一种鉴定可用作药物靶点的蛋白质编码dna序列的基于计算机的通用方法

专利名称：一种鉴定可用作药物靶点的蛋白质编码dna序列的基于计算机的通用方法
技术领域：
本发明涉及鉴定可用作药物靶点的蛋白质编码DNA序列的一种通用方法。更具体地说，本发明涉及鉴定各种生物基因组序列中鉴定可用作潜在药物靶点的新基因的方法。本发明还提供通过精确的氨基酸序列相同性标识(identity signature)说明(assignment)功能未知的推测的开放读框(蛋白质)的功能的方法。
已出现的高通量测序技术需要鉴定新测序基因组中新的蛋白质编码DNA序列(基因)。本发明通过利用肽文库提供了将DNA序列转变为字母数字式序列的新方法。本发明也提供采用具有一输入层(input layer)、一含有30个神经元的隐藏层(hidden layer)和一输出层(output layer)的人工神经网络(正反馈传播拓扑学)来鉴定蛋白质编码DNA序列的方法。本发明还提供利用S形(曲线)作为学习函数(learningfunction)来训练神经网络以鉴定蛋白质编码DNA序列的方法，所述学习函数具有5种参数，称为总得分、平均值、零部分(fraction of zeroes)、最大连续性非零延伸段(maximum continuous non-zero stretch)和方差。
本发明背景和现有技术参考鉴定新测序基因组中蛋白质编码DNA序列(基因)的最可靠方法是寻找其它生物中相接近的类似基因(BLAST(Altschul，S.F等，1990)和FASTA(Pearson，W.R.，1995))。DNA序列中的4种核苷酸不是随机分布的。编码区内核苷酸的统计学分布与非编码区明显不同(Bird，A.，1987)。以Hidden Markov模型(HMM)为基础的方法最有效地利用了这些统计学特性(Salzberg，S.L等，1998；Delcher，A.L等，1999；Lukashin，A.V.和Borodovsky，M.，1998)，当将这些方法与发表的注释比较时，能预测到基因组中约97-98％的所有基因(Delcher，A.L等，1999)。已开发了利用HMM的各种算法，例如GeneMark、Glimmer等来预测原核生物的基因。所有现有方法中，Glimmer 2.0最为成功(Delcher，A.L等，1999)。然而，Glimmer也只能预测7-20％的额外基因(假阳性)。每种基因预测方法有其自身长处和弱点(Mathe，C.等，2002)。由于预测通常取决于训练组(training set)，因各种交叉基因组之间编码区的不同而使这种统计学产生缺点。而且这些方法不能有效地预测长度短的基因(＜100氨基酸)，这是因为用类似的检索或统计学分析很难检测这些基因。就基因的水平转移而言，该问题愈加严重(Kehoe，M.A等，1996)。在此种情况中，基因组自身内这些基因的核苷酸序列的统计学分布也不同。
本发明所述的方法是基于以下的发现，即某给定长度肽的理论上可能的总数和实际上确实观察到的总数的差异随着该肽长度的增加而急剧上升。例如，在56个完全测序的原核生物基因组库中仅观察到理论上可能的七肽的约2％。在八肽水平上，该数字降低至小于0.1％。此外，有趣地注意到就其性质而言，大多数这些选出的肽仅发现于编码区中，而非常罕见于理论上可被翻译的非编码区中。此发现促使我们研究了蛋白质编码序列中的肽的这种天然选择排他性是否可用来区分编码区和非编码区。
从原理上讲，只有当得到了足够的数据用来估计训练(train)预测算法所需的统计学参数，才能总是优选用较长而非较短的肽给查询ORF评分(Salzberg，S.L.等，1998)。但当我们使用长度为8个或更多个氨基酸的肽时，难于得到足够的数据来估计这些训练参数。这是因为两种多肽之间共有一个八肽的可能性小于共有一个七肽。所以，我们认为7个氨基酸的长度对于ORF评分是最佳的。
本文所述方法的新颖性在于它是根据蛋白质编码序列的氨基酸水平，而非核苷酸水平进行工作。值得注意的是该方法无需生物特异性训练组，这点相对于其它方法具有明显优势。与其它方法不同，GeneDecipher不采用诸如核糖体结合位点、启动子序列、转录起始位点或密码子使用偏爱等任何地标(landmark)来预测编码基因和它们的起始部位。此外，该方法克服了对较小基因组(Chen，L等，2003)，如SARS-CoV作基因预测的困难。与基因预测不同，该方法也可用于多肽的相似性检索、蛋白质推测的功能说明(根据该寡肽基序的存在)和种系发生的结构域分析，表明该方法具有广泛应用性和通用性。
现有的计算方法，例如GeneMark.hmm(Lukashin和Borodovsky，1998)、Glimmer(Salzberg等，1998)等在分析小基因组，例如SARS时有困难。基于HiddenMarkov模型(HMM)的方法需要数千个训练参数。这使得这些方法不适于分析较小的基因组。就SARS-CoV基因组而言，所述化合物长度约30kb。迄今为止，即使最适用于预测病毒基因的方法-ZCURVE_CoV(Chen等，2003)也需要33种训练参数。GeneDecipher只需要5种参数即能分析较小的基因组。申请人在大肠杆菌-k12基因组编码和非编码区上训练了人工神经网络(ORF不报道为基因)。使用GeneDecipher预测病毒基因组上蛋白质编码基因无需额外的训练。这是该方法优于其它方法的一个明显优点。
本发明的目的本发明的主要目的是提供基于计算机的方法来预测可用作药物靶点的蛋白质编码DNA序列(基因)。
本发明的另一主要目的是开发一种利用软件GeneDecipher的通用性方法，所述方法采用在其它基因组的ORF中发现的寡肽来鉴定基因。
本发明还有另一目的是开发一种适用于防治病原性生物所致疾病的方法。
本发明还有另一目的是开发一种执行上述方法的基于计算机的系统。
本发明还有另一目的是开发一种用于鉴定可用作潜在药物靶点的新蛋白质编码DNA序列的方法，该方法可用作广谱抗菌药物的药物筛选以及感染的特异性诊断。
本发明还有另一目的是鉴定菌株特异性或生物特异性的蛋白质编码基因。
本发明还有另一目的是鉴定真核生物的蛋白质编码DNA序列(外显子)。
本发明的另一目的是通过精确的氨基酸序列相同性标识说明功能未知的推测的开放读框(蛋白质)的功能。
本发明小结本发明涉及利用软件GeneDecipher，采用在其它基因组的ORF中发现的寡肽来鉴定基因并且也适用于分析小基因组的通用性方法，所述方法包括以下步骤用计算机处理以字母顺序排列的长度为‘N’的肽从已知基因组产生肽文库；人工翻译该测试基因组获得每个读框的多肽；根据与上述肽文库的重叠情况将每条多肽序列转变为字母数字式序列，其中各条序列对应于每个读框；用S形(曲线)学习函数将人工神经网络(ANN)训练成字母数字式序列；解密该测试基因组中的蛋白质编码区，从而鉴定对大量已知基因作图的肽的较长延伸段和它们所对应的蛋白质；最后本发明涉及防治病原性生物所致疾病的方法，所述方法包括通过抑制本发明上述步骤鉴定到的一种或多种蛋白质的功能来评价所提出的候选药物步骤。
本发明详述因此，本发明涉及利用专门开发的软件GeneDecipher鉴定基因组中可用作药物靶点的蛋白质编码DNA序列(基因)的通用性方法，所述方法包括以下步骤用计算机处理以字母顺序排列的长度为‘N’的肽从已知基因组产生肽文库；人工翻译该测试基因组获得每个读框的多肽；根据与上述肽文库的重叠情况将每条多肽序列转变为字母数字式序列，其中各条序列对应于每个读框；用S形(曲线)学习函数将人工神经网络(ANN)训练成字母数字式序列；解密该测试基因组中的蛋白质编码区，从而鉴定对大量已知基因作图的肽的较长延伸段和它们所对应的蛋白质；最后本发明涉及防治病原性生物所致疾病的方法，所述方法包括通过抑制本发明上述步骤鉴定到的一种或多种蛋白质的作用来评价所提出的候选药物步骤。
在本发明的一个实施方案中，鉴定可用作药物靶点的蛋白质编码DNA序列的基于计算机的通用方法包括以下步骤·用计算机处理以字母顺序排列的长度为‘N’的肽从已知基因组产生肽文库；·人工翻译该测试基因组从而获得每个读框的多肽；·根据与上述肽文库的重叠情况将每条多肽序列转变为字母数字式序列，其中各条序列对应于每个读框；·用S形(曲线)学习函数将人工神经网络(ANN)训练成对应于已知的蛋白质编码DNA序列和已知的非编码区的字母数字式序列；·解密该测试基因组中的蛋白质编码区，和·鉴定用作功能性标识的对大量已知基因作图的肽的较长延伸段。
