专利名称：一种树状大分子稳定的硫化铋纳米颗粒的制备方法
技术领域：
本发明属硫化铋纳米颗粒的制备领域，特别是涉及一种树状大分子稳定的硫化铋纳米颗粒的制备方法。
背景技术：
纳米材料由于其尺寸的特殊性，具有许多奇特的物理化学性质，近年来被广泛地应用于医药、化工、纺织、航空航天、军事以及电子等领域。其中在生物医学领域，纳米材料被用于药物传递、细胞分离，医学成像、癌症的靶向诊断和治疗。在纳米材料领域中，硫化铋纳米材料由于具有和本体材料非常不同的性质，而被广泛应用于光电、传导、传感以及生化等诸多领域。除此之外，硫化铋纳米颗粒由于铋元素具有较高的原子序数和X-射线衰减性能，可以将其用作CT造影剂，提高CT成像的灵敏度。目前，硫化铋纳米材料的制备方法主要有溶胶-凝胶模板法、沉淀法、微乳液法、水热法、溶剂热法、Y射线照射法、微波法、回流法等。在这些方法中，溶剂热法和水热法最受关注° Zhu 等[Zhu, X. Y. , et al. , Morphology-controlled synthesis and characterization of bismuth sulfide crystallites via a hydrothermal method. Ceramics International, 2008. 34(1) :249-251.]用 Bi (NO3) 3 ·5Η20 和 CS (NH2)2 为原料，将添加了 KOH的反应物的水溶液置于高压釜中200°C下水热处理15h，得到了正交晶相的Bi2S3 微晶。Ma 等[Ma, X. Y. , et al. , Surfactant-assisted solvothermal synthesis of Bi2S3 nanorods. Journal of Crystal Growth, 2007. 306(1) :159-165.]用表面活性剂辅助的溶剂热法合成了 Bij3单晶纳米棒，并发现表面活性剂的种类、浓度、用量和温度等都对纳米粒子的形貌有较大影响。采用上述文献报道的制备方法可以得到各种独特形貌的Bij3纳米材料。然而溶剂热法需大量的有机溶剂，易造成环境污染，且反应需在高压釜中进行，限制了其大规模工业化生产；水热法也同样存在着需要使用高压釜的缺点，而且制得的纳米粒子易产生团聚。如果在制备过程中引入分散剂或者载体，可以在一定程度上解决这些问题。聚酰胺-胺(PAMAM)树状大分子作为一种高度支化的单分散大分子，已被广泛应用于模板或者稳定化试剂用于合成各种不同的纳米材料。PAMAM树状大分子具有非常均一的组成和结构，以它作为模板可以产生精致的纳米粒子复制品。由于纳米粒子被封闭在树状大分子内或树状大分子间而保持稳定，因此不会产生聚集。而且树状大分子具有良好的水溶性，在使用剂量下没有细胞毒性和免疫原性，能够通过肾脏从血液中清除，因此不需要其具备生物降解性。此外，树状大分子表面具有大量的功能基团，能够用于化学连接或修饰特定的靶向试剂、染料、药物分子等，在临床治疗和诊断方面发挥重要作用。用PAMAM树状大分子作为模板合成硫化铋纳米材料，可以通过树状大分子的封装或包裹，使纳米级的硫化铋颗粒保持稳定，制备过程环保，制得的纳米粒子不易团聚，克服了目前被普遍采用的水热法和溶剂热法所存在的缺点。检索国内外有关硫化铋纳米颗粒方面的文献和专利结果表明，目前树状大分子稳定的硫化铋纳米颗粒的制备方法还未见相关报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种树状大分子稳定的硫化铋纳米颗粒的制备方法，该方法操作简单，反应条件温和；所制备的树状大分子稳定的硫化铋纳米颗粒，尺寸分布较窄，具有良好的分散性，没有发生团聚现象，可潜在地应用于CT成像诊断，并已被成功地应用于兔子的活体成像。