专利名称：荧光量子点/纳米金属颗粒偶联物及其制备和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及纳米材料，尤其是ー种荧光量子点/纳米金属颗粒偶联物、其制备方法和其在检测金属离子中的应用。
背景技术：
在环境中(尤其是淡水中)，金属离子如汞、铅、铜、锰、镉、铬等的污染对人类的健康和经济的可持续性发展有着极大的危害。因此，金属离子的检测(尤其是在现场进行实时和高灵敏度的金属离子检測)日益重要。然而，传统的金属离子检测方法，如色谱法、原子吸收光谱法等需要昂贵的仪器和冗长的样品准备、分析测试和数据处理步骤，难以做到对样品(如水体、食品、饮料等)进行实时的现场检測。量子点(Quantum Dot，QD)，又称为纳米晶或人造原子，是ー种由II-VI族或III-V 族元素组成的准零维(quasi-zero-dimensional)的纳米颗粒。通常，量子点在三个维度上的尺寸都在100纳米(nm)以下。由于量子限域效应(quantum confinement effect)，量子点中的电子和空穴具有分立能级结构，受激后可以发射荧光。通过控制量子点的形状、结构和尺寸，可以方便地调节其能隙宽度、激子束缚能的大小以及激子的能量蓝移等电子状态。 随着量子点尺寸的逐渐减小，量子点的光吸收谱出现蓝移现象。尺寸越小，则谱蓝移现象也越显著，即所谓的量子尺寸效应。由于量子点可吸收所有高于其带隙能量的光子，而发射的光波长(即颜色)具有尺寸依赖性，因此可用尺寸不同的同类量子点形成发光波长(即颜色)不同的一系列标记物。量子点按其几何形状，可分为箱形量子点、球形量子点、四面体量子点、柱形量子点、立方量子点、盘形量子点和外场(电场和磁场)诱导量子点；按其电子与空穴的量子封闭作用，量子点可分为1型量子点和2型量子点；按其材料組成，量子点又可分为元素半导体量子点，化合物半导体量子点和异质结量子点。此外，原子及分子团簇、超微粒子和多空硅等也都属于量子点范畴。金属纳米颗粒(Nanometer Particle, NP)可以作为ー种通用的荧光湮灭基团。 Maxwell 等人(Dustin J. Maxwell, Jason R. Taylor, and Shuming Nie. Self-Assembled Nanoparticle Probes ior Recognition and Detection oi Biomolecules. Journal oi the American Chemical Society. 2002，124，9606-9612)在寡核甘酸探针分子的两端分别标记纳米金颗粒(AuNP)和荧光激发基团，探针由于碱基互补形成“发卡”结构，荧光激发基团和纳米金颗粒靠近，引起激发荧光湮灭；而当探针与特异性靶DNA结合后，其构象发生变化，纳米金颗粒和荧光激发基团分离，从而激发出荧光。该原理可用于核酸的实时荧光检測，以及单碱基突变多态性检测等。中国专利申请CN101482508A公开了ー种高灵敏检测痕量金属离子的方法，包括 将用单链DNA探针修饰的贵重金属与用单链DNA探针修饰的量子点通过作为对目标金属离子具有特异活性的DNA酶的底物的单链DNA连接形成偶联物，将所述偶联物在所述DNA酶的存在下与样品接触，当样品中无目标金属离子时，贵重金属淬灭荧光量子点的荧光从而检测到较弱的荧光强度，当样品中含有目标金属离子吋，DNA酶被激活并切断底物DNA，使贵重金属与荧光量子点分离，贵重金属对荧光量子点荧光的淬灭效应消失，从而检测到增强的荧光強度，由此实现对金属离子的检测。然而，仍然需要各种荧光量子点/纳米金属颗粒偶联物以满足不同需求，特别是以更高的灵敏度检测金属离子。