在本发明的另一实施方案中，所述人工神经网络具有一个或多个输入层、含有数目不同神经元的一个或多个隐藏层和一个或多个输出层。
在本发明还有的另一实施方案中，所述隐藏层中神经元的数量优选30。
在本发明还有的另一实施方案中，所述‘N’的值是4或更大。
在本发明还有的另一实施方案中，所述S形(曲线)学习函数具有5种参数，包括总得分、平均值、零部分、最大连续性非零延伸段和方差。
在本发明还有的另一实施方案中，所述鉴定基因的方法采用发现存在于(但不限于)流感嗜血菌(H.influenzae)、生殖道枝原体(M.genitalium)、大肠杆菌(E.coli)、枯草芽胞杆菌(B.subtilis)、闪烁古生球菌(A.fulgidis)、结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、苍白密螺旋体(T.pallidum)、海栖热袍菌(T.maritima)、集胞蓝细菌(Synechocystis)、幽门螺杆菌(H.pylori)和SARS-CoV的其它基因组ORF中的寡肽。
在本发明还有的另一实施方案中，权利要求1所述的方法中的所述肽文库数据可取自任何生物，而不特别限于本发明所用的那些。
在本发明还有的另一实施方案中，SEQ ID No 1-44所示流感嗜血菌的一组基因用上述方法鉴定。
在本发明还有的另一实施方案中，SEQ ID No.170-213所示的一组蛋白质对应于用上述方法鉴定的SEQ ID No 1-44所示流感嗜血菌基因。
在本发明还有的另一实施方案中，SEQ ID No 45-60所示幽门螺杆菌的一组基因用上述方法鉴定。
在本发明还有的另一实施方案中，SEQ ID No.214-229所示的一组蛋白质对应于用上述方法鉴定的SEQ ID No 45-60所示幽门螺杆菌基因。
在本发明还有的另一实施方案中，SEQ ID No 61-165所示结核分枝杆菌的一组基因用上述方法鉴定。
在本发明还有的另一实施方案中，SEQ ID No.230-334所示的一组蛋白质对应于用上述方法鉴定的SEQ ID No 61-165所示结核分枝杆菌基因。
在本发明还有的另一实施方案中，SEQ ID No 166-169所示SARS-冠状病毒的一组基因用上述方法鉴定。
在本发明还有的另一实施方案中，SEQ ID No.335-338所示的一组蛋白质对应于用上述方法鉴定的SEQ ID No 166-169所示SARS-冠状病毒基因。
在本发明还有的另一实施方案中，对应于SEQ ID No 1-169所示基因的可作为药物靶点的SEQ ID No.170-338所示蛋白质用作防治需要这种防治的对象的病原生物所致疾病。
在本发明还有的另一实施方案中，所述病原性生物选自SARS-冠状病毒、流感嗜血菌、结核分枝杆菌就幽门螺杆菌。
在本发明还有的另一实施方案中，所述对象是动物。
在本发明还有的另一实施方案中，所述对象是人。
在本发明还有的另一实施方案中，所述应用可扩展至真核生物和多细胞生物。
已出现的高通量测序技术需要鉴定新测序基因组中新的蛋白质编码DNA序列(基因)。本发明通过利用肽文库提供了将DNA序列转变为字母数字式序列的新方法。本发明也提供使用具有一输入层、一含有30个神经元的隐藏层和一输出层的人工神经网络(正反馈传播拓扑学)来鉴定蛋白质编码DNA序列的方法。本发明还提供利用S形(曲线)作为学习函数来训练神经网络以鉴定蛋白质编码DNA序列的方法，所述学习函数具有5种参数，称为总得分、平均值、零部分、最大连续性非零延伸段和方差。
本申请人发明了通过与含有数百万个肽的经受了自然选择的肽文库作比较来鉴定蛋白质编码DNA序列的基于计算机的新方法，所述肽得自许多生物的蛋白质序列。该方法描述了一种可用于基因鉴定的可广泛使用的和通用性的新方法。该计算机处理的方法通过利用肽文库和人工神经网络能在某给定的DNA序列的所有可能的开放读框(ORF)中确定候选基因。所述肽文库由得自完全测序的56种或更多种原核生物基因组的蛋白质的所有可能的重叠七肽构成。根据文库七肽(文库中存在的七肽)沿着ORF的丰度和分布模式确定某给定的查询ORF是否为基因。该方法的性能特征在于灵敏度和特异性都很高。分析完全测序的10种原核生物基因组证明了本发明方法的效力。
本发明方法也可预测针对病原生物某特定肽基序的其它(alternate)靶点或负责疾病进程的任何宿主蛋白质靶点。可利用不同长度的肽扩展该方法来获得更大量的蛋白质编码基因以及用于真核生物与多细胞生物。
本发明涉及通过采用肽文库将DNA序列转变为字母数字式序列的新方法，本发明也提供采用具有一输入层、一含有30个神经元的隐藏层和一输出层的人工神经网络(正反馈传播拓扑学)来鉴定蛋白质编码DNA序列的方法。本发明还涉及用S形(曲线)作为学习函数来训练神经网络以鉴定蛋白质编码DNA序列的方法，所述学习函数具有5种参数，称为总得分、平均值、零部分、最大连续性非零延伸段和方差，该方法可用于鉴定新的蛋白质编码区作为广谱抗菌药物的药物筛选以及感染的特异性诊断，此外可用于说明功能尚未知的新鉴定的蛋白质的功能。该方法可鉴定各物种或菌株的特异性蛋白质编码基因。该方法甚至也可扩展至对真核生物基因组中的任何蛋白质编码序列进行鉴定。
因此，本发明公开了鉴定可用作药物靶点的蛋白质编码DNA序列的基于计算机的一种通用方法，所述方法包括以下步骤
a.用计算机处理以字母顺序排列的长度为‘N’的寡肽从已知基因组产生肽文库；b.人工翻译该测试基因组获得每个读框的多肽；c.根据这些寡肽在该肽文库的存在将每条多肽序列转变为字母数字式序列，其中各条序列对应于各个读框；d.用S形(曲线)学习函数将人工神经网络(ANN)训练成对应于已知的蛋白质编码DNA序列和已知的非编码区的字母数字式序列；e.解密该测试基因组中的蛋白质编码区，和f.鉴定用作功能性标识的对大量已知基因作图的肽(进化上保守的寡肽)的较长延伸段。
在本发明的另一实施方案中，所述ANN具有一个或多个输入层、含有数量不同神经元的一个或多个隐藏层和一个或多个输出层。在本发明还有的另一实施方案中，所述隐藏层中神经元数目优选30。
在本发明还有的另一实施方案中，所述‘N’的值是4或更大。
在本发明还有的另一实施方案中，所述S形(曲线)学习函数具有5种参数，包括总得分、平均值、零部分、最大连续性非零延伸段和方差。
本发明的再一个实施方案(涉及)鉴定具有进化上保守的肽序列的基因的方法，这些保守的肽序列存在于各种(生物)基因组的ORF中产生，包括，但不限于流感嗜血菌(H.influenzae)、生殖道枝原体(M.genitalium)、大肠杆菌(E.coli)、枯草芽胞杆菌(B.subtilis)、闪烁古生球菌(A.fulgidis)、结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、苍白密螺旋体(T.pallidum)、海栖热袍菌(T.maritima)、集胞蓝细菌(Synechocystis)、幽门螺杆菌(H.pylori)和SARS-CoV的基因组。
在本发明还有的另一实施方案中，该方法在SARS-冠状病毒和流感嗜血菌、结核分枝杆菌、幽门螺杆菌的基因组中鉴定了169种SEQ ID 1-169所示的新基因。
本发明还有的实施方案(提供)防治病原生物，例如SARS-冠状病毒和流感嗜血菌、结核分枝杆菌、幽门螺杆菌所致疾病的方法，所述方法包括评价所提出的候选药物能否抑制一种或多种进化上保守的肽序列的功能，这些保守的肽序列可用本方法鉴定，选自对应于SEQ ID 1-169所示新基因(编码)的SEQ ID 170-338所示蛋白质。
在本发明还有另一实施方案中，该肽文库数据可取自任何生物而不特别限于本文所用的那些。
方法详述该方法主要有5步(如

图1所示)1.产生肽文库。
2.将某给定的基因组人工翻译成6个读框。
3.将每条翻译的序列转变为字母数字序列。(各条对应于各个读框)。
4.训练人工神经网络(ANN)。
5.使用经训练的ANN解密这些基因。
1.产生肽文库本发明需要一个参比肽文库来预测某给定基因组中的基因。在本发明中，申请人采用了已完全测序的56种原核生物基因组(编码)的蛋白质。我们数据库的蛋白质文件从ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes以FASTA格式获得。为制备用于解密某特定基因组中基因的肽文库，申请人排除了属于我们数据库的特定物种的蛋白质文件，目的是避免任何偏向性。例如，当分析大肠杆菌-k12基因组时，将对应于大肠杆菌所有菌株的蛋白质文件排除在用于产生该肽文库的数据库之外。当分析新测序的基因组时，必需这样做以除去得自该生物的肽的信号。这增强了该方法对不能得到其注释的蛋白质文件的新测序基因组的基因预测(能力)。产生肽文库时，通过将读窗移动一个氨基酸来包括所有可能的重叠七肽。从该肽文库中除去冗余肽，根据不同生物存在的肽数目给每个肽一个出现值。
