本发明属于生物医用材料领域，更具体地，涉及一种在金属表面制备丝素蛋白羟基磷灰石涂层的方法，该方法尤其适用于在金属种植体(尤其是钛金属种植体)表面构建丝素蛋白羟基磷灰石生物涂层。
背景技术：
：钛金属种植体已成为目前口腔修复治疗中的主流方法之一。钛金属植入体在全身的应用也逐渐增多，而其临床并发症的发生率也随之增加。在诸多失败原因中，种植体松动是植入物失败的首要原因。因此提供一种理想减少种植体松动以及提高植入物成功率的解决方案十分必要。由于钛金属种植体本身是生物惰性材料，不具有生物功能，无法诱导骨形成。通过表面改性对钛金属表面进行活化处理，使之具有生物功能性，与骨组织形成早期骨整合，是国内外口腔种植材料研究的热点问题。物理改性、化学改性和生物化学改性可缩短钛种植体种植周期，获得早期骨整合和更高的结合强度。羟基磷灰石是人骨骼的主要无机组成成分，在人体内具有良好的骨传导性、生物相容性和生物活性，与人体硬组织(骨和牙)的无机质具有相近的物质组成，它植入人体后能在短时间内与人体的软组织形成紧密结合。近年来各种涂覆技术研究与利用，已经能够将羟基磷灰石涂覆于力学性能较好的生物惰性金属材料表面，得到既可利用金属基体的强度和韧性，又具有生物活性的羟基磷灰石生物陶瓷涂层。目前制备羟基磷灰石生物陶瓷涂层比较成熟的涂覆方法有：(1)等离子喷涂法。这种方法的缺点是在形状复杂或表面多孔的基体上难以获得均匀的涂层，喷涂时的高温使涂层的化学组成和结构容易发生变化，而且所用原料是纯羟基磷灰石粉末，费用相对昂贵。(2)溶胶凝胶法。此方法是将羟基磷灰石制成溶胶后均匀覆盖于基体的表面，利用溶剂的迅速挥发以及后续的缩聚反应进而形成涂层。这种方法的缺点是不易实现通过改变热处理温度来改变涂层中相的结晶度、相的种类、孔隙的大小等微观特性参数。(3)仿生生长法。这种方法是在仿生环境下，在金属基体表面上生长出羟基磷灰石生物陶瓷涂层，这种方法获得的涂层与基体结合力较低。(4)电沉积法。电沉积法具有多种优势。首先，电泳沉积是一种温和的表面涂覆方法，可避免采用传统高温涂覆而引起的相变和脆裂；其次，电泳沉积是非直线过程，可以在形状复杂或表面多孔的金属基材表面形成均匀的沉积层，并能精确控制涂层成分、厚度和孔隙率；再者，电泳沉积是带电粒子的定向移动，不会因电解水溶剂时产生的大量气体影响涂层与金属基体的结合力。此外，电泳沉积还具有所需设备简单、成本低、操作方便、沉积工艺易控制等优点。目前前沿技术主要是通过将羟基磷灰石的醇溶液作为电沉积溶液，在钛金属种植体表面进行电沉积，以获得较高的骨诱导性。这种羟基磷灰石涂层的制备方法主要有以下两点缺点，一是该涂层电沉积后需要经过烧结使电泳沉积层趋于致密，但烧结过程较难控制，烧结温度对涂层的性质影响很大。烧结温度低，则涂层密度低，与基体材料的结合差；烧结温度高，则会引起羟基磷灰石分解和金属基体性质的恶化，如氧化、相变和晶粒长大等。二是电沉积直接制备的涂层具有一定的脆性，为解决这一问题需要10天左右的陈化时间使羟基磷灰石从高附聚态转化为纳米级分散状以完全消除脆裂。这一要求延长了种植体制作时间。有研究(如中国专利申请申请号：cn200510118357.0)通过使用纳米级羟基磷灰石和碳纳米管电泳沉积悬浮液的方法降低了烧结温度，减少了因高温烧结而导致羟基磷灰石涂层的破坏。