发明内容
本发明的ー个方面提供ー种荧光量子点/纳米金属颗粒偶联物，包括-由第一单链DNA探针修饰的荧光量子点；-由第二单链DNA探针修饰的纳米金属颗粒；和-偶联所述纳米金属颗粒和所述荧光量子点的第三单链DNA，其中所述第三单链 DNA包含与第一单链DNA探针的至少部分序列互补结合的第一序列、与第二单链DNA探针的至少部分序列互补结合的第二序列和位于第一序列和第二序列之间以单链形式存在的第三序列，其中所述纳米金属颗粒和所述荧光量子点之间的距离使得所述纳米金属颗粒能够淬灭所述荧光量子点发出的荧光，所述第三序列能够在目标物存在并激活对该目标物具有特异活性的DNA酶时被所述DNA酶切断使得所述纳米金属颗粒离开所述荧光量子点从而不再淬灭所述荧光量子点发出的荧光，并且所述荧光量子点与所述纳米金属颗粒的摩尔比为约1 10至约20 1。根据本发明荧光量子点/纳米金属颗粒偶联物的一些实施方式，其中所述荧光量子点选自CcKe量子点、CdS量子点、CdTe量子点、CdSe/ZnS量子点、CdTe/CdS/ZnS量子点、 CdSe/CdS量子点和其任意組合。根据本发明荧光量子点/纳米金属颗粒偶联物的一些实施方式，其中所述纳米金属颗粒选自金纳米颗粒、银纳米颗粒和其任意組合。根据本发明荧光量子点/纳米金属颗粒偶联物的一些实施方式，其中所述荧光量子点的尺寸为1纳米至50纳米，优选为2纳米至10纳米。根据本发明荧光量子点/纳米金属颗粒偶联物的一些实施方式，其中所述纳米金属颗粒的尺寸为2纳米至100纳米，优选为5纳米至30纳米。根据本发明荧光量子点/纳米金属颗粒偶联物的一些实施方式，其中所述第三序列是所述DNA酶的底物链。根据本发明荧光量子点/纳米金属颗粒偶联物的一些实施方式，其中所述目标物选自天然和合成的有机和无机化合物，优选选自与所述纳米金属颗粒不同的金属及其离子和化合物，更优选选自汞、铅、铜、锰、镉、铬、铀及其离子和氧化物。根据本发明荧光量子点/纳米金属颗粒偶联物的一些实施方式，其中所述荧光量子点与所述纳米金属颗粒的摩尔比优选为约1 10、约1 5、约1 2、约1 1、约2 1、 约5 1、约10 1或约15 1，更优选为约3. 2 1。根据本发明荧光量子点/纳米金属颗粒偶联物的一些实施方式，其中所述第三单链DNA还包括位于第一序列和第三序列之间的第四序列和/或位于第二序列和第三序列之间的第五序列，所述第四序列和/或第五序列能够与所述DNA酶互补配对。
根据本发明荧光量子点/纳米金属颗粒偶联物的一些实施方式，其中所述荧光量子点/纳米金属颗粒偶联物还包括与所述第四序列和/或第五序列互补结合的所述DNA 酶。根据本发明荧光量子点/纳米金属颗粒偶联物的一些实施方式，其中纳米金属颗粒的粒径为5-100纳米，优选5-30纳米，更优选约13纳米；第一单链DNA探针与荧光量子点的摩尔比为10-200 1，优选50 1 ；由第一单链DNA探针修饰的荧光量子点的浓度为10-200nM，优选50-150nM，更优选80nM ；第二单链DNA探针与纳米金属离子的摩尔比为10-200 1，优选100 1 ；由第二单链DNA探针修饰的纳米金属离子的浓度为 5-100nM,优选25-50nM，更优选25nM ；作为底物DNA的第三单链DNA的浓度为50_500nM，优选 100-400nM,更优选 200nM。