专利名称：对被检抗原内的活菌特异性标记化来进行检测的检测方法及检测装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及检测溶液中的抗原浓度和数量的检测方法及检测装置，特别是涉及可以通过对被测抗原内的活菌进行特异性标记化而实现检查的迅速化的检测方法及检测装置。
背景技术：
近年来，沙门氏菌、葡萄球菌、肉毒杆菌、病原性大肠杆菌0-157等微生物引起的食物中毒的危害成为问题，相关企业一方面进行关于对这些微生物的预防和卫生的讲习会和普及教育活动等，另一方面通过高额的设备投资对事故的扩散进行预防。
微生物的检测一般在培养后进行种类的鉴定和定量。即，伴有预培养→增菌培养→分离培养的培养操作，从该培养操作开始到得到检查结果需要几天左右的时间，而且需要专业的测定技术人员。该长时间的测定在必须对要求迅速性的生鲜食品等食品的微生物进行检查时非常成问题。
因此，提出了简易且迅速地检测食物中毒病原菌的各种试剂和装置。例如，已知免疫层析法，即应用免疫化学反应，使用与特定的菌(抗原)特异性结合的抗体使该特定的菌凝集，对抗原浓度进行测定和分析。以下，以菌体表面具有固有的抗原决定基团的病原性大肠杆菌0-157(在菌体表面表达与称作0-157的抗体特异性结合的抗原决定基团的具有病原性的大肠杆菌)作为抗原的一个例子，对于免疫层析法进行详细说明。
免疫层析法中，有例如表面等离子体激元共振法等抗体上不结合酶等标记物而利用抗原抗体反应引起的物理量等的变化来测定抗原的量的非标记免疫层析法，以及放射免疫测定法等通过使用结合了酶等标记物的抗体对标记物的量进行测定来测定抗原的量的标记免疫层析法。在这里，对于后一种标记免疫层析法、特别是因测定操作比较容易而成为目前的主流的“夹心法(夹心ELISA法)”进行详细说明。
图12为以往的夹心法的主要步骤的模式图。(a)为抗体(一级抗体)的固定化步骤，(b)为目标菌(抗原)的捕获步骤，(c)为采用酶标抗体的染色步骤，(d)为抗体(二级抗体)的固定化步骤，(e)为标记化菌体的洗脱步骤，(f)为洗脱了的标记化菌体的检测步骤。图12(a)～(f)中，记载有固定化层表面100、一级抗体101、目标菌102、二级抗体103、标记物104、光源105、检测器106。
图12中，首先，在容易发生非特异性吸附的反应容器中注入含有与病原性大肠杆菌0-157(目标菌102)特异性结合的一级抗体101的溶液，使一级抗体101非特异性吸附在反应容器的固定化层表面100，进行固定化(图12(a))。接着，在反应容器中注入含有目标菌102的试样溶液，使目标菌102通过抗原抗体反应与固定化于反应容器内的一级抗体101特异性结合(图12(b))。
接着，在反应容器中注入含有通过标记物104标记化了的二级抗体103的溶液，使由二级抗体103和标记物104构成的酶标抗体与反应容器内的目标菌102通过抗原抗体反应特异性结合(图12(c))。由此，可以将与目标菌102成正比的量的酶标抗体固定化在反应容器上(图12(d))。此外，在反应容器中添加含有显色底物的底物溶液，通过酶反应使酶标抗体显色。
最后，通过例如氢氧化钠水溶液等溶菌抽提液将结合了酶标抗体的目标菌102洗脱后(图12(e))，在相对于光源105配置的检测器106中，检测染料特异性吸收的波长的光，测定抗原浓度(图12(f))。
如上所述，若采用夹心法，与需要培养操作的检查不同，即使没有繁复的操作和专业的知识，也可以迅速地进行适当的微生物检测。
另一方面，使用比采用夹心法的测定操作更容易处理的检查试剂盒也可以迅速地进行微生物检测。例如，提出有通过使用能够展开含有可与碱性磷酸酶特异性结合并显色的显色底物成分的底物液的检测试剂盒而仅对大肠杆菌的活菌进行迅速检测的技术(参考专利文献1)。
