专利名称：与肿瘤转移细胞特异性结合的多肽的筛选及鉴定的制作方法
技术领域：
本发明涉及利用噬菌体展示文库技术筛选能与肿瘤转移细胞表面抗原特异性结合的多肽的方法，具体地说，是应用原位肿瘤和肿瘤转移细胞系差异筛选随机12肽噬菌体展示文库，得到可以用作肿瘤转移标志物的特异12肽序列。
背景技术：
肿瘤细胞从原有部位侵入淋巴管、血管或体腔，迁徙到它处而继续生长，形成与原发瘤同样类型的肿瘤，称为转移[杨光华等《病理学》(第五版)，人民卫生出版社，2001年，P87)。
从分子水平发现肿瘤细胞表面各种分子的非正常表达，对于鉴别肿瘤地转移和发展有重要意义，VEGFR(血管内皮生长因子受体)在很多恶性癌细胞，如恶性肝癌细胞和头颈部扁平上皮癌细胞的表面高表达(邓靖宇，何生，等.VEGF在肝癌中的作用，世界华人消化杂志，2004，12(2)454-458)；内源血凝集素在对肺部有高转移性的恶性肿瘤细胞表面含量较高[RazA，Meromsky L，Lotan R，等.内源凝集素在正常细胞、肿瘤细胞和肿瘤转移细胞表面的差异表达，Cancer Research，1986年7月，46(7)3667-3672]。这些细胞表面分子有可能作为肿瘤转移发生的标志物，在肿瘤诊断、判断预后、转归和评价疗效以及高危人群随访观察等方面，具有较大的实用价值。
现有噬菌体展示技术通常是对纯化了的蛋白进行筛选，得到与该蛋白特异结合的寡肽或抗体。在此基础上我们运用噬菌体展示技术对细胞表面抗原进行筛选，通过这种方法可以得到对细胞表面特异结合的寡肽分子。我们的方案克服了以往细胞筛选中的一些问题，主要是细胞表面成分复杂而且未知，细胞筛选的非特异性较大，背景值高，而且转移与非转移肿瘤细胞间细胞表面差异小。
发明内容
因为完整细胞的表面有大量的糖类、蛋白等抗原成分与肿瘤转移相关，所以它们是潜在的肿瘤标志物。本发明应用原位肿瘤细胞和肿瘤转移细胞系，对噬菌体文库进行差异筛选，从而获得能与肿瘤转移细胞系特异性结合的12肽。
本发明应用SW480(原位肿瘤细胞系)和SW620(肿瘤转移细胞系)差异筛选噬菌体肽库，获得选择性地结合肿瘤转移细胞的12肽，其氨基酸序列如下
Leu-Pro-Trp-Lys-Glu-Pro-Tyr-Tyr-Leu-Met-Pro-Pro (1)
Ser-Pro-Trp-Ser-Glu-Pro-Ala-Tyr-Tyr-Leu-Ala-Pro (2)
Val-Pro-Trp-Met-Glu-Pro-Ala-Tyr-Gln-Arg-Phe-Leu (3)
Ser-Val-Ser-Val-Gly-Met-Lys-Pro-Ser-Pro-Arg-Pro (4)
上述(1)(2)(3)三个12肽中，Pro-Trp-X1-Glu-Pro-X2-Tyr为保守序列，其中X1和X2分别代表任意一个氨基酸。
在低转移细胞系MCF7(ATCC保藏号HTB-22)和T47D(ATCC保藏号HTB-133)，以及高转移细胞系MD-MB-231(ATCC保藏号HTB-26)和MD-MB-435(ATCC保藏号HTB-129)等4个细胞系中，证实了上述四个12肽与肿瘤的转移能力呈正相关。
与肿瘤转移细胞特异结合的12肽的筛选和鉴定包括如下步骤
·经过对原位肿瘤细胞和转移肿瘤细胞系进行四轮差异筛选，获得能与转移肿瘤细胞SW620选择性结合的重组噬菌体；
·噬菌体对原位肿瘤细胞SW480和转移肿瘤细胞SW620结合能力的测定；
·单克隆噬菌体的分离制备；
·噬菌体基因组单链DNA的提取和获得12肽序列；
·对12肽的氨基酸序列进行比对；
·对完整细胞进行ELISA测定；
·划痕试验证明12肽对肿瘤细胞运动能力的影响。
本发明的有益效果是发明中的一类12肽及其衍生物可以用作肿瘤转移诊断的标志物，并可应用于开发抑制肿瘤转移药物的前体或先导物。
图1.噬菌体展示各轮对SW620细胞特异性结合噬菌体的回收率
图2.经过四轮筛选得到的噬菌体以及原始库噬菌体与SW620和SW480细胞结合能力的比较
图3.105个噬菌体单克隆均与SW480和SW620细胞以及空白孔作ELISA检测