本发明的一种树状大分子稳定的硫化铋纳米颗粒的制备方法，包括(1)将末端为羟基的第四代聚酰胺-胺树状大分子按质量体积比为3 1-7 Ig/ mL溶解在稀醋酸溶液中，得到树状大分子的稀醋酸溶液；将Bi (NO3)3 ·5Η20按质量体积比为 1.5 1-3 lg/mL溶解在稀醋酸溶液中，得到铋盐的稀醋酸溶液；(2)按照Bi (NO3) 3 · 5H20与树状大分子的摩尔比为10 1-40 1将上述的树状大分子的稀醋酸溶液和铋盐的稀醋酸溶液混合，搅拌1- 后，持续通入气体，并在氮气保护的条件下室温搅拌反应1- ；反应结束后，继续搅拌8-9h，透析，冷冻干燥，即得树状大分子稳定的硫化铋纳米颗粒。步骤(1)中所述的稀醋酸溶液为质量百分比为10%的稀醋酸水溶液。步骤(1)中所述的Bi(NO3)3 · 5H20与树状大分子的摩尔比为10 1、20 1或 40 1。步骤O)中所述的所有过程均在避光条件下进行。步骤O)中所述的H2S气体摩尔数为Bi (NO3) 3 · 5H20摩尔数的1. 5倍。步骤O)中所述气体，由向Na2SdH2O固体中逐滴加入稀醋酸溶液后制得。步骤O)中所述的透析为用透析膜在缓冲溶液和超纯水中透析。上述的透析膜为纤维素透析膜MWCO = 10000 ；缓冲溶液为PBS缓冲溶液。上述的透析为分别在4L的PBS缓冲溶液中透析2 4次和4L的超纯水中透析 2 4次，共透析3天。步骤( 所得到的树状大分子稳定的硫化铋纳米颗粒为dendrimer-stabiIized Bi2S3nan0partiCles，简写为Bij3 DSNPs，且按铋原子与树状大分子的投料比将制备得到的纳米颗粒分别缩写为DSNP10，DSNP20和DSNP40。本发明的一种树状大分子稳定的硫化铋纳米颗粒可用于CT成像。本发明中采用了具有均一结构的末端为羟基的第四代聚酰胺-胺树状大分子为稳定剂，很好地防止了纳米颗粒的聚集；由于铋盐在纯水或偏碱性溶液中会水解产生沉淀， 以体积分数为10%的稀醋酸为溶剂可有效地避免此类现象的发生。本发明使用紫外-可见分光光度计(UV-Vis)、透射电子显微镜(TEM)测量等方法表征本发明制备的树状大分子稳定的硫化铋纳米颗粒，利用MTT法和相差显微镜来检验该纳米颗粒对( 一种小鼠成纤维细胞)的毒性，同时用CT测试来检验树状大分子稳定的硫化铋纳米颗粒的χ-射线衰减强度以及兔子活体皮下成像效果，具体测试结果如下(1)紫外-可见分光光度计(UV-Vis)的测试结果UV-Vis测试结果表明末端为羟基的第四代聚酰胺-胺树状大分子在250-800nm 处无明显的吸光值，但是本发明制备得到的纳米颗粒在250-800nm处可观察到一个平缓的
4吸收峰和明显的吸光值，且在纳米颗粒浓度相同的条件下，吸光值随铋元素在纳米颗粒中所占比例的增加而增加。参见附图1。这初步表明了本发明中制备得到的产物为硫化铋纳米颗粒。(2)透射电子显微镜(TEM)的测试结果TEM测试结果显示了 Bij3 DSNPs的尺寸及尺寸分布。Bi2S3 DSNPs的形貌为球形或准球形，不同Bi/树状大分子摩尔比合成的纳米颗粒的尺寸均分布在一个较窄的范围内 (7-9nm)，且随着纳米颗粒中铋含量的提高，其尺寸变化不大。参见附图2。DSNP20的能量分散谱(EDQ则证实了铋元素和金元素的存在，从而在UV-Vis测试结果的基础上进一步表明了本发明中制备得到的产物为硫化铋纳米颗粒。参见附图3。(3)MTT细胞活力测试和相差显微镜细胞形貌观察结果通过MTT法测定细胞(一种小鼠成纤维细胞)的活力，检测所合成材料的细胞毒性。