲中用TE缓冲深配制60％、50％、40％、30％蔗糖溶液(W/V)依浓度大小自下而上加于离心管中，4℃放置2h，另病毒悬于蔗糖梯度溶液之上，4℃ 18000r/min离心30min，收集病毒带，用TE缓冲液稀释，4℃ 18000r/min离心30min弃上清，将沉淀重悬于蒸馏水。经蔗糖密度梯度离心30min，病毒带出现于大约54％蔗糖处，收集的病毒带经磷钨酸负染，电镜观察，看到典型形态的FPV的病毒粒子。
2、FPV DNA限制性内切酶酶切与克隆
(1)病毒DNA的提取向沉淀重悬物中加入等体积的裂解缓冲液[100mmol/L，Hris-HCL pH7.8，2mmol/L EDTA，2％ SDS，200mmol/Lβ-巯基乙醇，54％(W/V)蔗糖1mg/ml蛋白酶K]，混匀后50℃水浴1h，再放人4℃冰箱过夜，加入等体积的饱和苯酚，室温温和振摇6h。离心后吸取上层水相，再以等量饱和酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)抽提2-3次，再以氯仿抽提一次。在样品中加入不超出1/10体积的3mol/L NaCl(PH5.2)和2.5倍体积的无水乙醇，置20℃冰箱过夜，4℃高心10min，再以78％乙醇和无水乙醇各洗一次，抽干后熔于TE缓冲液(101mmol/L Tris-HCI pH8.0，1mmol/L EDTA)中。
(2)FPV DNA BamHI的酶切取约3ug FPV DNA，加入10×BamHI缓冲液(60mmol/L Tris-HCL，60mmol/L MgCL2，1500mmol/L NaCl，10mnol/L DTT pH7.9)3ul，BamHI(12U/ul)3ul，加水至总体积30ul，37℃酶切3h。将其灭活10min后，用等体积饱和酚、饱和酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)各抽提一次，再用等体积的氯仿/异戊醇(24∶1)抽报一次，再加入不敷出/10体积3mol/L NaC 12.5倍体积的无水乙醇，放-20℃冰箱40min，4℃ 12000r/min离心10min，再用70％乙醇洗涤一次，抽干。溶于10ulTF(10mnol/L Tris-HCI，1mmol/L EDTA pH7.6。pUC18的酶切与去磷酸化取1ug pUC 18，10×BamHI缓冲液1.5ul(12U/ul)1ul，加水至总体积15ul。37℃水浴3h，电泳鉴定完全切后，直接向酶切反应物中加入10×CIP缓冲液(500mmol/L Trls-HCL pH8.0，10mmol/L MgCl21mmol/LZnCl2，10mmol/L Spermidine)5ul，CIP(1u/ul)1u，加入至总体积50ul，37℃水浴60min后，加入0.5mol/L的EDTA(pH8·0)1ul，65℃水浴以灭活CIP，扩大体积至400ul，以等体积饱和酚、饱和酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)各抽提一次，加入不超出1/10体积3mol/L NaAc和2.5倍体积的无水乙醇，放-20℃冰箱40min，4℃ 12000r/min离心10min，70％乙醇洗一次，抽干溶于TE(10mmol/L Tris-HCl pH7.8，100mmol/L EDTA)。
(3)FPV DNA BamHI片段与已酶切并去磷酸化的pUC18连接取5ulFPV DNABamHI片段与2ul BamHI酶切并去磷酸化的pUCl8混合，加入10×T4连接绥冲液(300mmol/L Tris-HCl pH7.8，100mmol/L MgCl2，100mmol/L DTT，10mmolATP)1.5ul，T4 DNA连接酶(3u/ul)1ul，加水至总体积至15ul，放4℃冰箱过夜。
(4)大肠杆菌JM109感受态细胞的制备以无菌接种环刮取冻存于-70℃冰箱的大肠杆菌JM109，在不含氨苄青霉素的LB琼酯平板上划线，37℃培养16h左右，挑取一个单菌落，转到一人装有100ml不含氨苄青霉素LB培养基的锥形瓶中，37℃剧烈振摇培养。当0D600在0.44-0.55时，在无菌条件下将细菌转移至0℃。在4℃条件下，以400r/min离心10min，回收沉淀细菌。倒出上清液，将管倒1min，每50ml初始培养物用2ml用冰预冷的100mmol/L CaCl2重悬，然后向每管中加入无菌的甘油，使其终浓度占总体积的15％，用无菌吸头将感受态细胞分装于无菌的微量离心管中，每管200ul，作好标记，放-70℃冰箱冻存。
(5)转化把连接反应物稀释到最后体积为30ul，取10ul加入到200ul感受细胞中，用加样器向感受态细胞中吹气，使连接反应物与感受态细胞混合均匀，冰浴30min后，42℃水浴90秒，再冰浴5分钟，加入已预热至37℃的LB培养基800ul，放37℃摇床，20r/min温育1h，使细菌复苏，取200ul；菌液涂布于预先涂布有40ul X-gal(20mg/ml)8ul IPTG(100mg/ml)含50ug/ml氨苄青霉索的LB琼脂平板上，37℃培养14-16h，挑取白色的氨苄青霉素抗性菌落，于含50ug/ml氨苄青霉素的LB脂平板，37℃培养4-16h。
3、克隆坚定将所挑取的氨苄青霉素抗性白色菌落编号，用无菌牙签挑取细菌涂抹于对应编号的微量离心管的底部，向每管加入30ul 1×Cracking缓冲液[100mmol/LNaOH 5mmol/L EDTA pH8.0，0.5％(W/V)SDS，0.025％(W/V)溴酚蓝，5％(W/V)溴酚蓝，5％(V/V)甘油]，在旋涡器上混匀，室温放置5min，上样于含溴化乙锭(0.5ug/ml)的琼脂糖凝胶的加样孔中，约5v/cm电泳，指示剂到全长的2/3时，在紫外灯照射下观察。
白斑筛选，重组子快速筛选，证实7.3kb片段为FPV282E4弱毒疫苗株DNABanHI片段。
4、打点杂交(1)小规模提取重组质粒将重组质粒细菌接种于已编号的装有1.5ml含氨苄青霉素5ug/ml的LB液体培养中，37℃振摇过夜，将培养物倒人1.5ml的微量离心管中，冰浴10min，4℃12000r/min离心5min，倾去上清，使细菌沉淀尽可能含较少的培养基，将细菌沉淀重悬于100ul用冰预冷的溶液I(50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris-HCL pH8.0，10mmol/L EDTA)，加入200ul新配制的溶液II