但其600℃-900℃的烧结温度仍造成了一定程度的羟基磷灰石分解和钛基性能恶化。丝素蛋白是蚕丝的主体，是一种无生理活性的天然生物大分子。丝素蛋白质与其他天然高分子相比有明显的优越性,研究表明它具有良好的生物相容性、无毒、无污染、无刺激性、可生物降解。近年来，丝素蛋白由于其良好的生物相容性逐渐应用于生物传感、生物医学材料、软组织相容材料、组织工程等领域。技术实现要素：针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明的目的在于提供一种在金属表面制备丝素蛋白羟基磷灰石涂层的方法，其中通过对其关键的电沉积工艺步骤(包括电沉积工艺步骤的各种参数，如电沉积液的种类及浓度、电沉积施加的直流电流及时间等)进行改进，与现有技术相比能够有效解决沉积得到的涂层与金属基体之间结合性差的问题，制备得到的丝素蛋白羟基磷灰石涂层与金属基体之间的结合效果好；并且，涂层内的羟基磷灰石在丝素蛋白羟基磷灰石涂层中即为纳米级分散态，脆性小，因此本发明制备得到的金属种植体无需陈化，可以大大缩短种植体的制作时间；此外，本发明制备得到的金属种植体(尤其是钛金属种植体)同时具有良好的生物相容性和骨诱导性，适用性好。为实现上述目的，按照本发明提供了一种在金属表面制备丝素蛋白羟基磷灰石涂层的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)分别配制丝素蛋白溶液、以及同时含有丝素蛋白和羟基磷灰石的混合溶液；所述丝素蛋白溶液中丝素蛋白的浓度为2mg/ml～100mg/ml；所述同时含有丝素蛋白和羟基磷灰石的混合溶液中，丝素蛋白的浓度为2mg/ml～100mg/ml，羟基磷灰石的浓度为2mg/ml～50mg/ml；(2)第一次电沉积步骤：以所述丝素蛋白溶液为电沉积液，以表面待沉积的金属为阳极电极，将阴极电极和所述阳极电极插入到所述丝素蛋白溶液中进行电沉积，得到表面附着有丝素蛋白涂层的金属；(3)第二次电沉积步骤：以所述同时含有丝素蛋白和羟基磷灰石的混合溶液为电沉积液，以所述表面附着有丝素蛋白涂层的金属为阳极电极，将阴极电极和所述阳极电极插入到所述同时含有丝素蛋白和羟基磷灰石的混合溶液中进行电沉积，得到表面附着有丝素蛋白羟基磷灰石涂层的金属。作为本发明的进一步优选，所述步骤(2)中，所述阴极电极与所述阳极电极之间的距离为8cm，电压为20v；该第一次电沉积的时间为0.5分钟～30分钟。作为本发明的进一步优选，所述步骤(3)中，所述阴极电极与所述阳极电极之间的距离为8cm，电压为20v；该第二次电沉积的时间为0.5分钟～30分钟。作为本发明的进一步优选，所述步骤(2)和所述步骤(3)中的所述阴极电极的材料均为铂和金中的至少一种。作为本发明的进一步优选，所述丝素蛋白溶液与所述同时含有丝素蛋白和羟基磷灰石的混合溶液两者的丝素蛋白浓度相同。作为本发明的进一步优选，所述步骤(1)中所述同时含有丝素蛋白和羟基磷灰石的混合溶液，是将纳米级羟基磷灰石粉末与所述丝素蛋白溶液混合后得到的；该纳米级羟基磷灰石粉末的粒径优选为10nm～500nm。作为本发明的进一步优选，所述步骤(2)中所述表面待沉积的金属为钛单质、钛合金或不锈钢。通过本发明所构思的以上技术方案，与现有技术相比，由于对关键的电沉积工艺步骤进行改进，使得制备得到的丝素蛋白羟基磷灰石涂层与金属基体之间的结合效果好。