本发明的另一方面提供一种制备前述根据本发明的荧光量子点/纳米金属颗粒偶联物的方法，包括-提供由第一单链DNA探针修饰的荧光量子点；-提供由第二单链DNA探针修饰的纳米金属颗粒；-提供第三单链DNA，包含能够与第一单链DNA探针的至少部分序列互补结合的第一序列、能够与第二单链DNA探针的至少部分序列互补结合的第二序列、和位于第一序列和第二序列之间以单链形式存在的第三序列，所述第三序列能够在目标物存在并激活对该目标物具有特异活性的DNA酶时被所述DNA酶切断；-将所述由第一单链DNA探针修饰的荧光量子点、所述由第二单链DNA探针修饰的纳米金属颗粒和所述第三单链DNA混合以得到所述荧光量子点/纳米金属颗粒偶联物，其中所述由第一单链DNA探针修饰的荧光量子点与所述由第二单链DNA探针修饰的纳米金属颗粒的摩尔比是约1 10至约20 1，优选为约1 10、约1 5、约1 2、 约1 1、约2 1、约5 1、约10 1或约15 1，更优选为约3.2 1。根据本发明的制备前述根据本发明的荧光量子点/纳米金属颗粒偶联物的方法， 其中在将所述荧光量子点和所述纳米金属颗粒混合以通过第三单链DNA偶联所述纳米金属颗粒和所述荧光量子点吋，所用的DNA杂交的退火曲线是在80摄氏度下保持5分钟，然后冷却到室温。本发明的再另一方面提供ー种前述根据本发明的荧光量子点/纳米金属颗粒偶联物用于检测目标物的用途。本发明的再另一方面提供一种组合物，含有前述根据本发明的荧光量子点/纳米金属颗粒偶联物。在需要吋，所述组合物还含有能够在目标物存在时被激活并切断第三序列的对该目标物具有特异活性的DNA酶。本发明的再另一方面提供一种组合物，含有前述根据本发明的荧光量子点/纳米金属颗粒偶联物，所述偶联物包括与所述第四序列和/或第五序列互补结合的所述DNA酶。在一些情况下，上述组合物还包括氯化钠，其浓度为0. 01-0. 3mM,优选0. 15M。本发明的再另一方面提供ー种试剂盒，含有根据本发明的荧光量子点/纳米金属颗粒偶联物和能够在目标物存在时被激活并切断第三序列的对该目标物具有特异活性的 DNA 酶。本发明的再另一方面提供ー种试剂盒，含有根据本发明的荧光量子点/纳米金属颗粒偶联物，所述偶联物包括与所述第四序列和/或第五序列互补结合的DNA酶，其中所述 DNA酶对目标物具有特异活性从而在该目标物存在时被激活以切断第三序列。本发明的再另一方面提供ー种试剂盒，含有-由第一单链DNA探针修饰的荧光量子点；-由第二单链DNA探针修饰的纳米金属颗粒；和-第三单链DNA，包含能够与第一单链DNA探针的至少部分序列互补结合的第一序列、能够与第二单链DNA探针的至少部分序列互补结合的第二序列、和位于第一序列和第 ニ序列之间以单链形式存在的第三序列，所述第三序列能够在目标物存在并激活对该目标物具有特异活性的DNA酶时被所述DNA酶切断；和-以所述第三序列为底物的DNA酶，其中所述DNA酶对目标物具有特异活性从而在该目标物存在时被激活以切断第三序列，其中所述由第一单链DNA探针修饰的荧光量子点与所述由第二单链DNA探针修饰的纳米金属颗粒的摩尔比是约1 10至约20 1，优选为约1 10、约1 5、约1 2、 约1 1、约2 1、约5 1、约10 1或约15 1，更优选为约3.2 1。本发明的再另一方面提供一种检测样品中目标物的方法，包括-提供根据本发明的上述荧光量子点/纳米金属颗粒偶联物或其組合物；-提供能够在所述目标物存在时被激活并切断第三序列的对该目标物具有特异活性的DNA酶；-使所述荧光量子点/纳米金属颗粒偶联物和所述DNA酶与所述样品接触；-測量接触前后的荧光强度；-当接触后的荧光强度大于接触前的荧光强度时确定所述样品中存在目标物和/ 或根据标准曲线计算样品中目标物的浓度。