，颠倒10次，冰浴5min，再加入不敷出50预冷的5mmol/L KAC(pH4.8)，颠倒10次，冰浴15min，12000r/min离心10min，吸取上清以饱和酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)抽提一次，抽干，沉淀于20ul(10mmol/L)Tris-HCl，1mmol/L EDTA pH8.0)备用。
(2)探针标记取约3ug FPV DNA，加入3ul 10×BamHI缓冲液，加入BamHI(12U/ul)2ul，加水至30ul，37℃作用3h后，65℃水浴10min，用饱和酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)抽提，乙醇沉淀的方法，纯化，已酶切的FPV DNA在100℃变性10min，并立即放入冰乙醇中冷却，依次向3ug新鲜变性的FPV DNA(相当于5ul)的离心管中加入2ul六聚核苷酸混合物，2ul NTP标记用混合物，加无菌重蒸水至19ul再加1ul Klenow(2U/ul)，37℃保温24h后，加入2ul0.2mol/L EDTA(pH18.0)溶液终止反应，加7.5ul 4mol/L LiCl和75ul预冷的无水乙醇，沉淀标记DNA，在-70℃放置60min，离心10min，再用70％冷乙醇洗涤沉淀物，真空中干燥后，加50ul TE(1mmol/L Tris-HCL，1mmoL EDTA)溶解。
(3)打点与烤膜将硝酸纤维膜先用去离子水浸湿后，浸入20×SSC(3mol/LNaCl，0.3mol/L柠檬酸三钠pH7.0)溶液中，取出待膜干后，将小量提取的重组质粒DNA沸水中变性10min，迅速置于冰上，向每管加入等体积的20×SSC，混匀，点样，以FPV DNA作阳性对照，pUCI8质粒作阴性对照，每点每次点样小量，反复多次，将膜置室温下自然干燥，然后夹于二张新华滤纸间，用两块玻璃板夹紧，80℃真空干烤2h。
(4)预杂交与杂交将膜放入塑料袋内，加入20ml预杂交液[5×SSC，0.5％(W/V)封阻试剂，0.1％N-十二烷酚肌氨酸钠，0.02％(W/V)SDS，密封，在68℃预杂交8h，其间要翻动几次，倾弃预毁交液，加入新鲜预杂交液3ml，加入沸水中新变性digoxgenin-dUTP标记探针，排尽袋中气泡，密封，68℃杂交12h，其间要翻动几次。
经打点杂交，证实7.3kb片段为FPV 282E4.弱毒疫苗株DNABanHI片段。
5、核酸的序列测定取4 premix(16ul 5×TACS buffer，4ul dNTP mix，Dy Deoxy TM A、T、C、G Termiter各4ul，Ampli Taq DNA polymerase 2ul混匀制成。)10ul，模板DNA约2ug，引物加至终浓度为3.2pmmol/L加蒸馏水40ul，混匀，顶层加40ul石蜡油防止蒸发。96℃变性5min后，按以下程序共25个循环，96℃30sec.50℃15sec，60℃ 4min。产物经princeon公司生产的Centrisepspin Column柱离心回收后，以加样缓冲液稀释100℃煮沸10min变性产物，上样于安装在ABI337 DNA Scquencer的6％聚丙烯酰胺凝胶上，12000v电泳12h.并读序。
经DNAsis V7.0分析结果表明7.3kb BamHI片段共7 394bp，其中1-3000bp和3001-6000bp同英国HP-438分离株1-2 998bp和2999-5995bp的同源性高达99.6％和99.7％，即除在2 385和2 681bp处插入一个A，3088和3089bp处插入AAC，40和1350bp处由T突变为A，379和5100bp处由T突变为G，1568和4518bp处出C突变为G。2162bp处由C突变为T，5728bp处出C突变为A外，其余均完全一致，但6001-7394bp同英国HP-438分离株5996-7384bp的同源性仅为54％，但同痘苗病毒Copenhagen株基因组全序列进行最大同源性分析，未见任何同源性。
此外，我们对7394bp中的开放读码框架(open reading frames，ORF)，根据Scott J.G.等的划分原则和对早期、早/晚期和晚期表达ORF的划分原则进行了分析，发现ORF2、ORF9和ORF10为早期表达ORF，ORF1和ORF6为早/晚期表达ORF，见图3，相对应的等电点(PI)、分子量(Mr)、信号肽、疏水性分析图。同时我们对11个ORF同痘苗病毒Copenhagen株基因组全序列的ORF进行了氨基酸的最大同源性分析，结果经发现ORF1编码的418个氨基酸同C10L有相对较高的同源性，这同Flona Tomley等报道的结果基本一致。
证实7.3kb(7394bp)片段为中国FPV 282E4弱毒疫苗株DNA BanHI片段。
表17.3kbBamH1片段的核苷酸序列和开放读码框架(0RF)分析1 GGATCCGACG CGGCTGCCAA GACCTTTATA CCCGACTCTC GTTCTACTGG ACGAACGCGG61AGATTTAAAG CCATGGCTGA CGTATAGTCG AGGACGCCCT CGGTAATAAA TTGATTATAT121 TTTCAGTTTT AAAAAATTAA TTTATATGTA CTCAATATCC TTATATAGAA TTATTTTATC181 TCTTCTGATA TACGTTAGGT AGATGCCGTT CAAATAATAA AATATCTGAT GACGTTTTTA241 TGCGCGTGTT ACGTTATTAT AATAGATAAT AGAAATAAAC GTTAAAATAA TAATTAATTA301 TCTTTTCAGT TGTTAAATAT ATTCTAGTTT TATAAGCGTT ATTCATATAT AAAAAATATA361 AAAACTAAAT CGTATTTAGT ATGATGCTAC GGCGGTCATT TAACAAATTT ACGCGATGGA[ORF1] M E421 GTTCAGTTGT ACGGGAACTA ATAACCAGTT GGCCGTTCAC AGATTTACAG