该出现值是对编码区中七肽保守性的一种度量。ORF中存在高出现值的某七肽增加了该ORF是蛋白质编码基因的可能性。依据以下假设，如果某七肽在9种或更多种不同生物的蛋白质文件中存在，可认为它是高度保守的七肽，我们的算法将9或更大的出现值处理为9。用更高的值来进一步区分保守程度(amount)没有意义。
所述七肽文库由两列构成，第一列是七肽序列，第二列是该七肽的评分(出现值)。七肽按字典顺序分类。肽文库数据库也保留有关七肽的其它信息，例如所有包含特定七肽的蛋白质的登录号和NCBI注释。可利用其对某给定的ORF作假定的功能预测。同一方法也可用于种系发生结构域的分析。
2.将某给定基因组人工翻译成6个读框该算法的第二步是用标准密码子表将全部查询基因组人工翻译成所有的6个读框。然而，当需要时可采用用户指定的密码子表。在人工翻译基因组时，申请人使用字母‘z’对应于终止密码子TTA、TAG和TGA，字母‘b’表示含有任何非标准核苷酸(K、N、W、R和S等)的所有三联密码子。
3.将每条翻译的序列转变为字母数字式序列(各条对应于各个读框)我们的算法中下一步是将人工翻译，带有终止密码子(z)中断的氨基酸序列转变为字母数字式序列。申请人在肽文库中检索了每条重叠的七肽，分配了对应的数值(出现值)并将其加在字母数字式序列后。如果某七肽不存在于该文库中，申请人分配数值为0。如果某七肽以对应于起始密码子ATG、GTG和TTG之一的氨基酸开始，申请人在字母数字式序列中加上符号‘s’。这有助于检测可能的起始密码子的位置。当某七肽含有符号‘z’时，申请人加上对应于该七肽的符号‘*’。因此，字母数字式序列中连续7个‘*’(******)是终止密码子的信号。申请人给任何含有符号‘b’的七肽加上符号‘-’。该信号说明存在非标准核苷酸符号并且不传送关于序列是基因还是非基因一部分的信息。因此，如此产生的字母数字式序列含有13个符号，即任何整数(0-9)、‘s’、‘*’和‘-’。申请人以该方式将所有6个翻译蛋白质的文件转变为6个字母数字式序列。
4.训练人工神经网络(ANN)本文所用的神经网络具有多层正反馈拓扑学(结构)。它由一输入层、一隐藏层和一输出层构成。这是‘完全连接’的神经网络，其中每个神经元i与下一层的每个单元j相连(图2)。每个连接的权重以wij表示。输入层中每个神经元的状态Ii直接从输入数据指派，而隐藏层神经元的状态用S形(曲线)函数，hj＝1/(1+exp-λ(wj0+∑wijIi))用计算机处理，其中wj0是偏置权重，λ＝1。
采用了反向传播(back propagation)算法以尽可能降低计算机输出和所需输出之间的差异。进行了一千次轮(信号出现时间(epoch))迭代。然后鉴定确认组(validation set)中最小误差的信号出现时间，对应的权重(wij)指派为ANN的最终权重。该网络在训练组训练、核对误差并通过反向传播利用确认组优化。
‘训练组’由1610个NCBI列出的大肠杆菌-k12的蛋白质编码基因和还未报道为基因(非基因)的3000个大肠杆菌-k12 ORF(长度超过20个氨基酸并在同一框内含有起始密码子、终止密码子的序列延伸段)构成。‘确认组’具有大肠杆菌-k12的1000个已知基因和1000个非基因而与训练组所用的基因相区别。‘测试组’含有同一生物的另1000个基因和1000个非基因。为训练ANN，分别将基因和非基因的概率值指派为1和0。
为训练神经网络，申请人首先通过上述方法(步骤2和3)将大肠杆菌-k12所有的基因和非基因转变为对应的字母数字串。此时重要的是应注意与对应于非基因的字母数字式序列相比，对应于基因的字母数字式序列富含数字。为定量某字母数字式序列的这种数字丰富程度，从该字母数字式序列选择了5个参数。以下是这5个参数(i).总评分这是某给定的字母数字式序列的所有整数的代数和。经验法则方法是评分越高，成为基因的机会越大。
(ii).零部分零部分等于字母数字式序列中零符号的总数除以该序列中符号的总数。零部分越多，成为基因的机会越低。
(iii).平均值平均值等于总评分除以序列的总长度。平均值越高，成为基因的机会越高。实际上，该参数似乎与总评分相同，但由于该参数也包括了序列的长度(每单位长度的评分)，它是重要的。
(iv).方差是关于整个ORF的平均出现值的出现值方差。
(v).最大连续性非零延伸段的长度该参数的值越高，成为基因的机会越高。设想如‘45’的序列区。这里，‘4’表示某七肽在4种生物中保守，其后的‘5’表示某重叠的七肽在5种生物中保守。因此，如果在这两组之间至少一种生物是共同的，申请人最终获得了在该生物和查询ORF之间有共同一个八肽。这提高了我们预测编码区的可信度。例如，当与序列‘s40540607000*******’比较时，序列‘s45467000000********’更可能是一个基因。这是因为在后一序列中更有可能存在较长的保守肽。前一序列的该参数值是2而后一序列的为5。然而，该算法中所用的其它参数不能区分这两条序列。
当计算该字母数字式序列的这些参数时，已排除了例如‘s’、‘*’和‘-’符号。
为找到最佳组合，采用所有的5个参数一起训练神经网络。计算对应于基因和非基因的字母数字式序列的参数。训练组、确认组和测试组包含6列，前5列包含5个参数的值，最后一列包含表示基因的数字‘1’和表示非基因的数字‘0’。
输入层中神经元的数目等于输入数据点的数目。隐藏层中神经元的最佳数目由命中(hit)和试验所确定同时尽可能减少网络最佳信号出现时间的误差。计算所有5个参数的计算机程序和人工神经网络用C(语言)编写，在装有Red Hat Linux 7.3或8.0版的PC上执行。
训练ANN(该算法的步骤4)通常只进行一次，训练过的同一神经网络可用于对任何原核生物基因组执行该方法。虽然如果申请人采用生物特异性训练组，在一些情况中结果可能有所改善，但很勉强。这是因为我们的方法是根据ORF的字母数字式序列的数字分布来预测基因。所以，基因预测更依赖于所用的肽文库而非训练组。
5.使用训练过的ANN解密基因虽然认为产生肽文库(步骤1)和训练ANN(步骤4)是执行本发明方法的预备阶段，但步骤2和步骤3对每个基因组测序而言是强制性的。用计算机处理将基因组翻译成所有的6个读框并将它们转变为6个字母数字式序列后，即可用ANN解密这些基因。该步骤还可分为以下5个小步骤1.将所有6条字母数字式序列截断成可能的ORF。(所有可能的片段始于‘s’，终于‘*’)2.计算所有可能的ORF(所有的字母数字串在‘s’和‘*’之间)的所有5个参数(总评分、零部分、平均值、方差和连续性非零延伸段的长度)。
3.用训练过的ANN计算对应于某给定字母数字串的ORF成为蛋白质编码基因的概率。
4.采用一截断概率值从非编码ORF中滤出蛋白质编码ORF。
5.除去所有重叠(encapsulate)的蛋白质编码区(Shibuya，T.和Rigoutsos，I.，2002)如果在不同的翻译框中预测了两个ORF，以致于一个延伸完全重叠了另一个，通常认为二者中只有一个可能是真正的基因。在这种情况中，申请人报告具有较高概率值的ORF为基因。当概率值相同时，申请人取较长的ORF为基因。
本发明的方法可预测对应于某查询ORF是蛋白质编码区的概率值。利用＝1的S形(曲线)学习函数训练ANN(基因的概率为‘1’，非基因的概率为‘0’)；因此，大多数时间此概率值低于0.1或高于0.9。由于该原因，0.1-0.9之间的任何截断值可能得到非常相似的结果。在我们的分析中，申请人使用的默认截断值为0.5。重要的是应注意，本发明无需在灵敏度和特异性之间寻求平衡，因为截断概率的选择对结果无重要影响。
本发明的其它方面、特征和优点将通过以下提出的出于公开目的本发明优选实施方案的描述而得以明了。
计算机程序简述1.文件名genedcodchr.cxx应用将核苷酸序列(FASTA文件格式)翻译成6个独立框中的6个假设的多肽。
输入格式<Program_name><Nucleotide_file><Output1><Output2><frame>例如，./genedcodchr ecoli.fna pf1 pr1 0输出格式AGTFYRYmGHVNMKIYTASLPTYRYGYFSHRED.....HGOIEKSDWEzDFGTRE2.文件名searchchr.cxx应用通过七肽文库(给定的输入)检索将多肽文件转变为字母数字式序列。