更具体地，专利文献1所述的发明为检测方法及检测试剂盒，所述检测方法至少具有以下步骤在吸水性基材的表面上的任意区域形成有固定了可与大肠杆菌特异性结合的特异性结合成分的固定相的检测工具上使被检液展开的步骤；在将被检液展开后的吸水性基材上，使含有可与碱性磷酸酶特异性结合并显色的显色底物成分的底物液展开的步骤。
若采用该检测方法及检测试剂盒，则通过适当调节吸水性基材的吸水性，可以将使被检液和底物液展开的速度调至最适，而且可以实现检查的迅速化。此外，被检液中存在大肠杆菌的活菌的情况下，对于通过特异性结合成分捕获于固定相上的活菌所具有的碱性磷酸酶，显色底物成分特异性地结合并显色，所以甚至可以检测出被检液中是否有大肠杆菌的活菌，这是其优点。
专利文献1日本专利特开2002-165599(段落编号 ～ )发明的揭示然而，上述夹心法和专利文献1所记载的检测方法存在如下的问题。
首先，夹心法中，到抗原检出为止需要2次抗原抗体反应(参看图12(b)、(c))，各次抗原抗体反应都需要一定时间，所以存在无法实现检查的进一步迅速化的问题。此外，夹心法中，一般使用与存在于大肠杆菌外膜的脂多糖特异性结合的抗体，所以无法区别大肠杆菌是活菌，还是死菌或菌片断，存在于食品等的检查阶段将只含死菌或菌片断而不引起食物中毒的合格品排除的问题。
此外，专利文献1所记载的检测方法中，如上所述，可以实现检查的迅速化和大肠杆菌活菌的检出，但仅处理0.01ml～0.2ml的极少量的试样(参考专利文献1说明书段落编号 )，存在无法保证检查的可靠性的问题。即，作为检查对象的试样量少的情况下，不仅大肠杆菌的含有几率低，而且大肠杆菌中活菌的含有几率也低，因此必然检测精度和检测灵敏度会降低。
特别是在食品工场即使发觉食物中毒的情况下，也已经通过流动途径被贩卖给零售商，消费者食用后才进行应对的情况较多，食物中毒扩散的危险性高，希望检查的进一步迅速化。
鉴于以上的问题，本发明的目的在于提供可以在短时间内迅速检测出作为抗原的微生物中的活菌、而且也能保证检查的可靠性的检测方法及检测装置。
为了解决以上的课题，本发明的特征在于，生成将大肠杆菌等被检抗原与被该被检抗原内的活菌所酶解的标记物作用而得到的标记化抗原后，在固定化可与被检抗原特异性结合的特异性结合抗体而形成的固定相上，捕获该标记化抗原。
更具体地，本发明提供以下的发明。
(1)检测方法，它是通过被检抗原与被前述被检抗原内的活菌所酶解的标记物的作用对前述被检抗原内的活菌进行特异性标记化而进行检测的检测方法，其特征在于，使前述标记物与前述被检抗原作用而生成光学上可检测的标记化抗原，在固定化可与前述被检抗原特异性结合的特异性结合抗体而形成的固定相上，捕获前述标记化抗原。
根据本发明，由于是通过大肠杆菌等被检抗原(包括活菌和死菌)与被该被检抗原中的活菌所酶解的标记物的作用来检测活菌的检测方法，使标记物与被检抗原作用而生成通过荧光反应等在光学上可检测的标记化抗原，在通过抗原抗体反应固定化可与被检抗原特异性结合的特异性结合抗体而形成的固定相上，捕获该标记化抗原，所以捕获对象为光学上可检测的标记化抗原(活菌)和未被标记化而光学上无法检测的死菌(菌片断)。
因此，不需要以往的夹心法中所必需的二级抗体，因而以往需要2次的抗原抗体反应仅1次即可，进而可以实现检查的迅速化。此外，捕获了的被检抗原中，光学上可检测的抗原只有作为标记化抗原的活菌，所以可以区别活菌和死菌进行检测，能够准确地检测出引起食物中毒的活菌。
另外，与以往的专利文献1所述的检测方法所处理的试样量(0.01ml～0.2ml)相比，本发明的检测方法所处理的试样量为数十ml～数百ml，所以可以防止样本抽取所引起的被检抗原的含有几率的低下，进而可以防止检测精度和检测灵敏度的下降，保证检查的可靠性。
(2)检测方法，其特征在于，在前述固定相上，对通过增殖培养液增殖了的前述标记化抗原进行捕获。
根据本发明，在上述固定相上对通过增殖培养液增殖了的前述标记化抗原进行捕获，所以与添加增殖培养液前相比，可以提高标记化抗原浓度，因而标记化抗原的捕获几率提高，进而可以提高检测精度和检测灵敏度。