图4.测序后得到的表达四种多肽的噬菌体(18号，26号，27号，86号噬菌体)对SW480、SW620、MCF7、T47D、MD-MB-231和MD-MB-435的结合能力
图5.证明筛选所得12肽对肿瘤运动能力的影响的划痕试验
具体实施例方式
下面结合附图和具体实施方式
对本发明作进一步详细描述，这并不限制本发明的范围。
实施例1经过四轮筛选获得能与SW620细胞表面选择性结合的重组噬菌体
第一轮将RPMI1640培养基粉末(Gibico公司)10.4g，碳酸氢钠2.0g溶于800ml双蒸水中，加入10ml 1mol/L HEPES溶液，再用双蒸水将总体积定容到1000ml，0.22μm滤膜过滤除菌后4℃保存；在上述培养基中加入胎牛血清(FBS，购自天津血液病研究所)和青霉素-链霉素双抗，使其含量分别达到10％和1％，4℃保存；将上述培养基2ml加入到6孔板的每一个孔中，接入SW620细胞(ATCC保藏号CCL-228)，使细胞密度为106个/孔，在二氧化碳细胞培养箱中培养约48小时；弃去培养基，细胞用1×PBS洗涤(10×PBS氯化钠80.0g，氯化钾2.0g，磷酸氢二钠14.4g，磷酸二氢钠2.4g，溶于800ml去离子水中，调pH值至7.4，再用去离子水定容至1升。1×PBS将上述10×PBS用去离子水稀释10倍，使用前在121℃下高压灭菌20分钟)；加5ml封闭液(含10mg/ml BSA的PBS)室温孵育1小时；与此同时，将1×1011原始文库噬菌体(随机12肽M13噬菌体展示文库试剂盒，购自New England Biolabs公司)加入到2ml封闭液中，4℃封闭1小时；弃去封闭液，将封闭好的噬菌体加入到上述含有细胞的6孔板中，室温孵育2小时；弃去孔中噬菌体溶液，加入PBST(含0.1％Tween的PBS)洗10次，PBS洗两次，然后加入1ml洗脱液(0.2mol/L Glycine-Cl，pH2.2)，洗脱10分钟；取出上清，立即加入150μl中和液(1mol/L Tris-Cl，pH9.0)；取50μl洗脱噬菌体，用琼脂叠层法测定滴度(方法参见实施例1的末尾)；同时将噬菌体加入到对数中期的大肠杆菌ER2738中[F’lacIq Δ(lacZ)M15 proA+B+ zzf∷Tn10(TetR)/fhuA2 supE thi Δ(lac-proAB)Δ(hsdMS-mcrB)5(rk-mk-McrBC-)菌株保存在含50％甘油的LB培养基中，存于-70℃]，250转/分钟，37℃培养扩增4.5小时；扩增产物10000转/分钟离心10分钟；取上清加入1/6体积的PEG/NaCl溶液，4℃沉淀过夜；10000转/分钟离心15分钟，弃上清；用200μl PBS重悬沉淀，10000转/分钟离心5分钟，除去剩余细菌沉淀，用琼脂叠层法测定噬菌体滴度。
第二轮分别将SW480(ATCC保藏号CCL-228)和SW620细胞以106细胞/孔铺到6孔板中，培养2天；按照第一轮的方法加入第一轮扩增的噬菌体(滴度约为1×1010)，与SW480细胞结合，室温孵育1小时；取出孔中噬菌体溶液，加入到另一个SW480孔中，室温孵育1小时；取出第二个孔中噬菌体溶液，加入到SW620孔中，室温孵育2小时；洗脱，扩增等步骤与第一轮完全相同；用同样方法进行第三轮和第四轮筛选，每一轮筛选所用的噬菌体数量约为1×1010。
琼脂叠层法测定滴度的具体实施
接种大肠杆菌ER2738单菌落到5ml含有盐酸四环素的LB培养基中培养，至OD600约为0.5；取一只装有3ml上层固体LB培养基的试管，置于沸水浴中加热至完全融化，再置于45℃水浴中保温；取10μl待测噬菌体溶液，在1×PBS中进行10倍系列稀释，至大约10μl噬菌体溶液中含有100个噬菌体；取200μl大肠杆菌ER2738培养液，在培养液中加入10μl稀释好的噬菌体溶液，轻轻振荡混匀后在室温下静置5分钟；将加有噬菌体的大肠杆菌培养液加入到45℃保温的3ml固体LB培养基中，混匀后倒在37℃预保温的IPTG/X-gal平板上，待上层固体LB培养基完全凝固后，将平板倒置于37℃培养箱中培养过夜。