该测试分两部分进行(1)L929细胞分别与DSNP10，DSNP20和DSNP40在浓度为 2000nmol/L和37°C的条件下共培养M小时。然后，经MTT处理后在570nm处测量吸光值， 并根据此值计算细胞的增殖及活力；(2)L^9细胞与DSNP20在浓度为100、500、1000、1500 和2000nmOl/L和37°C的条件下共培养M小时。然后，经MTT处理后在570nm处测量吸光值，并根据此值计算细胞的增殖及活力。不同投料比合成的材料和材料在不同浓度条件下对细胞增殖的影响分别与对照组(缓冲液PBS，pH 7.4)的统计结果相比较。与对照组相比，DSNP10, DSNP20和DSNP40在实验浓度下均未显示细胞毒性，且细胞活力随着Bi/树状大分子摩尔比的增加而略微增加。而DSNP20在从100-2000nmol/L的实验浓度范围内对细胞的存活率没有显著性差异。这表明Bij3 DSWs具有良好的生物相容性，便于各种生物医学应用。参见附图4。通过倒置相差显微镜观察了细胞的形貌和生长状态。可以看出，在2000nmol/L时 DSNP10, DSNP20和DSNP40处理的细胞均生长良好(见附图5(f)，(e)和(g))。由DSNP20 处理的细胞在浓度从lOOnmol/L增加到2000nmol/L的过程中，均保持伸展状态(见附图 5(a-e))0所观察到的细胞形貌和生长状态与MTT法得到的结果一致。参见附图5。 (4) X-射线衰减强度测试结果X-射线衰减强度测试分两方面进行(1)配制活性元素(铋、碘)摩尔浓度为 0. 05mol/L的样品，以传统造影剂碘海醇作为对照，进行X-射线衰减强度测试；O)以 DSNP20为材料，配制活性元素(铋、碘)摩尔浓度分别为0. 005,0. 01,0. 05,0. lmol/L的样品，以碘海醇作为对照，进行χ-射线衰减强度测试。X-射线衰减强度测试结果表明在活性元素(铋、碘)摩尔浓度相同的条件下， Bi2S3DSWs的X-射线衰减强度大大高于碘海醇的的X-射线衰减强度(参见附图6(a))；随着活性元素(铋、碘)摩尔浓度的增加，硫化铋纳米颗粒的χ-射线衰减强度呈上升趋势，且越来越显著的表现出优于碘海醇的X-射线衰减特性(参见附图6(b))。(5)兔子活体成像将100 μ L的DSNP20 ([Bi] = 0. lmol/L)皮下注射进入体重为3kg的雄性新西兰白兔的右后肢，通过Micro-CT扫描检测得到图片(附图7)。从图中可以看出，注射后注射部位的软组织能够被清楚的显示出来，相反注射同浓度的碘海淳则达不到相同的造影效果。此外，注射后兔子仍然显示出和注射前无异的健康状态。以上结果证明了本方法制备的Bi2S3DSNPs具有较低的生物毒性和较好的CT成像效果。以结构均一的聚酰胺-胺树状大分子为稳定剂，制备具有CT造影功能的树状大分子/硫化铋纳米颗粒，具体涉及三个基本原理(1)利用树状大分子的吸附/配位作用，对Bi3+进行络合，将Bi3+预装载在树状大分子“纳米模板”上；(2)以络合了 Bi3+的“纳米模板”作为反应器，通过沉淀的方法得到树状大分子稳定的硫化铋纳米颗粒。由于纳米颗粒被封闭在树状大分子间而保持稳定，因此不易产生聚集；(3)铋原子对X-射线有良好的衰减能力。X-射线衰减强度测试结果表明随着活性元素(铋、碘)摩尔浓度的增加，硫化铋纳米颗粒的X-射线衰减强度呈上升趋势，且越来越显著的表现出优于碘海醇的X-射线衰减特性。有益效果(1)本发明的制备过程简单，反应条件温和，易于操作，具有产业化实施的前景，且所采用的制备方法可用于制备其他金属化合物纳米颗粒，具有很好的使用价值；(2)本发明制备的树状大分子稳定的硫化铋纳米颗粒，尺寸分布较窄，能够长时间地分散在水基溶液中，树状大分子能有效地稳定硫化铋纳米颗粒，不会产生团聚和沉淀；(3)本发明制备的硫化铋纳米颗粒具有良好的生物相容性，明显优于传统造影剂碘海醇的χ-射线衰减特性，并已被成功地应用于兔子的活体成像，为新型造影剂的开发打下了良好的实验基础。