输入格式<Program_name>7<peptide library file name>out Y<Input1><Input2><Output1><Output2>例如./searchchr 7 ecoli.peplib out Y pf1 pr1 bf1 br1输出格式s1124500001090003000020000023000000000*******0001000..........
3.文件名cutfc应用从正向链的字母数字式序列切除所有可能的ORF(即，所有的‘s’到‘*’区域)，产生含有字母数字式序列中所有‘s’的位置的文件。
输入格式<Program_name><Input file name><Output1><Output2>例如../cutf bf1 unknown_bf1 bf1_location输出格式output1-s1111000s00000000563*，output2-某列中‘s’的起始位置。
4.文件名cutr.c应用从反向链的字母数字式序列切除所有可能的ORF(所有的‘s’到‘*’区域)，产生含有字母数字式序列文件中对应于所有ORF的所有3个正向框的起始位置的文件。
输入格式<Program_name><Input file name><Output1><Output2>例如../cutr br1 unknown_br1 br1_location输出格式output1-*010340000222200067900000s000001000200s00230000s，output2-‘s’的起始位置5.文件名stat.c应用计算某给定的字母数字式序列的5个参数零部分、平均值、总评分、最大连续性延伸段的长度和方差。
输入格式<Program_name><Input file name><Output>1例如../statunknown_bf1 bf1.data 1输出格式0.334 3.2 48 15 0.452 16.文件名train.c应用利用S形(曲线)(＝1)作为学习函数以正反馈传播算法训练人工神经网络(一隐藏层、一输入和一输出层)。
输入格式<Program_name><Input specification file name><Input1><Input2><Input3>>output例如../train train.spec.fast trainset.data validateset.data testset.data>train.Net输出格式输出一单列中所含有的最终神经网络权重7.文件名recognize.c应用根据训练过的权重识别某给定的模式并产生概率值作为输出。
输入格式<Program_name><Input specification file name><Input1><Input2><Output>例如../recognize recognize.spec bf1.data train.net f1.out输出格式pat1 probability<value>
8.文件名Filter_prediction.c应用根据概率和长度参数滤除同一框中完全重叠的ORF。
输入格式<Program_name)<Input1><Input2><Output>例如../Filter_prediction f1.out unknown_bf1 bf1.out.res输出格式pat1 probability<value><integer string>
9.文件名locationf.c应用滤除长度＜20个氨基酸的基因，报告含所有3个正向框字母数字式序列的其余基因的起始位置输入格式<Program_name><Input1><Output><Input2>例如../locationfbf1.out.res bf1.out.res bf1_location输出格式<Pattern No><Probability value><integer string><Start><End>
10.文件名locationr.c应用滤除长度＜20个氨基酸的基因，报告含与所有3个反向框的字母数字式序列的其余基因的起始位置输入格式<Program_name><Input1><Output><Input2>例如../locationrbr1.out.res br1.out.res1 br1_location输出格式<Pattern No><Probability value><integer string><Start><End>
11.文件名finalf.c应用将字母数字式序列的起始和末端位置转变为3个正向框的相应的基因组位置输入格式<Program_name><Input1><Input2><Input3><Output>例如../finalf bf1.out.res1 bf2.out.res1 bf3.out.res1 Final_outputf输出格式<Start><End><frame><length><Probability value>integerstring>
12.文件名finalr.c应用将字母数字式序列的起始和末端位置转变为3个反向框的相应的基因组位置输入格式<Program_name><Input1><Input2><Input3><Output>例如../finalf br1.out.res1 br2.out.res1 br3.out.res1 Final_outputr输出格式<Start><End><frame><length><Probability value><integerstring>
13.文件名sort.c文件名sort.c应用将最终预测的基因打印为沿该基因组起始位置的递降顺序。
输入格式<Program_name><Input1><Input2><Input3><Output>例如../sort Final_outputfFinal_outputr OUTPUTF_with_encapOUTPUTR_with_encap OUTPUT输出格式<Start><End><Probability value>
14.文件名removeencap.c应用除去在其它5个框中发现的重叠基因输入格式<Program_name><Input1><Input2><Input3><Output>例如../removeencap OUTPUTF_with_encap OUTPUTR_with_encap OUTPUTOUTPUTF OUTPUTR输出格式<Start><End><frame><length><Probability value>integerstring>
本发明涉及基于计算机的预测可用作药物靶点的蛋白质编码DNA序列的新方法。在该方法中，利用出现的寡肽标签(signature)作为探针。该方法是通用性的，不一定需要用于人工神经网络的生物特异性训练组。该方法不仅依赖于统计学分析，而且整合了经受过进化压力的保守肽中所保留的生物信息。可合乎逻辑地扩理地拓展该方法来预测真核生物基因组中的蛋白质编码DNA序列(外显子)。
附图简述图1显示了GeneDecipher的逻辑电路。
图2显示了神经网络的结构。
图3显示了GeneDecipher对10种生物所得结果的分析。
下文给出了本发明所用生物的细节，包括名字、菌株、登录号和其它细节。
给出以下实施例是为了说明本发明而不应理解为限制本发明的范围。
实施例1将DNA序列转变为字母数字式序列该模块在我们软件中的目的是经计算机处理利用特定的密码子表将整个查询基因组(DNA序列)翻译成所有的6个读框。人工翻译基因组时，申请人使用的字母‘z’对应于终止密码子TTA、TAG和TGA，字母‘b’表示含有任何非标准核苷酸(K、N、W、R和S等)的所有三联密码子。然后将翻译的基因组序列经计算机处理转变为字母数字式序列(
、‘s’、‘*’和‘-’)。申请人在该肽文库中检索了每条重叠的七肽，指派了对应的数值(出现值)并将其加在字母数字式序列后。如果某七肽不存在于此文库中，申请人指派数值0。如果某七肽以对应于起始密码子ATG、GTG和TTG之一的氨基酸开始，申请人在该字母数字式序列中加上符号‘s’。这有助于检测可能的起始密码子位置。在某七肽含有符号‘z’的情况中，申请人加上对应于该七肽的符号‘*’。因此，字母数字式序列中连续7个‘*’(*******)是终止密码子的信号。申请人给任何含有符号‘b’的七肽加上符号‘-’。该信号表明存在非标准核苷酸符号。