第二天检查平板，对平板上的蓝色噬菌斑进行计数，再相应地乘以稀释度，就得到原噬菌体溶液中每10μl所含的噬菌体pfu(噬斑形成单位)数量。
结果进行4轮富集筛选，每轮对从SW620细胞表面洗脱下来的噬菌体量与加入噬菌体的量的比值逐渐升高，实现了特异性的富集(见表1)。表1中四轮的洗脱量/加入量用图1表示。
图1中回收率＝洗脱的噬菌体量/加入的噬菌体量，Y轴的单位是×10-6。
表1筛选对SW620特异性结合的噬菌体
实施例2噬菌体对SW480和SW620结合能力的测定
SW480和SW620分别以106细胞/孔铺到6孔板中，在二氧化碳细胞培养箱中37℃培养约48小时(培养基用RPMI1640，10％FBS，1％青霉素-链霉素双抗)，弃去培养基，PBS洗涤，加入封闭液(含10mg/ml BSA的PBS)室温孵育1小时；同时封闭噬菌体，弃去封闭液，向SW480和SW620孔中各加入2ml噬菌体(滴度约为1×1011)，室温孵育2小时；弃去噬菌体，PBST(含0.1％Tween的PBS)洗涤10次，再用PBS洗涤两次，洗脱，测定各自的滴度原始文库噬菌体作对照，也同时进行上述试验；第四轮得到的噬菌体混合库与SW620结合能力较原始噬菌体库提高了100倍，第四轮得到的噬菌体混合库与SW620结合能力是其与SW480结合的100倍，即第四轮得到的噬菌体库能够特异性与SW620结合，见图2。图2中
表示从SW480细胞上洗脱下来的噬菌体数；
□表示从SW620细胞上洗脱下来的噬菌体数；
1表示对照，是用原始文库噬菌体分别加入SW620和SW480中；
2表示用第四轮扩增的噬菌体分别加入SW620和SW480中。
实施例3单克隆的噬菌体的分离制备
随机挑取105个筛选4轮后的单克隆噬菌体，加入到对数中期的大肠杆菌ER2738中，37℃，摇床(250转/分钟)培养4.5～5小时；扩增产物10000转/分钟离心10分钟，取上清加入1/6体积的PEG/NaCl溶液，4℃沉淀过夜；10000转/分钟离心15分钟，弃上清用200μlPBS重悬沉淀，10000转/分钟离心5分钟，除去剩余细菌沉淀；用琼脂叠层法测定上清液中的噬菌体滴度，加入等体积甘油，保存于-20℃。
用105个噬菌体单克隆对完整细胞SW480或SW620进行ELISA检测。在96孔板中分别加入105SW480或SW620细胞/孔，培养两天后每孔中加入200μl封闭液[5％(w/v)BSA溶于PBS]，封闭1小时；加入单克隆噬菌体1×1010，每孔50μl，孵育2小时；PBST洗涤5次，用HRP-抗M13抗体(Pharmacia Biotech公司)检测结合的噬菌体颗粒，四氨基联苯胺(TMB)为底物，显色约5分钟，加入100μl H2SO4中止反应。测定450nm的光吸收值。几乎所有噬菌体单克隆均表现出对SW620细胞的高结合性，同时对SW480细胞的结合性较低，见图3。
图3中横坐标表示不同的噬菌体单克隆，纵坐标表示平均净吸光值；
□表示SW620孔的平均净吸光值；
■表示SW480孔的平均净吸光值。
图3中每个噬菌体单克隆均与SW480和SW620细胞以及空白孔结合。洗涤后，用辣根过氧化物酶联M13抗体及其底物TMB对每个孔进行ELISA反应，并检测OD450。SW620或SW480所在孔的OD450值减去对应的空白孔OD450值，得到其净光吸值。对每个克隆进行了两组检测，图上数据为两组检测的平均值。
实施例4噬菌体基因组单链DNA的提取和12肽序列的获得
PEG沉淀的噬菌体重悬于200μl碘化钠缓冲液(10mmol/L Tris-HCl，pH8.0，1mmol/LEDTA，4mol/L NaI，室温避光贮存)中，加入500μl无水乙醇，室温孵育10分钟，10000转/分钟离心10分钟，弃上清，用70％乙醇洗沉淀，10000转/分钟离心10分钟，弃上清，重悬沉淀于30μl去离子水中。以-96gIII引物(5’-CCCTCATAGTTAGCGTAACG-3’，New EnglandBiolabs随机十二肽噬菌体展示文库产品)测序。测序结果用Prime Primier软件翻译，得到多肽序列。有4种不同测序结果，所以对应4种不同的12肽序列。它们是