AAACGCGTTTF S C T G T N N Q L A V H R F T E T R F481 TACATCTTTC AAAAAAGAAC TTTTAGTTAA TTTAGGAATA AGTGACTTAA ATGATATAAAT S F K K E L L V N L G I S D L N D I K541 AAACATATGC GAGGATTCTA AAATATTCTT TCCGGAAAAG AGAACGGAGC TCTTAAGTATN I C E D S K I F F P E K R T E L L S I601 TAAAGATCGT AAATCTAAAC AAATAGTTTT CGAAAACTCC CTAAACGATG ACTTGCTTAAK D R K S K Q I V F E N S L N D D L L K661 AAAATTACAC GCCTTGATCT ATGATGAATT 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TAATAATAGC ACATCTGTAT3121 ATTTATATAC CTCTCGAGTA CATAAAAATA ATATGTTTTG ATAAAACGTA AATCAATAAG3181 TGTATAAGGT ATTATTTCTT TTAATGAAGA AATAGGACGT AATGTCTAAA TCAGATTTAT3241 ATTCCCGAAA ATATTTTTCT TAGATGTATA TGTTAGTTAA ATTACGTGAT TATATTATAA3301 GTTATCTGCT TACTTTAACA TTATATAGTA ATTATATACT AACCGATCTT AACACTTCCG3361 TACAAAGAGG TATGCCCGCA TCTGCGAGAT ATTGTGATTT TCGTATTTAG ATATGTGAAT3421 ATAGTTATCT ACTAACGCGA CTTTCCTCCA ATTTACAAAG CTCTAAGGAA AAAAAATAAA3481 ATAATACTAC CACGTTCCTC TTTTAAGAGT TAACTATTTA CTCGGAGGTA TCGGTATACA3541 TACAATTCTA TATAATTTAG TTAATCGCTT TTTACGCGCA TAAGTCTACG TATAATGTCT* G QF I G L F L P I K TQ V D3601 TTGTTTAAGT AACTATCCCT GGAATATTCC TAAAAATAGC GGAATTTTTG TTTGTACGTCA V L F M F PV N A K V I P I K KI G D3661 GGCTACTAGG AACATGAAAG GTACGTTCGC TTTTACGATA GGAATTTTCT TTATTCCGTC[ORF10] M K G T F A F T I G I FF I P ST T C L E T VS A A E T G Y E D VK I V3721 TGTAGTGCAT AATTCGGTAA CACTAGCTGC TTCAGTTCCG TATTCATCTA CTTTTATCACV V H N S VT L A A S V P Y S ST F I TS K Q R I N G I R L T K T D S I G V L E3781 AGATTTTTGC CTGATATTAC CTATCCTCAA AGTTTTTGTA TCGGATATAC CTACTAATTCD F C L I L P I L K V F V S D IP T N SG S K F L D N C G M H I L A D KL D V D3841 ACCTGACTTG AATAGATCAT TACATCCCAT ATGGATTAGC GCGTCTTTCA AGTCTACGTCP D L N R S L H P I W I S A S FK S T SD E L E F K P L Y L V I E K L T M D K K3901 ATCTTCTAAT TCGAATTTAG GTAAATAAAG AACTATTTCT TTCAAAGTCA TATCTTTTTTS S N S N LG K *S I I K N I N K G N N L S D V V G L I S3961 AGATATTATT TTATTGATAT TCTTACCGTT ATTGAGAGAA TCAACTACTC CTAAAATAGAF T N F N R L C I L K L M [ORF4]4021 AAAAGTATTA AAATTACGTA AACATATTAG TTTTAACATC TTTTTATTTG TTTAGTATAT4081 AAACTTATAT CGTAAAGAAA TATAGTTCTC TTAATTTACG TTTATTAGGA AATAAAATAG4141 ACATATTGAT ATACACCTTA GATACTTAAT TAAAATGGAT AGAAACATTA ATTTACCCGA[ORF5] M DR N I N L P E4201 AGAAGAGCTT AAATATATAA AAGAATGTTG CGAAGTTCTT TATTTACCCC AGCCGACGAGE E L K Y I K E C C E V L V L PQ P T R4261 AATGGATATA ATCGGTGTTA TGAATGATAG CGATATTTCT TGGAATGAAA ATCTCATCATM D I I G V M N D S D I S W N EN L I I4321 TCTAATGTCG GAAGATGGTA AGATTTATGT GTACGACGAT GAAGCTCTAT ACAAAGTAGCL M S E S G K I Y V Y D D E A LY K V A4381 GGATACTATG GAAGAGTTCT CTGAAATAGG ACTTATTAAT CTAGGAAATG AAGTTTATCAD T M E E F S E I G L I N L G NE V Y H4441 TTGTAGAGAG GATATAAAAC CTCTTCCCGA AGAGGATAGG GATAAGGATG AGTATATAATC R E D