本发明的再另一方面提供一种检测样品中目标物的方法，包括-提供根据本发明的含有DNA酶的上述荧光量子点/纳米金属颗粒偶联物或其组合物，其中所述DNA酶对所述目标物具有特异活性并在所述目标物存在时能够被激活并切断第三序列；-使所述荧光量子点/纳米金属颗粒偶联物与所述样品接触；-測量接触前后的荧光强度；-当接触后的荧光强度大于接触前的荧光强度时确定所述样品中存在目标物和/ 或根据标准曲线计算样品中目标物的浓度。意外地发现，根据本发明的荧光量子点/纳米金属颗粒偶联物，当其中的荧光量子点与纳米金属颗粒的摩尔比在特定的范围内吋，例如约1 10至约20 1，优选为约 1 10、约1 5、约1 2、约1 1、约2 1、约5 1、约10 1或约15 1，更优选为约3. 2 1吋，能够降低检测前(即与样品接触前)的荧光强度，并改善检测后(即与样品接触后)荧光强度的恢复，由此显著地提高了检测的灵敏度。
具体实施例方式以下结合实施例对本发明的一些实施方式进行进一歩的介绍，但并非意欲限制本发明的保护范围。
以下以金纳米粒子(AuNP)为例说明制备具有特定的荧光量子点(QD)与纳米金属颗粒(NP)摩尔比的荧光量子点/纳米金属颗粒(QD-NP)偶联物的一般方法。QD-AuNP偶联物的构建是通过单链DNA互补配对、杂交形成的，包括以下步骤-通过QD表面的羧基基团和第一单链DNA探针末端的氨基反应形成酰胺键而得到由第一单链DNA探针修饰的荧光量子点(QD-DNA)；-通过第二单链DNA探针末端的巯基和AuNP表面强的配位键合的作用获得由第二单链DNA探针修饰的金纳米粒子(Au-DNA)；-加入第三单链DNA，通过第三单链DNA与第一单链DNA探针和第二单链DNA探针的互补配对得到QD-AuNP偶联物。在制备QD-AuNP偶联物吋，也可以加入相应的DNA酶。在一些情况下，所述DNA酶能够与第三单链DNA的部分序列互补结合。在制备QD-DNA和Au-DNA的过程中，可以在反应中加入过量的DNA，反应后通过测量游离在溶液的DNA浓度来计算QD和AuNP表面的DNA探针数目。在形成QD-AuNP偶联物吋，可将QD与NP的摩尔比(例如摩尔比)调节为例如20 1、15 UlO 1、5 1、 3.2 1、2 1、1 1、1 2、1 5、1 IOU 15、1 20等，然后与作为底物的第三单链DNA和任选的DNA酶的连接。QD-AuNP偶联物的形成可以通过測定荧光强度来确定。实施例1 制备单链DNA探针修饰的金納米粒子金纳米粒子的合成可參见现有技术中的方法(J. J. Storhoff，R. Elghanian, R. C. Mucic, C. A. Mirkin, R. L. Letsinger. J. Am. Chem. Soc.，1998，120，1959—1964)。将 98 毫升水加入两ロ瓶中。加入2毫升50mM的HAuCl4溶液使得瓶中HAuCl4的浓度为ImM，在搅拌下加热至回流，然后迅速加入10毫升38. SmM的柠檬酸钠溶液，颜色在1分钟内从浅黄变为深红。继续回流20分钟，停止加热并在搅拌下冷却至室温03-25摄氏度)。所得纳米颗粒的粒径为13纳米，浓度为ΙΟηΜ。透射电镜(TEM)表明所得纳米颗粒为球形。由于柠檬酸钠修饰的金納米粒子在高盐浓度下不稳定，进一歩用 BSPP(C6H5P(C6H4SO3K)2)处理金納米粒子的表面以增强稳定性。具体而言，在新合成的IOOmL 纳米金溶液中加入0. IgBSPP粉末，室温下温和振荡过夜。