图1为本发明制备的树状大分子稳定的硫化铋纳米颗粒以及末端为羟基的第四代聚酰胺-胺树状大分子的紫外吸收光谱图；图2为本发明制备的DSNPlO (a)、DSNP20 (b)和DSNP40 (c)的TEM图片和粒径分布
直方图；图3为本发明制备的DSNP20的能量分散谱图；图4为MTT法测试的细胞经(a)PBS缓冲液(对照)、DSNP10、DSNP20和 DSNP40 处理 24h 后的细胞活力；(b) DSNP20 (浓度为 0、100、500、1000、1500 和 2000nmol/L) 处理24h后的细胞活力；图5 为经 PBS 缓冲液(对照，(h))、DSNP10 (浓度为 2000nmol/L, f)、DSNP20 (浓度为(a) 100，(b)500, (c) 1000，(d) 1500，(e) 2000nmol/L)和 DSNP40(浓度为 2000nmol/L, g) 处理24h后的细胞的倒置相差显微镜图片；图6为本发明制备的树状大分子稳定的硫化铋纳米颗粒以及碘海醇的(a)X-射线衰减强度直方图；(b)活性元素(铋、碘)的摩尔浓度与X-射线衰减强度的线性关系图；图7为100μ L的DSNP20([Bi] = 0. Imo 1/L)皮下注射进体重为3kg的雄性新西兰白兔的右后肢，通过CT扫描检测得到的CT图片。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。实施例1(1)配置体积分数为10%的稀醋酸溶液25mL。取干重为40. OOmg的末端为羟基的第四代聚酰胺-胺树状大分子(G4. NGlyOH)溶于SmL的10%的稀醋酸溶液中，超声处理使之充分溶解均勻。取Bi (NO3) 3 · 5H20粉末10. 68mg,溶于5. 34mL的10 %的稀醋酸溶液中， 超声处理使之充分溶解均勻，然后加入到G4. NGlyOH溶液中，搅拌lh，使两者充分混合。(2)取Na2S · 9H20固体2g，向其中逐滴加入体积分数为10%的稀醋酸溶液，将产生的H2S气体持续通入步骤(1)的溶液中，在氮气保护的条件下室温搅拌反应lh。反应结束后，继续搅拌8h，然后将反应产物用纤维素透析膜(MWC0 = 10000)分别在4L的PBS缓冲溶液中透析3次和4L的超纯水中透析3次，共透析3天，最后将纯化后的产物冷冻干燥得到DSNP10，_20°C密封保存。以上过程均在避光条件下进行。TEM测试结果表明制备得到的DSNPlO的尺寸分布为7. 94士 1. 38nm,且纳米颗粒具有良好的分散性，基本未出现团聚现象。以细胞为模型细胞来检验DSNPlO的细胞毒性。将模型细胞在含有DSNPlO 的培养液中培养24h后，用MTT法测试模型细胞的存活情况。结果表明，含DSNPlO的培养液培养的细胞的存活率和PBS缓冲液对照组相比，毒性较小。从细胞的相差显微镜图片上也可以看出，在添加有DSNPlO的培养液中培养的细胞与未处理的细胞形貌相似， 细胞仍能健康地生长。配制活性元素(铋、碘)摩尔浓度为0. 05mol/L的DSNPlO样品，以传统造影剂碘海醇作为对照，进行X-射线衰减强度测试。测试结果表明，制备得到的DSNPlO的CT值为 262HU,而碘海醇的CT值仅为186HU。