I K P L P E E D R D K DE Y I M4501 GAAGATAAGG GAAAAAGCCA GGGAGCTTAT AGATAATTCA CAAAAAGATT TTGAGGCCATK I R E K A R E L I D N S Q K DF E A I4561 TCTAGATTCT TTGGAGAATA AACATGTATC AATTTAGGTA TATAATATAA GGTAGCAAAAL D S L E N K H V S I *4621 TACGTATGTC CGTGTACGCT TATGTATTTT TTTATTTGGA TTAAAATCGA TACGCTAGAT4681 AATAGCGGAG TAGCTTCTGT ATCCGCCGCG GTTATTTACT TTAGTAATCT ATTAAACTAC4741 TTTTATCTCT ATTATTAAGT TAGTCATACC CACGAATATA TATTCATAAA AACATCTTCCK L K T L E EK L C K4801 TCTCAGATTT TCATCCGTAA AATTATTACT TTAATTTTGT TAACTCTTCT TTTAAACATTN E E K L A LL Q I R I T E I YR S Y I4861 TATTTTCCTC TTTGAGAGCT AAAAGTTGTA TTCTAATTTC GGTTATATAC CTACTATAAAN D I I K Y QN K L Q D V I M CL E K I4921 TATTATCTAT AATTTTATAT TGGTTCTTAA GTTGATCTAC TATCATACAT AATTCTTTTAE Q R Y K E D L E K L I S N C KI D I E4981 TCTCTTGGCG ATATTTTTCA TCGAGTTCTT TTAGAATACT ATTACACTTT ATATCAATTTS K I E K I N S D Y E E N I T KI F D S5041 CTGATTTTAT TTCTTTTATG TTACTATCAT ATTCTTCATT TATTGTTTTT ATGAAATCACM V S G L A K N N RR I I M [ORF6]5101 TCATGACACT TCCAAGAGCT TTATTATTCC TACGTATTAT CATTTTAAAA ATCTAAATTA5161 TTGTTTATTA TATTTACATA TGTTATAAAC ATTATTTTTA AGTATTGCCA ATTAATAAAT5221 ATAGTTCATC ACGATCATCT GAAGTATCTT ATCATCCCGC GGCATAATTT TATATTTTAG5281 TATATTTGGT TTATTACGTG CGTAGATTTA GAATCTTTAT TCACACCCGA TTATTGTGTT5341 GATAGTATAT AATATTAAAA CAATGGAGTT TTAAGCTCTA CCAGAAGATA TCATTAAGTA5401 TAGCGTTCTA TATGATCTAA AACATGTATA TTGTACCTAG TGATAATAGC ATTTTTACCA5461 TTTTCGTTTA TATTGCTAGC TCATCTATAC GTAACTTTAT GGTTTATTAG CTATCTCATG* M N N D DN L L I I E K L Q DM L S5521 TAACTACATA TTGTTATCAT CGTTTAACAG TATTATTTCT TTTAACTGAT CCATTAAACTK K H I L E YE L Q Y S D Q I Y SN Y F5581 TTTTTTATGT ATTAGCTCAT ATTCTAATTG ATAAGAATCT TGTATGTAAC TATTTATAAAK V V K L S FL P S I W H S I H LI L D5641 CTTTACTACC TTCAAAGAAA ATAGAGGAGA AATCCAATGT GAAATATGTA ATATAAGGTCR H V Y L E ST E S Y S V V N L VI G R5701 GCGGTGGACG TACAATTCAC TTGTTTCGCT GTACGATACC ACATTTAATA CTATTCCCCTY D Y Y D N CS R N I R D L E N IL E V5761 ATAATCGTAG TAGTCATTGC ATGATCTATT TATCCTGTCT AATTCATTTA TTAATTCTACS S E K S M WD L I D R G R S S CL R T5821 GGAGGACTCC TTACTCATCC AATCTAATAT ATCTCTTCCT CTAGAACTAC ATAACCTTGTA N I Y E N EK M M I I E I D E YS L K5881 AGCATTTATG TATTCATTTT CTTTCATCAT AATAATTTCT ATATCTTCGT AACTTAGCTTC F N N N I SE V K I E M [ORF3]5941 ACAAAAGTTA TTATTGATCG ATTCTACTTT GATTTCCATA TTGAATAATT GTTATAAGCT6001 GGAATACAAA TACTTAATTT TCATAATTTG TTAATAACCT AAATATTTGT ATTTCTCTAT6061 AAAAACCACA TACAAAAACT ATTTACATTA TTATTCCAGA CAATAGATTA TGGTATTTT* 6121 GGGATCGGTA CAAGCAAGTG TTATAAAGCA AGTAAATCTG GCCTCGAATT CAACATAATCK W L M V AK E E S S R V N C RK C F I6181 ACTTCCACAA CATAACCGCT TTCTCTTCCG AAGATCGGAC ATTACATCTT TTACAGAAAAD I W R G KL F Y I K V T D G EV A C L6241 TATCAATCCA CCTTCCCTTC AAAAAGTAGA TTTTTACAGT