随后，通过配基交換用亲和性更强的巯基化的单链 DNA 探针(5，-TTTTTTTTTACGCGTACTAGC，浓度为 25nM, DNA AuNP = 100 1)修饰的金納米粒子。动态激光散射仪测得粒径为13纳米。采用类似方法还制备了其它粒径例如16纳米、25纳米和35纳米的金納米粒子。所有这些金納米粒子的粒径分布都小于10%。实施例2 制备单链DNA探针修饰的荧光量子点通过ー步法反应制备了荧光量子点(參见Q. B. Wang，DUeo. JMater Sci.， 2009，44，816 ；Q. B. Wang, Y. Liu, Y. Ke, H. Yan. Angew. Chem.，Int. Ed.，2008，47，316 ； Q. B. Wang, N. Iancu, D. K. Seo. Chem. Mater.，2005，17 :4762 ；禾ロ Q. B. Wang, Y. Xu, X. Zhao, Y. Chang, Y. Liu, L. Jiang, J. Sharma, D. K. Seo, H. Yan. J. Am. Chem. Soc. , 2007,129,6380)。具体而言，如下制备了 MPA修饰的Cdk/ZnS核/壳型量子点。将0. 1毫摩尔P2&、 0. 5克3-巯基丙酸(MPA)以及0. 3毫升丁胺在10毫升N-甲基-2-比咯烷酮(NMP)中混合并加热溶解。冷却到室温后，加入0. 01克油胺修饰的Cdk核粒子(由北京中科物源生物技术有限公司提供，荧光峰为525nm)，然后与0. 05克ZnCl2的溶液混合。混合溶液在70摄氏度下加热1小时得到MPA修饰的Cdk/ZnS核/壳型量子点。所得Cdk/ZnS核/壳型量子点分散于pH为7. 5的磷酸缓冲液中。单链DNA修饰的荧光量子点(QD-DNA)可通过QD表面的羧基与DNA末端的氨基反应而得到，其中1-乙基-3-(3-ニ甲氨基丙基)碳酰ニ亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚月安(NHS)作为偶联剂(參见:Q. B. Wang, H. Wang, C. Lin, J. Sharma, S. Zou ；Y. Liu. Chem. Commum. ，2010，46，240)。具体而言，将50微升IM的EDC溶液和50微升IM的N-羟基磺基琥珀酰亚胺 (Sulfo-NHS)溶液加入200微升的上述MPA修饰的Cdk/ZnS核/壳型量子点的缓冲液中， 然后加入 80nM 的 DNA(5，-TCA CAG ATGAGT-amine-3，，DNA QD = 50 1)。在搅拌下室温孵育过夜。所得DNA修饰的Cdk/ZnS核/売型量子点(QD-DNA)经过滤纯化后在4摄氏度下储存。实施例3 制备荧光量子点/纳米金属颗粒偶联物在QD浓度为200nM的来自实施例2的QD-DNA溶液中，加入Au的浓度为8nM的来自实施例1的粒径为13纳米Au-DNA溶液，其中保持QD-Au结构中QD Au = 5 1，即 QD-DNA溶液2微升，Au-DNA溶液10微升，然后再在体系中加入对目标物具有特异性的DNA 酶GO μ M，0. 1微升)和相应底物DNA (40 μ Μ，0. 1微升)以及氯化钠溶液使氯化钠的浓度为0. 15mM，过夜退火杂交。DNA杂交的退火曲线是在80摄氏度下保持5分钟，然后缓慢冷却到室温。