本发明是采用多次电沉积的方式，先将丝素蛋白组装在材料表面(即金属种植体表面，金属种植体包括钛单质种植体、钛合金种植体或不锈钢种植体)，再将丝素蛋白羟基磷灰石组装在已沉积有丝素蛋白涂层的材料表面；由于丝素蛋白具有良好的人体亲和性、生物相容性、无毒、且利于细胞粘附，而羟基磷灰石高效的骨诱导性也为该涂层的防松动效果提供保证。本发明的制备方法中，第一次电沉积是以丝素蛋白溶液为电沉积液，该丝素蛋白溶液中丝素蛋白的浓度为2mg/ml～100mg/ml；电沉积时，阳极与阴极之间的距离为8cm，电压为20v，时间为0.5分钟～30分钟，得到了表面附着有丝素蛋白涂层的金属种植体，该丝素蛋白涂层的厚度为0.2～20μm。第二次电沉积是以同时含有丝素蛋白和羟基磷灰石的混合溶液为电沉积液，该同时含有丝素蛋白和羟基磷灰石的混合溶液中，丝素蛋白的浓度为2mg/ml～100mg/ml，羟基磷灰石的浓度为2mg/ml～50mg/ml；电沉积时，阳极与阴极之间的距离为8cm，电压为20v，时间为0.5分钟～30分钟，最终得到了表面附着有丝素蛋白羟基磷灰石涂层的金属种植体，该丝素蛋白羟基磷灰石复合涂层的厚度为0.5～50μm(金属种植体表面的涂层总厚度则为0.7～70μm)。本发明通过这两个涂层之间的相互配合，使得丝素蛋白羟基磷灰石复合涂层与金属基体之间有较好的结合效果。配制同时含有丝素蛋白和羟基磷灰石的混合溶液时，使用的原料羟基磷灰石即为纳米级羟基磷灰石粉末(其粒径优选为2nm～500nm，尤其是10nm～500nm)，使得制备得到的丝素蛋白羟基磷灰石涂层中的羟基磷灰石即为纳米级分散态，脆性小，可以大大缩短种植体的制作时间。附图说明图1是本发明制备得到的丝素蛋白羟基磷灰石生物涂层的红外检测对比图。图中ha即羟基磷灰石(ha)，sf即丝素蛋白(sf)，sfha即丝素蛋白羟基磷灰石。具体实施方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。本发明中的在钛金属表面制备丝素蛋白羟基磷灰石生物涂层的方法，各个实施例均包括以下通用步骤：1、提取丝素蛋白(该步骤为可选步骤)：1)采用1l0.02mol/lna2co3(2.12g)溶液，在煮沸条件下对蚕茧(该蚕茧原料的质量可以为24g)浸泡处理20分钟。2)用水清洗后干燥得到脱胶蚕茧。3)配制200ml9.3mol/llibr(162g)溶液，在60℃下溶解20g脱胶蚕茧处理4小时。4)将得到的液体装入透析袋(该透析袋的截留分子量优选为3500kda)，放于5l超净水(即超纯水)中，在4℃环境下透析处理72h。5)在4℃环境下将透析袋内得到的液体离心处理30min，并去除不溶性杂质。6)干燥称重检测丝蛋白质量。7)在4℃环境下保存。2、配置丝素蛋白羟基磷灰石混合溶液，其中：1)配制20mg/ml的丝素蛋白溶液，加热煮沸。2)加入一定量的纳米级羟基磷灰石粉末(该羟基磷灰石粉末的粒径可以为10nm～500nm分布)，搅拌至均匀，即得到丝素蛋白羟基磷灰石混合溶液。3、进行电沉积反应：1)分别以丝素蛋白溶液和丝素蛋白羟基磷灰石混合溶液为电沉积液；2)以铂金片为阴极；3)以金属种植体(如钛金属种植体、不锈钢种植体，包括钛种植体和钛合金种植体)为阳极；4)进行具体的电沉积反应。