ATCCCCTTCT ACAGCACAGAQ K P A T FN I N K I I Q L T FC G D E6301 GCTGTTTAGG AGCGGTAAAG TTTATATTTT TTATGATCTG TAATGTAAAA CAACCATCCTT R G N Q YN L P D L A S A L IS K M S6361 CTGTACGGCC GTTTTGATAA TTCAAAGGAT CTAAAGCGGA TGCCAGAATA CTTTTCATCGE Q G I Y RV K F K L V M [ORF8]6421 ACTCTTGACC TATGTATCTT ACTTTAAAAT CCAGCACCAT AATGGATATA TGTAAGATTC* N Q S H QI S N6481 AGGTCAGCCT CGCTAGGCAT TTAGTTCTGT TTTCAATTTT GTGAATGTTG TATGGAATTGS I I S L D TN D L L L V I Q N KI E I6541 CTGATTATAC TAAGATCTGT GTTATCTAAA AGTAATACTA TTTGGTTCTT TATCTCTATGP L M D W L RN E L R S N I T Y L A V D6601 GGCAACATAT CCCATAAAGT ATTTTCCAGC CTTGAGTTAA TTGTATAAAG AGCGACATCTL C K R L N MA S N I A N Q L L S K Y I6661 AAACATTTTC TTAAATTCAT TGCTGAATTT ATAGCATTTT GCAATAACGA TTTGTAAATAP F S S I N IS S F K D N T V L R S L F6721 GGGAAAGACG AAATATTAAT AGAACTGAAT TTGTCATTTG TTACTAACCT TGATAGGAATK I N S T T IF I D L S Y R N S I R I E6781 TTTATATTAC TTGTAGTTAT AAATATATCC AATGAATACC TATTACTAAT TCGTATTTCTK M R K L E IE C S T K I N Q L L K D N6841 TTCATCCTTT TCAGTTCTAT TTCACATGAT GTTTTAATGT TTTGTAGCAA CTTATCGTTTR I L E M N IG S G P M N R G D L I S F6901 CTTATTAATT CCATATTAAT CCCGGAGCCT GGCATATTTC TACCATCTAA TATACTAAAAD Q L V V Y P I I YE A S L R S K L I A6961 TCTTGTAACA CTACGTAAGG AATTATGTAT TCGGCTGATA ACCTAGACTT TAAGATAGCGN K L P T Y G Y L NI T N P N A G K E L7021 TTCTTCAGCG GTGTATAACC GTATAAATTA ATGGTATTAG GATTAGCGCC TTTCTCTAATL L K V I E P H H VG N D L P T S G I I7081 AATAATTTAA CTATTTCCGG ATGATGTACT CCGTTATCTA AGGGAGTACT TCCTATTATCK D K A D I S V G YS L L L N V V D V S7141 TTGTCCTTTG CATCAATAGA TACTCCGTAA GAAAGAAGCA GATTTACGAC ATCGACGGAAG Y A A A N H L P TY G H I N S I N P D7201 CCGTATGCCG CCGCATTATG TAAAGGCGTA TATCCGTGGA TATTAGAGAT ATTAGGATCTA G K E I L L K S ID K N G C A H M [ORF2]7261 GCTCCTTTCT CTATCAGTAA TTTGCTAATA TCCTTGTTTC CACACGCGTG CATTAAAGGA7321 GTGCTCCCTA TGTTGTCTTT TATATCCACG GATGAACCGT ATGAAATTAA CGCATTAACA7381 GTTTCAACGG ATCC
表2 7.3kbBamHI片段的部分核苷酸序列同英国HP-438株FPV11.2kb中相应序列最大同源性比较6010 6020 6030 6040 6050 6060BAM.DNA GGAATACAAATACTTAATTTTCATAATTTGTTAATAACCTAAATATTTGTATTTCTCTAT::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::7.0 DNA 6GAATACAAATACTTAATTTTCATAATTTGTTAATAACCTAAATATTTGTATTTCTCTAT6000 6010 6020 6030 6040 60506070 6080 6090 6100 6110 6120BAM.DNA AAAAACCACATACAAAAACTATTTACATTATTATTCCAGACAATAGATTATGGTATTTTT::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::7.0 DNA AAAAACCACATACAAAAACTATTTACATTATTATTCCAGACAATAGATTATGGTATTTTT6060 6070 6080 6090 6100 61106130 6140 6150 6160 6170 6180BAM.DNA GGGATCGGTACAAGCAAGTGTTATAAAGCAAGTAAATCTGGCCTCGAATTCAACATAATC::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::7.0 DNA GGGATCGGTACAAGCAAGTGTTATAAAGCAAGTAAATCTGGCCTCGAATTCAACATAATC6120 6130 6140 6150 6160 61706190 