当目标物是铅时，所述 DNA 酶是 5，-CAT CTC TTC TCC GAG CCGGTC GAA ATA GTG 八6丁-3，，所述底物0離是3，-616 CTC AAC TGTGTA GAG AAG GrA TAT CAC TCA AGT GTC TAC TCA-5，。当目标物是铜时，所述 DNA 酶是 5，-GGT AAG CCT GGG CCT CTTTCT TTT TAA GAA AGA AC-3，，所述底物 DNA 是 3，-GTG CTC AACTGT CCA TTC GGC ATA ATC TTT CTT CGA AGT GTC TAC TCA-5，。以上序列均购自 IDT(Integrated DNA Technologies)公司。实施例4 用荧光量子点/纳米金属颗粒偶联物检测金属离子根据实施例3，用针对铅的DNA酶和底物DNA制备了 QD-AuNP偶联物，然后加入将 0.2 μ M的铅离子，其中測定了加入铅离子之前和之后的荧光强度。此外，作为參照还测定了 QD-DNA的荧光强度以及不含底物DNA和DNA酶的Au-DNA与QD-DNA的混合物的荧光强调。 在所有的样品中QD的浓度都保持一致。结果表明，QD-DNA作为游离QD的荧光强度为约500，Au-DNA与QD-DNA的混合物的荧光强度为约480，这说明是否含有Au-DNA对QD的荧光强度影响不大；QD-AuNP的初始荧光強度为约100(约为游离QD的荧光强度的20% )，相比游离QD的荧光强度有显著下降， 说明偶联在一起的AuNP对QD发出的荧光有淬灭效果；当0. 2 μ M的铅离子加入后，铅离子激活了 DNA酶从而切断了底物DNA，导致QD-AuNP中QD与AuNP之间的分离，AuNP对QD发出的荧光的淬灭效果下降，使得荧光强度恢复至游离QD的荧光强度的85%。对根据实施例3用针对铜的DNA酶和底物DNA制备的QD-AuNP偶联物也进行了类似实验。结果表明，QD-AuNP的初始荧光強度为约50(约为游离QD的10% )，同样说明偶联在一起的AuNP对QD发出的荧光有淬灭效果；当加入0. 2 μ M的铜离子后，荧光强度恢复至游离QD的荧光强度的56%。实施例5 荧光量子点与纳米金属颗粒的比例对荧光強度的影响采用实施例3的相同方法和针对铅的DNA酶和底物DNA，通过改变QD-DNA溶液和 Au-DNA溶液的用量比例，制备了一系列QD-AuNP偶联物，其中QD =AuNP的值分别为1 10、 3.2 1和25 1。分别测定其初始荧光強度和加入IyM 1 2+后的荧光强度。结果表明当QD AuNP = 25 1吋，初始荧光强度为300左右，加入1 μ M 1 2+后荧光强度増大到约 350;当QD AuNP = 3. 2 1吋，初始荧光強度为约50，加入0. 2 μ M 1 2+后荧光强度増大到约450;当QD AuNP = I 10吋，初始荧光強度为约100，加入1 μ M 1 2+后荧光强度增大到150左右。以上结果表明，当QD AuNP = 3. 2 1吋，偶联物在金属离子检测中显示了最佳的灵敏度，而QD AuNP过高或过低都将使检测的灵敏度下降。不受任何理论约束，认为在QD-DNA中加入不同比例的Au-DNA会产生不同的淬灭效果。如果QD/NP比例太低的话，即使加入金属离子使NP和QD实现了分离，过多的分散在溶液中的NP也会淬灭QD的荧光，使得读出的检测信号不明显，灵敏度下降。如果QD/NP比例太高的话，NP即使和QD通过DNA底物链和DNA酶实现了连接，由于NP的个数太少，不能对QD的荧光进行有效地淬灭，相当于提高了检测的本底噪音，同样使灵敏度下降。因此，适当选择QD NP的比例为约1 10至约20 1，例如约3.2 1吋，可以使QD-NP偶联物在检测前的荧光强度较低，而在检测后荧光強度恢复的程度较大，从而提高了检测的灵敏/又。以上通过举例说明的方式描述了本发明。但是，应当理解，本发明绝不仅仅限于这些具体实施方式