Leu-Pro-Trp-Lys-Glu-Pro-Tyr-Tyr-Leu-Met-Pro-Pro(1)
Ser-Pro-Trp-Ser-Glu-Pro-Ala-Tyr-Tyr-Leu-Ala-Pro(2)
Val-Pro-Trp-Met-Glu-Pro-Ala-Tyr-Gln-Arg-Phe-Leu(3)
Ser-Val-Ser-Val-Gly-Met-Lys-Pro-Ser-Pro-Arg-Pro(4)
实施例5对12肽进行多重比对
应用多重比对软件ClustalW对实施例4得到的4个12肽序进行比对，发现12肽序列(1)(2)(3)的相似性很高，它们的高度保守的序列是Pro-Trp-X1-Glu-Pro-X2-Tyr，其中X1和X2代表任何氨基酸，该保守序列对维持12肽的结构和功能起关键作用。
实施例6对完整细胞进行ELISA测定
在96孔板中分别加入105SW480或SW620细胞/孔，培养两天；5×104MCF7，T47D，MD-MB-231或MD-MB-435细胞/孔，培养一天。每孔中加入200μl封闭液[5％(w/v)BSA溶于PBS]，封闭1小时。加入单个克隆的噬菌体1×101050μl/孔，孵育2小时。PBST洗涤5次后用HRP-抗M13抗体(Pharmacia Biotech公司)检测结合的噬菌体颗粒，四氨基联苯胺(TMB)为底物，显色约5分钟，加入100μl H2SO4中止反应。测定450nm的光吸收值。替换对照为对各细胞系均没有特异性的原始文库噬菌体。测序得到的四种多肽对多种高转移能力的肿瘤细胞有高结合，而对多种低转移/不转移的肿瘤细胞结合很弱。进一步证实本发明的12肽序列对转移肿瘤细胞的特异结合具有广谱性，见图4。
图4中■表示4种多肽对SW480的结合
表示4种多肽对SW620的结合
表示4种多肽对MD-MB-435的结合
表示4种多肽对MD-MB-231的结合
■表示4种多肽对T47D的结合
■表示4种多肽对MCF7的结合
实施例7划痕试验证明12肽对肿瘤细胞运动能力的影响
在24孔板每个孔的底面作标记(如用针划十字，交叉点和十字可用于后续试验中的定位比较，或者用记号笔作标记定位)。在24孔板的每个孔中分别加入3×105SW620细胞，培养2-3天至形成的单细胞层覆盖90-100％每个孔的底面积。用黄色吸头尖在单层细胞上过定位点划直线划痕。用培养基轻轻洗去划掉的细胞。每孔加入107特异结合高转移肿瘤细胞的噬菌体，这种噬菌体表达的12肽序列为Leu-Pro-Trp-Lys-Glu-Pro-Tyr-Tyr-Leu-Met-Pro-Pro。加107对转移肿瘤细胞没有特异性结合的原始库噬菌体作为对照。用无血清培养基培养，并在0、5和24小时拍照(图像放大倍数为40)。以24孔板底的标记将同一个孔不同时问点的图像重叠，观察肿瘤细胞的运动能力，证明这种12肽在体外可以抑制高转移肿瘤细胞的运动能力，见图5。图5中上面一行表示向SW620细胞中加入原始文库噬菌体，下面一行图像表示向SW620中加入了特异结合转移肿瘤细胞的噬菌体，每排下面的时间表示划痕后不同的拍照时间。
SEQUENCE LISTING
<110>南开大学
<120>与肿瘤转移细胞特异结合的多肽的筛选及鉴定
<130>2005916
<160>5
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>12
<212>PRT
<213>噬菌体M13
<220>
<221>PEPTIDE
<222>(1)..(12)
<223>
<400>1
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<211>12
<212>PRT
<213>噬菌体M13
<220>
<221>PEPTIDE
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<400>2