6200 6210 6220 6230BAM.DNA A-CTTCCACAACATAACCGCTTTC-TCTTCCGAAGA-TCGGACATTACATCTTTTACAGA: :::::::::::::::::::::: ::::::::::: ::::::: : :: : : : :7.0 DNA ACCTTCCACAACATAACCGCTTTCTTCTTCCGAAGATTCGGACA--ATCGCTATGATAAA6180 6190 6200 62106220 62306240 6250 6260 6270 6280 6290BAM.DNA AAATATCAATCCACCTTCCCTTCAAAAAGTAGATTTTTACAGTATCCCCTTCTACAG-CA:: : : : ::: :: : ::::: :: :: :::: : :: ::7.0 DNA AGTATTTACTAGTCGTTGAAATAAAGATGTAGAATTGCCCATTATATTATAATTTAGTCA6240 6250 6260 6270 6280 62906300 6310 6320 6330 6340 6350BAM.DNA CAGAGCTGTTTA--GGAGCGGTAAAGTTTATATTTTTTATGATCTGTAATGTAAAACAAC: : :::::: ::: : : ::: ::: : : : : : :: :7.0 DNA CTTATTTGTTTATTTTTTTAGTACACGCTCTATCTTTCTTTACATCATAAG-GCAATATT6300 6310 6320 6330 6340 63506360 6370 6380 6390 6400 6410BAM.DNA CATCCTCTGT-ACGGCCGTTTTGATAATT-CAAAGGATCTAAAGCGGATGCCAGAATACT::: : : : :::: :::: :: : : : : : : ::: : : : :7.0 DNA TATCATATATCACGATAATCAGGATATTTATATATGTTTAATAACGGCTTTTA-CGTTTT6360 6370 6380 6390 6400 64106420 6430 6440 6450 6460 6470BAM.DNA TTTCATCGACTCTTGACCTATGTATCTTACTTTAAAATCCAGCACCATAATGGATATATG:: :: : : :: : ::: : : :: : : : : :: : : ::: :7.0 DNA ATTGATTAAGAC--GA-CACGGTAACAAAATTAATATACTTATATTGTACT--ACATA-G6420 6430 6440 645064606480 6490 6500 651065206530BAM.DNA TAAGATTCAGGTCAGCCTCGCTAGGCATTTAGTTCTGTTTTCAATTTTGTGAATGTTGTA: :: : :: :: ::: : :: : :: : :: : : : :: : ::7.0 DNA TTAGCAAAATATCTATTAGAATACTTGTTTTG-CCTATGTTTACTTCTAT-ATTGCTATA6470 6480 6490 6500 6510 65206540 6550 6560 6570 6580 6590BAM.DNA TGGAATTGCTGATTATACTAAGATCTGTGTTATCTAAAAGTAATACTATTTGGTTCTTTA: : : : : :: ::::: : : : : : :::: : :::: ::7.0 DNA TAAGACTTATCACCTTCAATATTTCTGTTTGTACCATATTCATGACTAGATTTTTCTATA6530 6540 6550 6560 6570 65806600 6610 6620 6630 6640 6650BAM.DNA TCTCTATGGGCAACATATCCCATAAAGTATTTTCCAGCCTTGAGTTAATTGTATAAAGAG:: ::: : : ::: :::::: : :: : : : : :: :7.0 DNA TCAAAATATATATTTAGTTATAAAAATAATTTTATTTCATAGATGTGA---TGTCAA--G6590 6600 6610 6620 66306660 6670 6680 6690 6700 6710BAM.DNA CGACATCTAAACATTTTCTTAAATTCATTGCTGAATTTATAGCATTTTGCAATAACGATT: : : : : : :: :: : :: :: :::: :::: :::::7.0 DNA CTCTTTATTGCCTATATATTCAAGT--ATGTTGTATTT----TATTTCATAGATGCGATG6640 6650 6660 66706680 66906720 6730 674067506760 6770BAM.DNA TGTAAATAGGGAAAGACGAAATATTAATAGAACTGAATTTGTCATTTGT-TACTAACCTT: : :: : : : ::::: : : ::: : :: :::::::7.0 DNA TCAAGCTCTTTATTGCCTATATATTCAAGTATGTTGTATTTTATTTCGTGGGGTAACCAA6700 6710 6720 6730 6740 67506780 6790 6800 6810 6820BAM.DNA GATAGGAATTTTATATTACTTGT-AGTTATAAATATATCCAATGAATACCT-ATT-ACTA: :: :: :: :: : :: : :: ::: : :: :: ::: : ::7.0 DNA TTCCATTTTGTTTCATCACCAGTAATTTTTTCATCTATAACTCGCATCGCTGATTCAATA6760 6770 6780 6790 6800 68106830 6840 6850 6860 6870 6880BAM.DNA -ATTCGTATTTCTTTCAT-CCTTTTCAGTTCTATTTCACATGATGTTTTAATGTTTTGTA::: : : : :: :: : :: : : : ::: : :: : :::::7.0 DNA GCTTCCGCTCTTTGCGATGCCGTGTCTG--CCAATTCTTTTAATAGATATTTGTAGAATA6820 6830 68406850 6860 68706890 6900 6910 6920 6930 6940BAM.DNA GCAACTTATCGTTTCTTATTAATTCCATATTAATCCCGGAGCCTGGCATATTTCTACCAT::::: : : : : : :: :: : : :: :: : : :::7.0 DNA TGGCATTATC-ATAGAGACCTAAT--ATTTTTCTAGAATGTCTTGCCAATATGTTCTCAT