。普通技术人员可以对本发明进行各种修改或变动，而这些修改和变动都属于本发明的保护范围。
权利要求
1.ー种荧光量子点/纳米金属颗粒偶联物，包括-由第一单链DNA探针修饰的荧光量子点；-由第二单链DNA探针修饰的纳米金属颗粒；和-偶联所述纳米金属颗粒和所述荧光量子点的第三单链DNA，其中所述第三单链DNA包含与第一单链DNA探针的至少部分序列互补结合的第一序列、与第二单链DNA探针的至少部分序列互补结合的第二序列、和位于第一序列和第二序列之间以单链形式存在的第三序列，其中所述纳米金属颗粒和所述荧光量子点之间的距离使得所述纳米金属颗粒能够淬灭所述荧光量子点发出的荧光，所述第三序列能够在目标物存在并激活对该目标物具有特异活性的DNA酶时被所述DNA酶切断使得所述纳米金属颗粒离开所述荧光量子点从而不再淬灭所述荧光量子点发出的荧光，并且所述荧光量子点与所述纳米金属颗粒的摩尔比为约 1 10 至约 20 1。
2.根据权利要求1的荧光量子点/纳米金属颗粒偶联物，其中所述荧光量子点选自 CdSe量子点、CdS量子点、CdTe量子点、CdSe/ZnS量子点、CdTe/CdS/ZnS量子点、CdSe/CdS 量子点和其任意組合。
3.根据前述任意一项权利要求的荧光量子点/纳米金属颗粒偶联物，其中所述纳米金属颗粒选自金纳米颗粒、银纳米颗粒和其任意組合。
4.根据前述任意一项权利要求的荧光量子点/纳米金属颗粒偶联物，其中所述荧光量子点的尺寸为1纳米至50纳米，优选为2纳米至10纳米。
5.根据前述任意一项权利要求的荧光量子点/纳米金属颗粒偶联物，其中所述纳米金属颗粒的尺寸为2纳米至100纳米，优选为5纳米至30纳米。
6.根据前述任意一项权利要求的荧光量子点/纳米金属颗粒偶联物，其中所述第三序列是所述DNA酶的底物链。
7.根据前述任意一项权利要求的荧光量子点/纳米金属颗粒偶联物，其中所述目标物选自天然和合成的有机和无机化合物，优选选自与所述纳米金属颗粒不同的金属及其离子和化合物，更优选选自汞、铅、铜、锰、镉、铬、铀及其离子和氧化物。
8.根据前述任意一项权利要求的荧光量子点/纳米金属颗粒偶联物，其中所述荧光量子点与所述纳米金属颗粒的摩尔比优选为约1 10、约1 5、约1 2、约1 1、约2 1、 约5 1、约10 1或约15 1，更优选为约3. 2 1。
9.根据前述任意一项权利要求的荧光量子点/纳米金属颗粒偶联物，其中所述第三单链DNA还包括位于第一序列和第三序列之间的第四序列和/或位于第二序列和第三序列之间的第五序列，所述第四序列和/或第五序列能够与所述DNA酶互补配对。
10.根据权利要求9的荧光量子点/纳米金属颗粒偶联物，其中所述荧光量子点/纳米金属颗粒偶联物还包括与所述第四序列和/或第五序列互补结合的所述DNA酶。