4、后处理：将电沉积反应后的金属种植体取出，清除表面附着的溶液后对其进行干燥处理，即得到最终附着在金属种植体表面的丝素蛋白羟基磷灰石生物涂层。本发明中制备丝素蛋白羟基磷灰石生物涂层的方法，其电沉积反应具体分为两步(即，第一次电沉积和第二次电沉积，其中第一次电沉积是以丝素蛋白溶液为电沉积液，第二次电沉积是以丝素蛋白羟基磷灰石混合溶液为电沉积液)，电沉积反应中电沉积液的温度均优选控制在0～37℃，温度改变对沉积效果的影响不大。本发明包括4个实施例，这4个实施例的参数如下表1所示。表1本发明实施例的具体参数列表羟基磷灰石浓度第一次电沉积时间第二次电沉积时间实施例15mg/ml2min2min实施例25mg/ml1min1min实施例325mg/ml2min2min实施例425mg/ml1min1min具体实施例如下：实施例11、配制20mg/ml的丝素蛋白溶液。2、向丝素蛋白溶液中添加羟基磷灰石粉末，配制羟基磷灰石浓度为5mg/ml的丝素蛋白羟基磷灰石混合溶液，即：1)将20mg/ml的丝素蛋白溶液加热煮沸；2)称量0.2g纳米级羟基磷灰石加入至40ml的丝素蛋白溶液中，继续加热；3)至羟基磷灰石粉末完全均匀分散后停止加热，静置冷却。3-1、进行第一步电沉积反应：1)铂金片作为阴极，钛种植体作为阳极，以丝素蛋白溶液作为电沉积液；2)阳极和阴极浸没于电沉积液中，两电极之间距离为8cm；3)控制两电极之间的通电直流，电压为20v；4)经过2分钟沉积后在钛种植体钛表面形成一层与其结合优良的丝素蛋白涂层。3-2、进行第二步电沉积反应：1)将表面沉积了丝素蛋白涂层的金属钛基体取出，润洗后直接放入丝素蛋白-羟基磷灰石溶液中；2)铂金片作为阴极，钛种植体作为阳极，以丝素蛋白羟基磷灰石混合溶液作为电沉积液；3)阳极和阴极浸没于电沉积液中，两电极之间距离为8cm；4)控制两电极之间的通电直流，电压为20v；5)以丝素蛋白羟基磷灰石溶液作为电沉积液，经过2分钟沉积后在钛种植体钛表面形成一层与其结合优良的丝素蛋白羟基磷灰石涂层。4、后处理：将表面沉积了两层涂层的金属钛基体取出，清除表面的溶液后，将其放入干燥箱中干燥。实施例21、配制20mg/ml的丝素蛋白溶液。2、配制含5mg/ml羟基磷灰石的丝素蛋白羟基磷灰石混合溶液，即：1)将20mg/ml的丝素蛋白溶液中加热煮沸；2)称量0.2g纳米级羟基磷灰石加至40ml的丝素蛋白溶液中，继续加热；3)至羟基磷灰石粉末完全均匀后停止加热，静置冷却。3-1、进行第一步电沉积反应：1)铂金片作为阴极，钛种植体作为阳极，以丝素蛋白溶液作为电沉积液；2)阳极和阴极浸没于电沉积液中，两电极之间距离为8cm；3)控制两电极之间的通电直流，电压为20v；4)经过1分钟沉积后在钛种植体钛表面形成一层与其结合优良的丝素蛋白涂层。3-2、进行第二步电沉积反应：1)将表面沉积了丝素蛋白涂层的金属钛基体取出，直接放入丝素蛋白羟基磷灰石溶液中；2)铂金片作为阴极，钛种植体作为阳极，以丝素蛋白羟基磷灰石混合溶液作为电沉积液；3)阳极和阴极浸没于电沉积液中，两电极之间距离为8cm；4)控制两电极之间的通电直流，电压为20v；5)以丝素蛋白羟基磷灰石溶液作为电沉积液，经过1分钟沉积后在钛种植体钛表面形成一层与其结合优良的丝素蛋白羟基磷灰石涂层。