在下列6条序列的帮助下进一步精制了上述转变。
·SEQ ID No.12
>gi_GDC_HINF_243018GTGATGAGCCGACATCGAGGTGCCAAACACCGCCGTCGATATGAACTCTTGGGCGGTATCAGCCTGTTATCCCCGGAGTACCTTTTATCCGTTGAGCGATGGCCCTTCCATTCAGAACCACCGGATCACTATGACCTACTTTCGTACCTGCTCGACTTGTCTGTCTCGCAGTTAAGCTTGCTTATACCATTGCACTAA计算机翻译的蛋白质序列>gi_GDC_HINF_243018VMSRHRGAKHRRRYELLGGISLLSPEYLLSVERWPFHSEPPDHYDLLSYLLDLSVSQLSLLIPLH计算机产生的字母数字式序列ss10000000000001s03111431000000000000000000110000100s001030*·SEQ ID No.4
>gi_GDC_HINF_170553GTGTTTATGCTTTATTTAGAATTTTTATTTTTACTATTAATGCTCTATATCGGTAGCCGTTACGGCGGTATCGGATTAGGTGTTGTTTCTGGTATCGGTCTTGCTATCGAGGTTTTCGTATTTCGTATGCCAGTGGGGAAGCACCGATTGATGTTATGCTTATCATTCTTGCAGTGGTGA计算机翻译的蛋白质序列>gi_GDC_HINF_170553VFMLYLEFLFLLLMLYIGSRYGGIGLGVVSGIGLAIEVFVFRMPVGKHRLMLCLSFLQW
计算机产生的字母数字式序列s0s1131231142s1111445232254238000000000000s0s0000ss00*·SEQ ID No.73
>gi_GDC_MTUB_688806TTGCTGCACAGCAGCTTCGGGCACCTCGAGGGCATCCAGCAGCCGCTCATAGACGAGCTGGCAGAACTCGACCACGTGTTGGGCAAGCTGCCGGACGCCTACCGGATCATCGGCCGCGCCGGCGGCATATACGGTGACTTCTTCAACTTCTATCTGTGTGACATCTCACTGAAAGTCAACGGATTACAGCCTGGAGGTCCGGTACGCACCGTCAAGTTGTTCGGCCAGCCGACCGGCAGGTGCACACCGCAATGA计算机翻译的蛋白质序列>gi_GDC_MTUB_688806LLHSSFGHLEGIQQPLIDELAELDHVLGKLPDAYRIIGRAGGIYGDFFNFYLCDISLKVNGLQPGGPVRTVKLFGQPTGRCTPQ计算机产生的字母数字式序列s000000000110110530100000ss000000000000100000000000000000001111210000000s00100*·SEQ ID No.92
>gi_GDC_MTUB_1286282GTGACGGTATACCGTCGAGGTATGGCTGTGTTAACGGATGAGCAGGTCGACGCCGCACTGCACGACCTCAACGGCTGGCAGCGCGCCGGTGGTGTCCTGCGTAGGTCAATCAAGTTTCCGACGTTTATGGCCGGTATCGACGCCGTACGCCGGGTGGCCGAGCGAGCCGAGGAGGTAAATCATCATCCGGACATCGATATCCGTTGGCGAACAGTAACTTTCGCGCTGGTTACGCATGCGGTAGGTGGTATCACGGAAAACGACATTGCGATGGCGCACGATATCGACGCAATGTTTGGGGCCTAA计算机翻译的蛋白质序列>gi_GDC_MTUB_1286282VTVYRRGMAVLTDEQVDAALHDLNGWQRAGGVLRRSIKFPTFMAGIDAVRRVAERAEEVNHHPDIDIRWRTVTFALVTHAVGGITENDIAMAHDIDAMFGA
计算机产生的字母数字式序列s000000s0s21110001000000300000000011000000s01031100s00020000110000000030000000013310000000s0001*·SEQ ID No.49
gi_GDC_HPYL_583607TTGATGGAATTTGATGTTACCATCATAGATGAGACAGGCAGGGCCACAGCACCAGAAATCTTGATTCCTGCACTTCGCACTAAAAAACTGATCTTAATAGGCGATCACAACCAGCTCCCACCTAGCATTGATAGGTACCTCCTAGAACAATTAGAGAGCGATGATATTCAAAACTTGGATGCCATTGATCGCCAATTATTGGAAGAGAGTTTTTTTGAAAATCTCTATAAGTATATTCCAGAGAGTAATAAGGCCATGCTTAATGAGTAA计算机翻译的蛋白质序列>gi_GDC_HPYL_583607LMEFDVTIIDETGRATAPEILIPALRTKKLILIGDHNQLPPSIDRYLLEQLESDDIQNL DAIDRQLLEESFFENLYKYIPESNKAMLNE计算机产生的字母数字式序列ss001000000000000000s0000011000020000000000030310000000002s0003020s0000000000000000*·SEQ ID No.54
gi_GDC_HPYL_954846GTGAGCCTGGTTTCAAGCGTGTTTTTAATGTGTTTAGACACTCAAGTGCTAGTCTTTGGGGATTGCGCGATTATCCCTAACCCTAGCCCTAAAGAATTAGCCGAGATCGCTACCACTTCCGCACAAACCGCCAAGCAATTCAATATTGCGCCTAAAGTGGCCTTGCTTTCTTATGCGACAGGCGATTCCGCTCAAGGCGAAATGATAGACAAAATCAACGAAGCTTTAACAATCGCTCAAAAGTTGGATCCCCAATTAGAAATTGATGGCCCCTTACAATTTGACGCTTCCATTGATAAAAGCGTAGCCAAGAAAAAATGCCTAACAGCCAAGTGGCTGGGCAAGCTAGCGTTTTTATTTTCCCGGATTTAA计算机翻译的蛋白质序列
>gi_GDC_HPYL_954846VSLVSSVFLMCLDTQVLVFGDCAIIPNPSPKELAEIATTSAQTAKQFNIAPKVALLSYATGDSAQGEMIDKINEALTIAQKLDPQLEIDGPLQFDASIDKSVAKKKCLTAKWL GKLAFLFSRI计算机产生的字母数字式序列s80000s00s00002s200222000000003100000000000000000010s0s100000000000s0000000100000s00000000000000000000000000030000010*实施例2训练人工神经网络(ANN)该模块在软件中的目的是用特定的基因和非基因编号训练指定的神经网络(图2)。在该实施例中，训练组由1610个NCBI列出的大肠杆菌-k12蛋白质编码基因和还未报道为基因的3000个大肠杆菌-k12 ORF(非基因)构成。确认组具有大肠杆菌-k12的1000个已知基因和1000个非基因而和训练组所用的相区别。测试组含有同一生物的另外1000个基因和1000个非基因。为训练ANN，基因和非基因分别指派的概率值为1和0。为训练神经网络，申请人首先通过上述方法(步骤2和3)将所有大肠杆菌-k12基因和非基因转变为对应的字母数字式链。图3显示了字母数字式序列格式的两个大肠杆菌-k12基因和两个非基因的例子。这里重要的是应注意与对应于非基因的字母数字式序列相比，对应于基因的字母数字式序列富含数字。为定量其字母数字式序列的这种数字丰富程度，从该字母数字式序列选择了5个参数。以下是这5个参数表1(a)和1(b)解释了总评分(某给定的字母数字式序列的所有整数的代数和)、零部分(该字母数字式序列中零符号的总数除以该序列中符号的总数)、平均值(总评分除以序列的总长度)、方差(关于整个ORF的平均出现值的出现值方差)、最大连续性非零延伸段的长度(表示无间断的非零数字在序列中的占位情况)。