实施例2(1)配置体积分数为10%的稀醋酸溶液25mL。取干重为30. OOmg的末端为羟基的第四代聚酰胺-胺树状大分子(G4. NGlyOH)溶于IOmL的10%的稀醋酸溶液中，超声处理使之充分溶解均勻。取Bi (NO3)3 · 5H20粉末16. Oang，溶于10. 68mL的10%的稀醋酸溶液中， 超声处理使之充分溶解均勻，然后加入到G4. NGlyOH溶液中，搅拌1. 5h，使两者充分混合。(2)将于Bi (NO3)3 · 5H201. 5倍物质的量的H2S气体持续通入步骤(1)的溶液中， 在氮气保护的条件下室温搅拌反应1.证。反应结束后，继续搅拌9h，然后将反应产物用纤维素透析膜(MWC0 = 10000)分别在4L的PBS缓冲溶液中透析3次和4L的超纯水中透析 3次，共透析3天，最后将纯化后的产物冷冻干燥得到DSNP20，_20°C密封保存。TEM测试结果表明制备得到的DSNP20的尺寸分布为7. 83士 1. OOnm,且纳米颗粒具有良好的分散性，基本未出现团聚现象。UV-Vis和EDS测试结果表明，体系中成功合成了树状大分子稳定的硫化铋纳米颗粒。以细胞为模型细胞来检验DSNP20的细胞毒性。将模型细胞在含有浓度分别为100、500、1000、1500和2000nmol/L的DSNPlO的培养液中培养24h后，用MTT法测试模型细胞在不同条件下的存活情况。统计分析表明，在浓度范围为100-2000nmol/L时，含DSNP20的培养液培养的细胞的存活率和PBS缓冲液对照组相比，毒性较小。从细胞的相差显微镜图片上也可以看出，所有在添加了 DSNP20的培养液中培养的细胞与未处理的细胞形貌相似，未见明显的凋亡现象，细胞仍能健康地生长。配制活性元素(铋、碘)摩尔浓度分别为0. 005,0. 01,0. 05,0. lmol/L的DSNP20 样品，以传统造影剂碘海醇作为对照，进行X-射线衰减强度测试。测试结果表明，随着活性元素(铋、碘)摩尔浓度的增加，硫化铋纳米颗粒的X-射线衰减强度呈上升趋势，且越来越显著的表现出优于碘海醇的X-射线衰减特性。在活性元素(铋、碘)摩尔浓度为0. Imol/ L时，DSNP20的CT值为531HU，而碘海醇的CT值仅为402HU。将100 μ L的DSNP20 ([Bi]= 0. lmol/L)皮下注射进体重为3kg的雄性新西兰白兔的右后肢，通过CT扫描检测得到图片。 从图中可以看出，本方法制备的硫化铋纳米颗粒具有较好的CT成像效果。实施例3(1)配置体积分数为10%的稀醋酸溶液25mL。取干重为20. OOmg的末端为羟基的第四代聚酰胺-胺树状大分子(G4. NGlyOH)溶于2. 86mL的10 %的稀醋酸溶液中，超声处理使之充分溶解均勻。取Bi (NO3)3 · 5H20粉末21. 36mg，溶于8. 54mL的10%的稀醋酸溶液中，超声处理使之充分溶解均勻，然后加入到G4. NGlyOH溶液中，搅拌池，使两者充分混合。(2)取Na2S · 9H20固体2. 5g，向其中逐滴加入体积分数为20%的稀醋酸溶液，将产生的气体持续通入步骤(1)的溶液中，在氮气保护的条件下室温搅拌反应池。反应结束后，继续搅拌9h，然后将反应产物用纤维素透析膜(MWC0 = 10000)分别在4L的PBS缓冲溶液中透析3次和4L的超纯水中透析3次，共透析3天，最后将纯化后的产物冷冻干燥得到DSNP40，-20°C密封保存。以上过程均在避光条件下进行。TEM测试结果表明制备得到的DSNP40的尺寸分布为8. 53士 1. 53nm,且纳米颗粒具有良好的分散性，基本未出现团聚现象。以细胞为模型细胞来检验DSNP40的细胞毒性。