6880 68906900 6910 69206950 6960 6970 69806990 7000BAM.DNA CTAATATACTAAAATCTTGTAACACTACGTAAGGAATTATGTA--TTCGGCTGATAAC-C: : : : : :: :::: :: :::: :::: ::: : :: : : :7.0 DNA CAAGATTTTTGGATGGTTTTAAACACAGGTCCAGAATGTTGTAGGTTCTGATGCTTTCGC6930 6940 6950 6960 6970 69807010 7020 7030 7040 7050 7060BAM.DNA T-AGACTTTAAGATAGCGTTCTTCAGCGGTGTATAACCGTATAAATTAATGGTATTAGGA: :: :: :: : : : :::: :::: : :: :7.0 DNA TGTTTATTCTCCTTAATTCAATTTTACATTTTTCAAATACATCTTTTAAACGACTTTTGC6990 7000 7010 7020 7030 70407070 7080 70907100 7110BAM.DNA T--TAGCGCCTTTCTCTAATAATAATTTAACTATTTCCG--GATGATGTACTCCGTTATC: :: : :: :: :: :: : :::: ::: :::: ::::7.0 DNA TGTTAATGACTGTCATGTTTCTGGAAAATCCTTTATCCGATGATATTGTATTTGTATAT-7050 7060 7070 7080 7090 71007120 7130 7140 7150 7160 7170BAM.DNA TAAGGGAGTACTTCCTATTATCTTGTCCTTTGCATCAATAGATACTCCGTAAGAAAGAAG: : : :: :: : : : : :: :: : : :: : : :7.0 DNA TGTCTTAATGCTATGTCCGCTATCAGCATATCCACGGATTCAGATTCTG-GATTTGTATC7110 7120 7130 7140 7150 71607180 7190 7200 7210 7220 7230BAM.DNA CAGATTTACGA-CATCGACGGAACCGTATGCCGCCGCATTATGTAAAGGCGTATA-TCCG:: ::: :: :::: : :: :: : :::: : : :: : ::7.0 DNA CATATTACAGATCATCTCTAAAGTTGTGTG-TTCTTCATT-CATCACGGTAAACACAATG7170 7180 7190 7200 7210 72207240 7250 7260 7270 7280 7290BAM.DNA TGGATATTAGAG-ATATTAGGATCTGC-TCCTTTCTCTATCAGTAATTTGCTAATATCCT: ::: :: : : : ::: : ::: : :::: : : : : : :7.0 DNA TTACTATCAGCGCCTCTCTTGAGAAACATGCTTACCATATCTATTTTGTTGTTTTGTATA7230 7240 7250 7260 7270 72807300 7310 7320 7330 7340 7350BAM.DNA TGTTTCCACA-CGCGTGCATTAAAGGAGTGCTCCCTATGTTGTCTTTTATATCCACGGAT: :::: ::: :: : :: : : : : : ::: : : : ::::7.0 DNA GCGTAGCACATCGCTGTCACACAGGGCCTTTTGCTGAAATAGTCAATGTTTGCTCCGGAA7290 7300 7310 7320 7330 73407360 7370 7380 7390BAM.DNA GAACCGTATGAAATTAACGCATTAACAGTTTCAACGGATCC7.0 DNA TCTAGCAACATCCTGCATACTTCTGTGTCTCCTTTGCTCAT7350 7360 7370 7380
表3 开放读码框架(ORF)编码氨基酸的分子生物学性质分析结果0RF 转录(bD) 大 小PI 信号肽 跨膜预测 糖基化位点始终氨基酸 Mr(kDa) 跨膜区膜中区1 416 1672 41848.0 5.17 - - - 154-156 155-157257-259 393-3952 C82 882 26629.7 8.64 - - - 21-23 193-1953 C1416 1871 15118.0 4.80 - - - 32-3464-664 C3336 3782 14816.5 8.27 - - - -5 4175 4597 14016.5 4.20 - - - 37-396 C2252 2569 10512.5 8.23 - - - -7 2362 2670 10212.1 6.35 - - - 53-558 C935 1216 9310.7 9.40 - - -9 2166 2432 8810.4 9.27 - 9-42 17-33 66-6871-7310 3674 3928 849.19.35 - - - 60-6211 2084 2302 728.40 10.12 - - - 16-1845-4权利要求