表1(a)训练ANN(基因)
表1(b)训练ANN(非基因)
当计算该字母数字式序列的这些参数时，排除符号‘s’、‘*’和‘-’。为确定每个参数对区分基因与非基因的作用，采用所有5个参数一起训练神经网络。计算出对应于基因和非基因的字母数字式序列的参数。训练组、确认组和测试组包含6列，前5列包含5个参数的值，最后一列包含表示基因的数字‘1’和表示非基因的数字‘0’。
实施例3申请人使用本发明的方法分析了10种原核生物基因组。该方法的效率定义为由所述方法预测的NCBI列出的蛋白质编码区的百分比。通过专门开发的程序自动除去所有重叠的蛋白质编码区。该方法能预测平均92.7％的NCBI列出的基因，标准差是2.8％。除结核分枝杆菌H37RV基因组外，该方法的灵敏度和特异性值均高(如图3所示)。
实施例4预测蛋白质编码DNA序列的起始位置本发明方法预测起始位置的正确率从结核分枝杆菌H37Rv的49.5％(特异性也是最低的)到幽门螺杆菌26695的81.1％。申请人的方法根据是否存在起始密码子加周围七肽的保守情况可确定该起始位置。也可利用该方法预测经一些其它方法预测的查询蛋白质编码DNA序列的起始位置。这可通过简单地将蛋白质序列转变为对应的整数序列，然后根据周围七肽确定正确的起始位置来实现。为举例说明起始位置的预测(如下所示)，申请人报告了大肠杆菌K-12基因组的3个这样的情况(两个来自正向链，一个来自反向链)。
预测起始位置时，要兼顾数字丰富程度和ORF的长度。在情况1(PID 16132273)中，NCBI将该基因的起始位置从位置85540移至85630。目测对应于该基因的整数序列，可以明显看出较早的在‘s’后有充满0的区域；或者换言之它不是富含数字的区域(下图所示情况1中的黑体区域)。现在移动起始位点使它位于本发明方法预测的数字丰富区之前。情况2是该起始密码子向5’上游移动的一个例子，因为在该起始密码子的上游有数字丰富区(‘2011111’和一个‘3’和一个‘2’)。故该位点从位置4611194移至4611050。情况3是移动反向链中起始位点的另一例子，其中在较早的NCBI起始位置的上游有数字丰富区(该数字串中有‘16531311’和许多其它数字)。
情况1.PID 16132273位置较早的NCBI(85540……87354)；新的NCBI(85630……87354) s0s0000000000000s000000000s000s2ss4222s111000000000999922224210000s00s40004466442223s0s0120000000177s9999855553239888440s001111000113002s1116311112ss22222s430100000000100s0100000639977100011100100000001000000000s2000010030000011110111100000161171000000000s201s12s0000002ss10000000001099s76s6211100s0s0000s00014444441111100000000000234331211000s033221s000000014s000s00000002000000000001110000000000000000000s000001s000000s48976531s1111110001223459999999s92554010010s0s0002s2236667778s75221001s000s000ss00000066ss11111s3211100000s000002204332110000000000210010010000s00000s11000000354211s000000s00s22*******情况2.PID 16132266位置较早的NCBI(4611194……4611829)；新的NCBI(4611050……4611829)
s00020111110000000000000300000000020000010000030ss000000001110s0s000ss00000s102110000000100ss3s2000000000000000000000100021100011s110000000000s00000000001s10100000010100002222222000000000000000010321002s3321111s11011110010000000s00s000s00101010100s00000*******情况3.PID 16132224位置较早的NCBI(2538824……2539273)；新的NCBI(253824……2539699)N*******0000000000000ss000000001s2000104220300000000s00000000000100000s0s98↓889135120sss0001222000022512s0000223s123100000000ss0s000ss0022s30000ss00000s00000000000001000000s0s0000s16531311000000101010000s00200101s1110000230ss0↓100000s0001000000s0000000s0000s0s00001100s0011000000000000000s00000s←———— EENCBI的较早的起始位点→正向读框NNCBI的较新的起始位点→反向读框实施例5预测蛋白质编码DNA序列通过采用以下步骤利用该方法预测发表的可得到的数据库(NCBI)中各种基因组的蛋白质编码DNA序列i)从选择的生物的所有蛋白质序列经计算机处理产生重叠的肽文库，所述蛋白质序列得自http://www.ncbi.nlm.nih.gov；ii)按字母顺序，根据单字母氨基酸密码用计算机拣选以上获得的长度为‘N’的肽；iii)将每个肽和出现它们的不同特异性生物分类；iv)利用步骤1和2获得的肽文库将DNA序列转变为字母数字式序列；v)检索该字母数字式序列检索所有可能的开放读框(ORF)；vi)训练改进的神经网络来区分蛋白质编码和非编码DNA序列；vii)利用训练过的神经网络预测该开放读框(步骤4中获得)中的DNA编码序列；viii)除去重叠的蛋白质编码DNA序列(基因内的基因)。
如表2所详述的，本发明人使用本发明的方法从选自以下的生物的基因组中发现了169个新基因SARS-冠状病毒、流感嗜血菌、结核分枝杆菌和幽门螺杆菌。表2显示了SEQ ID No.1-SEQ ID No.169所示序列中的所述新基因。
表2
对10种微生物基因组分析了GeneDecipher的系统灵敏度和特异性(图3)。以下给出了对病毒基因组的GeneDecipher进一步分析。
SAR-CoV基因组序列从GenBank数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/genomes/viruses)下载可利用的18 SARS-CoV毒株序列并分析。这些序列包括SARS-CoV Refseq(NC_004718.3)、SARS-CoV TWC(AY32118)、SIN2774(AY283798)、SIN2748(AY283797)、SIN267^(AY283796)、SIN2677(AY283794)、SIN25ti6(AY283794)、Frankfurt(A Y291315)、BJ04(AY279354)、BJ03(AY278490)、BJ02(AY278487)、GZ01(AY278848)、CUHKW 1(AY278554)、TOR2(AY274119)、TW1(AY291451)、BJ01(AY278488)、Urban(AY278741)、HKU-39849(AY278491)。其它蛋白质编码基因相关的信息检索得自http://www.nchi.nlm.nih.gov/genomes/SARS/SAks.html。