将模型细胞在含有DSNP40 的培养液中培养24h后，用MTT法测试模型细胞的存活情况。结果表明，含DSNP40的培养液培养的细胞的存活率和PBS缓冲液对照组相比，毒性较小。从细胞的相差显微镜图片上也可以看出，在添加有DSNP40的培养液中培养的细胞与未处理的细胞形貌相似， 细胞仍能健康地生长。配制活性元素(铋、碘)摩尔浓度为0. 05mol/L的DSNP40样品，以传统造影剂碘海醇作为对照，进行X-射线衰减强度测试。测试结果表明，制备得到的DSNP40的CT值为 257HU，而碘海醇的CT值仅为186HU。
权利要求
1.一种树状大分子稳定的硫化铋纳米颗粒的制备方法，包括(1)将末端为羟基的第四代聚酰胺-胺树状大分子按质量体积比为3 1-7 lg/mL 溶解在稀醋酸溶液中，得到树状大分子的稀醋酸溶液；将Bi (NO3)3 · 5H20按质量体积比为 1.5 1-3 lg/mL溶解在稀醋酸溶液中，得到铋盐的稀醋酸溶液；(2)按照Bi(NO3) 3· 5H20与树状大分子的摩尔比为10 1-40 1将上述的树状大分子的稀醋酸溶液和铋盐的稀醋酸溶液混合，搅拌1- 后，持续通入H2S气体，并在氮气保护的条件下室温搅拌反应1- ；反应结束后，继续搅拌8-9h，透析，冷冻干燥，即得树状大分子稳定的硫化铋纳米颗粒。
2.根据权利要求1所述的一种树状大分子稳定的硫化铋纳米颗粒的制备方法，其特征在于步骤(1)中所述的稀醋酸溶液为质量百分比为10%的稀醋酸水溶液。
3.根据权利要求1所述的一种树状大分子稳定的硫化铋纳米颗粒的制备方法，其特征在于步骤⑴中所述的Bi (NO3)3 ·5Η20与树状大分子的摩尔比为10 1、20 1或40 1。
4.根据权利要求1所述的一种树状大分子稳定的硫化铋纳米颗粒的制备方法，其特征在于步骤O)中所述的所有过程均在避光条件下进行。
5.根据权利要求1所述的一种树状大分子稳定的硫化铋纳米颗粒的制备方法，其特征在于步骤⑵中所述的H2S气体摩尔数为Bi (NO3)3 · 5Η20摩尔数的1. 5倍。
6.根据权利要求1所述的一种树状大分子稳定的硫化铋纳米颗粒的制备方法，其特征在于步骤⑵中所述的H2S气体，由向Na2S · 9Η20固体中逐滴加入稀醋酸溶液后制得。
7.根据权利要求1所述的一种树状大分子稳定的硫化铋纳米颗粒的制备方法，其特征在于步骤O)中所述的透析为用透析膜在缓冲溶液和超纯水中透析。
8.根据权利要求7所述的一种树状大分子稳定的硫化铋纳米颗粒的制备方法，其特征在于所述的透析膜为纤维素透析膜MWCO = 10000 ；缓冲溶液为PBS缓冲溶液。
9.根据权利要求1或7所述的一种树状大分子稳定的硫化铋纳米颗粒的制备方法，其特征在于步骤⑵中所述的透析为分别在4L的PBS缓冲溶液中透析2 4次和4L的超纯水中透析2 4次，共透析3天。
全文摘要
本发明涉及一种树状大分子稳定的硫化铋纳米颗粒的制备方法，包括(1)配制末端为羟基的第四代聚酰胺-胺树状大分子的稀醋酸溶液；配制铋盐的稀醋酸溶液；(2)将上述的树状大分子的稀醋酸溶液和铋盐的稀醋酸溶液混合，通入H2S气体，氮气保护下反应1-2h；反应结束后，透析，冷冻干燥，即得树状大分子稳定的硫化铋纳米颗粒。本发明的制备方法操作简单，反应条件温和；所制备的树状大分子稳定的硫化铋纳米颗粒，尺寸分布较窄，具有良好的分散性，没有发生团聚现象，可潜在地应用于CT成像诊断，并已被成功地应用于兔子的活体成像。
文档编号B82Y30/00GK102241416SQ20111018605
公开日2011年11月16日 申请日期2011年7月5日 优先权日2011年7月5日
发明者史向阳, 彭琛, 方逸 申请人:东华大学