1.一种新的鸡痘病毒基因，其特征在于该病毒基因组成如表1表17.3kbBamH1片段的核苷酸序列和开放读码框架(ORF)分析1GGATCCGACG CGGCTGCCAA GACCTTTATA CCCGACTCTC GTTCTACTGG ACGAACGCGG61 AGATTTAAAG CCATGGCTGA CGTATAGTCG AGGACGCCCT CGGTAATAAA TTGATTATAT121 TTTCAGTTTT AAAAAATTAA TTTATATGTA CTCAATATCC TTATATAGAA TTATTTTATC181 TCTTCTGATA TACGTTAGGT AGATGCCGTT CAAATAATAA AATATCTGAT GACGTTTTTA241 TGCGCGTGTT ACGTTATTAT AATAGATAAT AGAAATAAAC GTTAAAATAA TAATTAATTA301 TCTTTTCAGT TGTTAAATAT ATTCTAGTTT TATAAGCGTT ATTCATATAT AAAAAATATA361 AAAACTAAAT CGTATTTAGT ATGATGCTAC GGCGGTCATT TAACAAATTT ACGCGATGGA[ORF1] M E421 GTTCAGTTGT ACGGGAACTA ATAACCAGTT GGCCGTTCAC AGATTTACAG AAACGCGTTTF S C T G T N N Q L A V H R F T E T R F481 TACATCTTTC AAAAAAGAAC TTTTAGTTAA TTTAGGAATA AGTGACTTAA ATGATATAAAT S F K K E L L V N L G I S D L N D I K541 AAACATATGC GAGGATTCTA AAATATTCTT TCCGGAAAAG AGAACGGAGC TCTTAAGTATN I C E D S K I F F P E K R T E L L S I601 TAAAGATCGT AAATCTAAAC AAATAGTTTT CGAAAACTCC CTAAACGATG ACTTGCTTAAK D R K S K Q I V F E N S L N D D L L K661 AAAATTACAC GCCTTGATCT ATGATGAATT AAGTACGGTA GTAGATTCCG TTACCGTAGAK L H A L I Y D E L S T V V D S V T V E721 GAATACCGTT ACATTGATTA TGTATGAAAA AGGAGATTAC TTTGCCAGGC ATAGAGATTTN T V T L I M Y E K G D Y F A R H T D F781 TAGTACCGTC TTTTCTAAAA ACATAATATG CGTTCACCTG CTTCTATATT TGGAACAACCS T V F S K N I I C V H L L L Y L E Q P841 AGAAACGGGA GGTGAAACGG TTATATATAT CGATAATAAT ACGTCAGTGA AATTAAAAACE T G G E T V I Y I D N N T S V K L K T901 AGATCATCTA TTTGATAAAA CTATAGAACA TGAAAGTATT ACCGTTGAAA GCGGTAGAAAD H L F D K T I E H E S I T V E S G R K961 ATGCGTGGCG TTATTCGATG TCTTACTAGA AAAAAAGTTA TCCGCGTCAA CAAACGTAATC V A L F D V L L E K K L S A S T N V I1021 AGGTAGCATA GAATACTTAG GTAAAAAAAT AAATTTATAT GACAGAGAAA ATGATCTTCAG S I E Y L F K K I N L Y D R E N D L Q1081 GTTGTGTTAT TGTGATATGG TAATAGAAAG AATGACAGAA GATAAAGAAT ATAGCCTAGGL C Y C D M V I E R M T E D K E Y S L G1141 AATGATATCT GATAGATCAG GTAGATGTAT AAAATCTCAT CATAACGGTA GTATTGTTAGM I S D R S G R C I K S H H N G S I V R1201 ATACCGTAAA GAAGAATATG GATCTTTCGA 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2.一种新的鸡痘病毒基因的生产方法，其特征在于用限制性内切酶BamHI消化中国鸡痘病毒282E4弱毒疫苗株基因组，获得7.3kb片段；在该片段经亚克隆后获得的A、B、C和D四个片段；在B和D片段的BglII和EcoRV位点插入含有相应启动子的外源基因后，共同转染鸡胚成纤维细胞；导入FPV中，可使目的基因执行表达，并将其制备成免疫制剂或者重组疫苗，可作为人或者动物预防多种细菌、寄生虫或病毒性疾病的基因重组免疫原。
3.根据权利要求2所述的生产方法，其特征在于鸡痘病毒为中国鸡痘病毒FPV鹌鹑化弱毒282E4疫苗株基因组DNA 7.3kb BamHI片段全序列，此序列位于FPV基因组末端重复序列附近，其长度为7 394bp，含11个开放读码框架，ORF9编码的蛋白为跨膜蛋白。
4.根据权利要求2所述的生产方法，其特征在于外源基因可是细菌、寄生虫或者病毒的保护性抗原。
5.根据权利要求4所述的生产方法，其特征在于外源基因可是P11P7.5-LacZ报告基因。
全文摘要
本发明是利用限制性内切酶BamHⅠ消化中国鸡痘病毒282E4弱毒疫苗株基因组,获得7.3kb片段。在该片段经亚克隆后获得的A、B、C和D四个片段,在其中B和D片段的BglⅡ和EcoRV位点分别插入P11P7.5－LacZ报告基因,与FPV共转染鸡胚成纤维细胞,经X－gal显色后进行蓝斑筛选,证明此二片段为FPV非必需区。该片段中共含11个开放读码框架,其中ORF9编码蛋白为跨膜蛋白。对此片段分析,为构建FPV表达载体,插入外源基因后,可用于基因工程重组疫苗的制备。
文档编号C12N15/34GK1245832SQ9811736
公开日2000年3月1日 申请日期1998年8月21日 优先权日1998年8月21日
发明者金宁一, 郭志儒, 顾万钧, 司兴奎, 孙明, 王宏伟, 刘东海, 李萍, 殷震 申请人:中国人民解放军农牧大学