对病毒基因组测试GeneDecipher为对病毒基因组测试我们的方法，申请人首先用GeneDecipher分析了人呼吸道合胞病毒(HRSV)的完全基因组。将GeneDecipher的结果与现有技术水平的方法ZCURVE_CoV进行了比较(表3)。ZCURVE_CoV能从11个NCBI报道的基因中预测8个注释的蛋白而无假阳性。ZCURVE_CoV不能预测以下3个基因PID 9629200(位置626...1000，非结构蛋白2(NS2))；PID 9629205(位置4690...5589，粘附性糖蛋白(G))和PID 9629208(位置8171...8443，基质蛋白2(M2))。GeneDecipher从总共11个注释的HRSV蛋白中预测了10个而无假阳性。注意到GeneDecipher遗漏的基因也是ZCURVE_CoV所遗漏的PID 9629208(位置8171...8443，基质蛋白2)。
成功预测了HRSV基因组中的蛋白质编码区提高了我们对预测新测序的SARS-CoV基因组中蛋白质编码区的信心。
用GeneDecipher分析SARS-CoV申请人用GeneDecipher分析了SARS-CoV的所有18个病毒株。(详细结果见以上给出的网址)。对18个病毒株中的每种而言，GeneDecipher在SARS-CoV基因组中预测了总共15个蛋白质编码区，包括多聚蛋白1a、1ab(多聚蛋白1ab的Sars2628 C末端)和所有4种已知的结构蛋白(M、N、S和E)。取决于所用病毒株的基因组序列，GeneDecipher也预测了6-8个额外的编码区。这些额外编码区的长度范围是61-274个氨基酸。
GeneDecipher预测的12个编码区是所有18个病毒株共有的(表4)和存在于5个病毒株中的一个编码区(NCBI refseq基因组中的Sars63、sars6)。GeneDecipher特别在GZ01病毒株中预测了基因Sars90，在BJ02病毒株中预测了Sars154(NCBIrefseq基因组中的Sars 3b)。
这12个共有蛋白质编码区由SARS-CoV的6个基础蛋白质(2个多聚蛋白和4个结构蛋白)构成Sars274(NCBI refseq数据库中的Sars3a)、Sars 122(NCBI refseq数据库中的Sars7a)、Sars78(已报道TOR2病毒株中起始点转移为ORF14/Sars9c)；和3个新预测到的(对NCBI的当前注释而言是假阳性)蛋白质编码区Sars174、Sars68和Sars61。这3个新预测的基因全部位于多聚蛋白1a基因组区域中。虽然在细菌基因组中我们的方法舍弃了这种基因，但不能排除在病毒基因组中发现这种基因的可能性。由于这些基因存在于所有18种病毒株中，它们可能是蛋白质编码区。
除了上述12个编码区以外，申请人还预测了3个编码区，Sars63、Sars154和Sars90。Sars63在5个病毒株中均鉴定到但未在其余13个病毒株中鉴定到。该编码区早已报道在NCBI refseq中(Sars6)。申请人不能在本文中过多评价Sars63(NCBIrefseq中的Sars6)的存在。因为它在5个并毒株中鉴定到而在其余13个病毒株中未鉴定到。这是因为病毒株之间该区域的非同义突变密度高。两个编码区Sars154(NCBI中的sars3b)和Sars90(在GZ01毒株中新预测的)只在一个病毒株中鉴定到。由于这两个编码区只在一个病毒株中鉴定到，它们不大可能是蛋白质编码区，ZCURVE CoV(Chen等，2003)分析也提出同一结论。该3个基因在不同病毒株中的位置见表5。
由于此肽文库从各种生物的基因组序列制备，故可以追踪某给定蛋白的进化起源。如果该蛋白富含发现在病毒基因组中的七肽，则可以认为该蛋白是病毒起源的。申请人发现5个核心蛋白(两个多聚蛋白和3个结构蛋白M、N和S)是病毒起源的。其余的(包括3个新预测的)是原核生物起源的。令人感兴趣的是从同一DNA区域申请人在不同读框中得到含有不同起源的肽的蛋白。同一DNA序列如何编码细菌和病毒起源的(蛋白)令人感兴趣。这或许可解释为何在依据与其它已知病毒基因组序列的同源性作的初步分析中未能检测到这些新的蛋白质编码基因。
与现有系统-ZCURVE_CoV的比较表6a和6b给出了用SARS-CoV的Urbani和TOR2病毒株的已知注释比较GeneDecipher和ZCURVE_CoV的结果。
GeneDecipher的结果与已知的注释相一致。就Urbani并毒株而言，GeneDecipher预测到除Sars84(X5)、Sars63(X3)和Sars154(X2)之外的所有已知基因。ZCURVE_CoV预测到Sars84(X5)和Sars63(X3)，而两种方法均遗漏了Sars154(X2)。GeneDecipher在该病毒株中顺便预测了ZCURVE_CoV未预测到的4个新基因。要注意的是在这4个基因中Sars78是病毒株TOR2已知的ORF14/Sars9c。这支持了该基因存在于Urbani病毒株中的可能性。然而，ZCURVE_CoV也预测了GeneDecipher未预测到的两个新基因。
GeneDecipher对TOR2病毒株的预测与对Urbani病毒株的预测相同。在该病毒株中，GeneDecipher预测了9个已知基因，但未预测到6个具有已知注释的基因。这6个基因是Sars154(ORF4)、Sars98(ORF13)、Sars63(ORF7)、Sars44(ORF9)、Sars39(ORF10)和Sars84(ORF11)。在这些基因中，Sars154(ORF4)和Sars98(ORF13)也为ZCURVE_CoV所遗漏。应注意Sars44(ORF9)和Sars39(ORF10)均是长度非常小(分别是44和39个氨基酸)的ORF，它们也不全存在于各种SARS病毒株中。GeneDecipher在其它5个病毒株而非在本文考虑的两个病毒株中预测到了Sars63(ORF7)。
突变分析使用多个序列比对(ClustalW)对所有18个病毒株的3个新预测的蛋白质编码基因Sars174、Sars68和Sars61进行分析显示1.SIN2677病毒株中Sars68在位置80具有一个点突变GAT->GGT(D->G)。
2.GZ01病毒株中Sars174在位置204具有同义点突变CGA->CGC和BJ04病毒株中在位置447具有同义突变CTG->CTT。
3.GZ01毒株中Sars61在位置119具有一个点突变CTG->CAG(L->Q)。
这3个新预测的基因存在于所有18个病菌株中而无明显的突变，并且在非冗余数据库中用BLASTP命中不明显。这表明该3个蛋白对SARS-CoV可能有特别重要的生物学功能。因此，这些编码序列可作为抗SARS的候选药物靶点，功能指定申请人总共预测了SARS-CoV中的15个编码区，其中已指定了4个结构蛋白(M、N、S和E)的功能。虽然已指定了多聚蛋白1ab只有复制酶活性，我们的分析暗示该复制酶活性与Sars2628(ORF 1ab的C末端)片段相关。完整的1ab多聚蛋白含有6个功能标签，其中多聚蛋白1a含有与代谢酶相关的标签(表7a)。根据在至少5种不同生物中具有相似功能的蛋白中存在的肽(长度为7个或更多个氨基酸)给多聚蛋白指定功能。其它预测的基因/蛋白质编码区含有的肽存在于较少基因组中。根据这些肽，申请人提出了它们的功能，虽然不大肯定(表7b)。这些发现的生物相关性有待研究。
表3.就注释的基因而言，对HRSV基因组比较GeneDecipher与ZCURVE_CoV的结果
表4GeneDecipher在所有18个病毒株共有的SARS-CoV Refseq中所预测的蛋白质编码基因
表5GeneDecipher在各种SARS-CoV中鉴定到的视为蛋白质编码基因的Sars90、Sars63和Sars154
表6(a).就注释的基因而言，对SARS-CoVUrbani病毒株基因组比较GeneDecipher与ZCURVE_CoV的结果
表6(b).就注释的基因而言，对SARS-CoVTOR2病毒株基因组比较GeneDecipher与ZCURVE_CoV的结果
表7(a)用PLHOST指定SARS(Urbani)基因组中多聚蛋白的功能
表7(b)用PLHOST提出SARS-CoV中一些非结构基因的功能
*未发现保守的八肽。然而，功能已根据仅有的高保守七肽指定。
如上所述，申请人公开了SARS-CoV中的4个新基因，包括Sars78。该分析进一步确证了ZCURVE_CoV的发现(Chen等，2003)，即ORF Sars154(作为Sars3b列于Refseq中)不可能是编码区。申请人也给两个多聚蛋白1ab和1a指定了功能。除了1ab多聚蛋白C末端的复制相关功能外，申请人的分析提示多聚蛋白1a可能与代谢酶样的功能相关。总之，多聚蛋白1ab中存在6个肽标签。申请人给其它9个蛋白，包括通过GeneDecipher新预测到的提出了假定的功能。