11.一种制备根据权利要求1至10中任一项的荧光量子点/纳米金属颗粒偶联物的方法，包括-提供由第一单链DNA探针修饰的荧光量子点；-提供由第二单链DNA探针修饰的纳米金属颗粒；-提供第三单链DNA，包含能够与第一单链DNA探针的至少部分序列互补结合的第一序列、能够与第二单链DNA探针的至少部分序列互补结合的第二序列、和位于第一序列和第 ニ序列之间以单链形式存在的第三序列，所述第三序列能够在目标物存在并激活对该目标物具有特异活性的DNA酶时被所述DNA酶切断；-将所述由第一单链DNA探针修饰的荧光量子点、所述由第二单链DNA探针修饰的纳米金属颗粒和所述第三单链DNA混合以得到所述荧光量子点/纳米金属颗粒偶联物，其中所述由第一单链DNA探针修饰的荧光量子点与所述由第二单链DNA探针修饰的纳米金属颗粒的摩尔比是约1 10至约20 1，优选为约1 10、约1 5、约1 2、约 1 1、约2 1、约5 1、约10 1或约15 1，更优选为约3. 2 1。
12.根据权利要求1至10中任一项的荧光量子点/纳米金属颗粒偶联物用于检测目标物的用途。
13.—种组合物，含有根据权利要求1至9中任一项的荧光量子点/纳米金属颗粒偶联物和能够在目标物存在时被激活并切断第三序列的对该目标物具有特异活性的DNA酶。
14.一种组合物，含有根据权利要求10的荧光量子点/纳米金属颗粒偶联物。
15.ー种试剂盒，含有根据权利要求1至9中任一项的荧光量子点/纳米金属颗粒偶联物和能够在目标物存在时被激活并切断第三序列的对该目标物具有特异活性的DNA酶。
16.ー种试剂盒，含有根据权利要求10的荧光量子点/纳米金属颗粒偶联物。
17.—种试剂盒，含有-由第一单链DNA探针修饰的荧光量子点； -由第二单链DNA探针修饰的纳米金属颗粒；-第三单链DNA，包含能够与第一单链DNA探针的至少部分序列互补结合的第一序列、 能够与第二单链DNA探针的至少部分序列互补结合的第二序列、和位于第一序列和第二序列之间以单链形式存在的第三序列，所述第三序列能够在目标物存在并激活对该目标物具有特异活性的DNA酶时被所述DNA酶切断；和-以所述第三序列为底物的DNA酶，其中所述DNA酶对目标物具有特异活性从而在该目标物存在时被激活以切断第三序列，其中所述由第一单链DNA探针修饰的荧光量子点与所述由第二单链DNA探针修饰的纳米金属颗粒的摩尔比是约1 10至约20 1，优选为约1 10、约1 5、约1 2、约 1 1、约2 1、约5 1、约10 1或约15 1，更优选为约3. 2 1。
18.—种检测样品中目标物的方法，包括-提供根据权利要求1至9中任一项的荧光量子点/纳米金属颗粒偶联物； -提供能够在所述目标物存在时被激活并切断第三序列的对该目标物具有特异活性的 DNA 酶；-使所述荧光量子点/纳米金属颗粒偶联物和所述DNA酶与所述样品接触； -測量接触前后的荧光强度；-当接触后的荧光强度大于接触前的荧光强度时确定所述样品中存在目标物和/或根据标准曲线计算样品中目标物的浓度。
19.ー种检测样品中目标物的方法，包括-提供根据权利要求10的荧光量子点/纳米金属颗粒偶联物，其中所述DNA酶对所述目标物具有特异活性并在所述目标物存在时能够被激活并切断第三序列；-使所述荧光量子点/纳米金属颗粒偶联物与所述样品接触； -測量接触前后的荧光强度；-当接触后的荧光强度大于接触前的荧光强度时确定所述样品中存在目标物和/或根据标准曲线计算样品中目标物的浓度。
全文摘要
本发明涉及一种荧光量子点/纳米金属颗粒偶联物、其制备方法、含有该偶联物的组合物和试剂盒及其在检测目标物尤其是金属离子中的用途。
文档编号B82Y20/00GK102590160SQ201110020130
公开日2012年7月18日 申请日期2011年1月13日 优先权日2011年1月13日
发明者徐冰, 李勇明, 梶浦尚志, 王强斌 申请人:中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所, 索尼公司