4、进行后处理：将表面沉积了两层涂层的金属钛基体取出，清除表面的溶液后，将其放入干燥箱中干燥。实施例31、配制20mg/ml的丝素蛋白溶液2、配制含25mg/ml羟基磷灰石的丝素蛋白羟基磷灰石混合溶液，即：1)将20mg/ml的丝素蛋白溶液中加热煮沸；2)称量1g纳米级羟基磷灰石加至40ml的丝素蛋白溶液中，继续加热；3)至羟基磷灰石粉末完全均匀后停止加热，静置冷却。3-1、进行第一步电沉积反应：1)铂金片作为阴极，钛种植体作为阳极，以丝素蛋白溶液作为电沉积液；2)阳极和阴极浸没于电沉积液中，两电极之间距离为8cm；3)控制两电极之间的通电直流，电压为20v；4)经过2分钟沉积后在钛种植体钛表面形成一层与其结合优良的丝素蛋白涂层。3-2、进行第二步电沉积反应1)将表面沉积了丝素蛋白涂层的金属钛基体取出，直接放入丝素蛋白-羟基磷灰石溶液中。2)铂金片作为阴极，钛种植体作为阳极，以丝素蛋白羟基磷灰石混合溶液作为电沉积液；3)阳极和阴极浸没于电沉积液中，两电极之间距离为8cm；4)控制两电极之间的通电直流，电压为20v；5)以丝素蛋白羟基磷灰石溶液作为电沉积液，经过2分钟沉积后在钛种植体钛表面形成一层与其结合优良的丝素蛋白羟基磷灰石涂层。4、进行后处理：将表面沉积了两层涂层的金属钛基体取出，清除表面的溶液后，将其放入干燥箱中干燥。实施例41、配制20mg/ml的丝素蛋白溶液。2、配制含25mg/ml羟基磷灰石的丝素蛋白混合溶液：1)将20mg/ml的丝素蛋白溶液中加热煮沸；2)称量1g纳米级羟基磷灰石加至40ml的丝素蛋白溶液中，继续加热；3)至羟基磷灰石粉末完全均匀后停止加热，静置冷却。3-1、进行第一步电沉积反应：1)铂金片作为阴极，钛种植体作为阳极，以丝素蛋白溶液作为电沉积液；阳极和阴极浸没于电沉积液中，两电极之间距离为8cm；2)控制两电极之间的通电直流，电压为20v；3)经过1分钟沉积后在钛种植体钛表面形成一层与其结合优良的丝素蛋白涂层。3-2、进行第二步电沉积反应1)将表面沉积了丝素蛋白涂层的金属钛基体取出，直接放入丝素蛋白-羟基磷灰石溶液中；2)铂金片作为阴极，钛种植体作为阳极，以丝素蛋白羟基磷灰石混合溶液作为电沉积液；3)阳极和阴极浸没于电沉积液中，两电极之间距离为8cm；4)控制两电极之间的通电直流，电压为20v；5)以丝素蛋白羟基磷灰石溶液作为电沉积液，经过1分钟沉积后在钛种植体钛表面形成一层与其结合优良的丝素蛋白羟基磷灰石涂层。4、进行后处理：将表面沉积了两层涂层的金属钛基体取出，清除表面的溶液后，将其放入干燥箱中干燥。上述实施例中，丝素蛋白溶液、以及同时含有丝素蛋白和羟基磷灰石的混合溶液中，丝素蛋白的浓度均20mg/ml，丝素蛋白的浓度还可在2mg/ml～100mg/ml内分布；同时含有丝素蛋白和羟基磷灰石的混合溶液中羟基磷灰石的浓度除了上述数值外，还可在2mg/ml～50mg/ml分布，通过适当的调整两次电沉积的时间(每次电沉积的时间均可控制在0.5分钟～30分钟)，使得最终得到的附着在金属种植体表面的丝素蛋白羟基磷灰石涂层基本无影响。本发明中的丝素蛋白溶液除了可以按本发明中记载的方法步骤制备外，也可以通过商业渠道购得。本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12