优点1.本发明的主要优点是提供一种预测蛋白质编码DNA序列而不使用任何外部证据，例如核糖体结合位点、启动子序列、转录起始位点或密码子使用偏爱的新方法。
2.本发明提供蛋白质编码DNA序列的统计学分析方法，所述方法利用经受了进化压力的保守肽中所留生物学信息。
3.本发明提供一种预测蛋白质编码基因的起始位点的简单方法。
4.本发明提供一种检测生物特异性、毒株特异性蛋白质编码DNA序列的方法。
5.本发明提供可用作潜在药物靶点的新蛋白质编码DNA序列。
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申请组织街道Rafi Marg市新得里省得里国印度邮编110001电话号码传真号码电子邮件地址impd@vsnl.net<110>组织名科学工业研究委员会申请项目<120>名称一种鉴定可用作药物靶点的蛋白质编码DNA序列的基于计算机的通用方法<130>申请文件参考US 1729<140>当前申请号<141>当前提交日期--序列<213>生物名流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)<400>前序列链(PreSequenceString)ttgttgttga aaggagtgat tatgcaggtc tcaagaagaa aattcttcaa gatctgtgca60 ggaggtatgg cgggaacgtc agctgcaatg ttgggctttg ctccagcaaa cgtattagct120 gcgccacgcg aatataaatt attacgcgcg tttgaatccc gtaacacctg tacatattgc180 gctgtaagtt gcggtatgtt gttatatagc acaggcaaac cttacaattc attaagcagc240 catactggca caaatactcg ttcaaaactc tttcatattg agggtgatcc agatcatcca300 gtcagtcgtg gtgcgctttg cccgaaaggt gctggctcac tcgattatgt caatagtgaa360 agccgttctt tatatcctca atatcgtgcg ccaggttctg ataaatggga acgaatttct420 tggaaagatg ccattaaacg tattgctcgt ttaatgaaag atgaccgaga tgccaacttt480 gttgaaaaag attcaaatgg aaaaacggtt aatcgttggg caacgacagg aattatgact540 gcatcagcaa tgagcaatga agctgcgtta ttaacacaaa agtggattag aatgctcggt600 atggtgccag tatgtaacca agcgaatact tga633<212>类型DNA<211>长度633序列名SEQ ID 1GDC_HINF_5641序列描述
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权利要求
1.一种鉴定用作药物靶点的蛋白质编码DNA序列的基于计算机的通用方法，所述方法包括以下步骤；a.用计算机处理以字母顺序排列的长度为‘N’的肽从已知基因组产生肽文库；b.人工翻译该测试基因组获得每个读框的多肽；c.根据这些寡肽在肽文库的出现情况将每条多肽序列转变为字母数字式序列，其中每条序列对应于一个读框；d.用S形(曲线)学习函数将人工神经网络(ANN)训练成对应于已知的蛋白质编码DNA序列和已知的非编码区的字母数字式序列；e.解密该测试基因组中的蛋白质编码区；和f.鉴定对大量用作功能标记物的已知基因作图的肽的较长延伸段。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述人工神经网络具有一个或多个输入层、一个或多个具有数目不同的神经元的隐藏层和一个或多个输出层。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，隐藏层中神经元的数目优选为30。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述‘N’的值是4或更大。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述S形(曲线)学习函数具有5种参数，包括总评分、平均值、零部分。最大连续性非零延伸段和方差。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述鉴定基因的方法利用在其它基因组的ORF中发现的寡肽，所述基因组包括，但不限于流感嗜血菌(H.influenzae)、生殖道枝原体(M.genitalium)、大肠杆菌(E.coli)、枯草芽胞杆菌(B.subtilis)、闪烁古生球菌(A.fulgidis)、结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、苍白密螺旋体(T.pallidum)、海栖热袍菌(T.maritima)、集胞蓝细菌(Synechocystis)、幽门螺杆菌(H.pylori)和SARS-CoV的基因组。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述肽文库可取自任何生物，但不特别限于本发明所用的生物。
8.用权利要求1所述方法鉴定的SEQ ID No 1-44所示流感嗜血菌的一组基因。
9.对应于用权利要求1所述方法鉴定的SEQ ID No 1-44所示流感嗜血菌基因的SEQ ID No 170-213所示的一组蛋白质。
10.用权利要求1所述方法鉴定的SEQ ID No 45-60所示幽门螺杆菌的一组基因。
11.对应于用权利要求1所述方法鉴定的SEQ ID No 45-60所示幽门螺杆菌基因的SEQ ID No 214-229所示的一组蛋白质。
12.用权利要求1所述方法鉴定的SEQ ID No 61-165所示结核分枝杆菌的一组基因。
13.对应于用权利要求1所述方法鉴定的SEQ ID No 61-165所示结核分枝杆菌基因的SEQ ID No 230-334所示的一组蛋白质。
14.用权利要求1所述方法鉴定的SEQ ID No 166-169所示SARS-冠状病毒的一组基因。
15.对应于用权利要求1所述方法鉴定的SEQ ID No 166-169所示SARS-冠状病毒基因的SEQ ID No 335-338所示的一组蛋白质。
16.对应于SEQ ID No 1-169所示基因的SEQ ID No 170-338所示蛋白质作为药物靶点在防治需要这种防治对象的病原生物所致疾病中的应用。
17.如权利要求16所述的应用，其特征在于，所述病原生物选自SARS-冠状病毒、流感嗜血菌、结核分枝杆菌和幽门螺杆菌。
18.如权利要求16所述的应用，其特征在于，所述应用扩展至真核生物和多细胞生物。
19.如权利要求16所述的应用，其特征在于，所述对象是动物。
20.如权利要求16所述的应用，其特征在于，所述对象是人。
全文摘要
本发明涉及一种利用特别开发的软件GeneDecipher鉴定基因组中可用作药物靶点的蛋白质编码DNA序列(基因)的通用方法，所述方法包括用计算机处理字母顺序排列的长度为‘N’的肽从已知基因组产生肽文库；人工翻译该测试基因组获得对应于每个读框的多肽；根据与肽文库的重叠情况将每条多肽序列转变为字母数字式序列，其中每条序列对应于一个读框；用S形(曲线)学习函数将人工神经网络(ANN)训练为字母数字式序列；解密该测试基因组中的蛋白质编码区；从而鉴定对大量已知基因作图的肽的较长延伸段和它们对应的蛋白质；最后本发明涉及防治病原生物导致疾病的方法，包括通过抑制一种或多种本发明步骤鉴定到的蛋白质功能来评价提出的候选药物。
文档编号G01N33/50GK1914616SQ200480040837
公开日2007年2月14日 申请日期2004年1月9日 优先权日2003年12月5日
发明者S·K·布拉马查里, D·达舍, R·沙尔马, J·K·马赫施瓦瑞 申请人:科学工业研究委员会