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<211>12
<212>PRT
<213>噬菌体M13
<220>
<221>PEPTIDE
<222>(1)..(12)
<223>
<400>3
Val Pro Trp Met Glu Pro Ala Trp Gln Arg Phe Leu
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<211>12
<212>PRT
<213>噬菌体M13
<220>
<221>PEPTIDE
<222>(1)..(12)
<223>
<400>4
Ser Val Ser Val Gly Met Lys Pro Ser Pro Arg Pro
1 5 10
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<211>7
<212>PRT
<213>噬菌体M13
<220>
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<223>
<220>
<221>MISC_FEATURE
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<223>X
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<223>
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(6)..(6)
<223>X
<220>
<221>PEPTIDE
<222>(7)..(7)
<223>
<400>5
Pro Trp Xaa Glu Pro Xaa Tyr
1 权利要求
1.与肿瘤转移细胞特异性结合的多肽，其特征在于，其氨基酸序列如下
Leu-Pro-Trp-Lys-Glu-Pro-Tyr-Tyr-Leu-Met-Pro-Pro(1)
Ser-Pro-Trp-Ser-Glu-Pro-Ala-Tyr-Tyr-Leu-Ala-Pro(2)
Val-Pro-Trp-Met-Glu-Pro-Ala-Tyr-Gln-Arg-Phe-Leu(3)
Ser-Val-Ser-Val-Gly-Met-Lys-Pro-Ser-Pro-Arg-Pro(4)
其中(1)(2)(3)三个12肽中，Pro-Trp-X1-Glu-Pro-X2-Tyr为保守序列，X1和X2分别代表任意一个氨基酸。
2.根据权利要求1所述的与肿瘤转移细胞特异性结合的多肽，其特征在于，保守序列保持不变而在其它位置出现氨基酸替换、缺失或添加，且能与肿瘤转移细胞系特异性结合的寡肽序列。
3.与肿瘤转移细胞特异性结合的多肽的筛选和鉴定，其特征在于，包括如下步骤
·经过对正常培养的原位肿瘤细胞和肿瘤转移细胞系进行四轮差异筛选，获得能与转移肿瘤细胞SW620选择性结合的重组噬菌体；
·噬菌体对原位肿瘤细胞SW480和转移肿瘤细胞SW620结合能力的测定；
·单克隆噬菌体的分离制备；
·噬菌体基因组单链DNA的提取和获得寡肽序列；
·对12肽的氨基酸序列进行比对；
·对完整细胞进行ELISA测定；
·划痕试验证明12肽对肿瘤细胞运动能力的影响。
4.与肿瘤转移细胞特异性结合的多肽在检测肿瘤转移和开发抑制肿瘤转移药物方面的应用。
全文摘要
本发明涉及与肿瘤转移细胞表面抗原特异性结合的4条12肽序列，其中3条能与肿瘤转移细胞特异性结合的12肽具有下列保守序列Pro－Trp－X1－Glu－Pro－X2－Tyr，X1和X2分别代表任意一个氨基酸。该12肽具有与肿瘤转移细胞特异性结合的特性，因此，这类12肽及其衍生物可以用作肿瘤转移诊断的标志物，并可应用于开发抑制肿瘤转移药物的前体或先导物。
文档编号G01N33/68GK1763082SQ20051001523
公开日2006年4月26日 申请日期2005年9月27日 优先权日2005年9月27日
发明者曹又佳, 李鑫, 张宏恺, 张翠竹 申请人:南开大学