(3)检测方法，其特征在于，使含有前述标记化抗原的试样溶液循环多次的同时，在前述固定相上捕获被循环的标记化抗原。
根据本发明，使含有上述标记化抗原的试样溶液循环多次的同时，在上述固定相上捕获被循环的标记化抗原，所以可以使试样溶液多次与固定化了一级抗原的固定相进行接触，标记化抗原的捕获几率提高，可以提高检测精度和检测灵敏度。
(4)检测方法，其特征在于，在固定化分别对应多种前述被检抗原可特异性结合的特异性结合抗体而形成的多种固定相上，捕获前述被检抗原。
根据本发明，在固定化分别对应多种上述被检抗原可特异性结合的特异性结合抗体而形成的多种固定相上，在一系列的检查流程中一次性捕获多种被检抗原，所以可以提高检查的迅速化和高效化。
(5)检测装置，它是具有可设置固定化可与被检抗原特异性结合的特异性结合抗体而形成的固定相的柱的检测装置，其特征在于，在设置了前述固定相的柱中，捕获前述被检抗原被标记化而得到的标记化抗原。
根据本发明，由于是具有可设置固定化可与大肠杆菌等被检抗原(包括活菌和死菌)特异性结合的特异性结合抗体而形成的固定相的柱(生物柱(biocolumn))的检测装置，在设置了上述固定相的柱中，捕获被检抗原被只与活菌作用的标记物标记化而得到的标记化抗原，所以不仅到标记化抗原捕获为止只需1次抗原抗体反应即可，可以实现检查的迅速化，而且可以准确地检测出引起食物中毒的活菌。此外，因为可以同时处理大量的试样，所以可以防止样本抽取所引起的被检抗原的含有几率的低下，进而可以防止检测精度和检测灵敏度的下降，保证检查的可靠性。
(6)检测装置，其特征在于，前述检测装置还具备搅拌液体的搅拌装置，前述标记化抗原在前述搅拌装置中被标记化。
根据本发明，上述检测装置还具备对液体(试样溶液)进行机械搅拌的搅拌装置，上述标记化抗原在该搅拌装置中被标记化，所以可以促进被检抗原的标记化，进而高效地生成标记化抗原。
(7)检测装置，其特征在于，前述柱可以多次使用。
根据本发明，上述柱可以多次使用，所以可以连续地、高效地进行多次微生物检查。
(8)检测装置，它是具有多根可设置固定化可与被检抗原特异性结合的特异性结合抗体而形成的固定相的柱的检测装置，其特征在于，在设置了前述固定相的多根柱中，捕获前述被检抗原被标记化而得到的标记化抗原。
根据本发明，由于是具有多根(多种)可设置固定化可与被检抗原特异性结合的特异性结合抗体而形成的固定相的柱的检测装置，在设置了该固定相的多根柱中，捕获前述被检抗原被标记化而得到的标记化抗原，所以可以实现检查的迅速化和高效化。
(9)生物柱，其中，设置了固定化可与被检抗原特异性结合的特异性结合抗体而形成的固定相。
根据本发明，通过提供设置了固定化可与被检抗原特异性结合的特异性结合抗体而形成的固定相的生物柱，可以进一步实现检查的迅速化和可靠化。通过使用例如冷冻干燥法等保存方法，可以长时间以稳定化状态保存该生物柱。
(10)搅拌方法，在设置了固定化可与被检抗原特异性结合的特异性结合抗体而形成的固定相的生物柱中，利用前述生物柱内的压力变化，搅拌前述固定相。
根据本发明，若使生物柱内产生剧烈的压力变化，增加流过生物柱内的检测水样的流速，则可以在生物柱内搅拌固定相，因此可以使固定相与试样溶液(检测水样)充分地接触，能够保持高检测精度和检测灵敏度。
如上所述，本发明使以往需要2次的抗原抗体反应减至1次，所以可以实现检查的迅速化，而且将光学上可检测的抗原作为标记化抗原(活菌)，所以能够判别活菌和死菌，还因为可以处理大量的试样，因此可以保证检查的可靠性实施发明的最佳方式以下，基于附图，对用于实施本发明的最佳方式进行说明。
图1为本发明的实施方式的检测装置1的外观图。
图1中，本发明的实施方式的检测装置1在内部具有泵和阀的箱状操作箱的侧面具备设置了捕获目标菌的固定相的生物柱2。此外，在该生物柱2的旁边，设置有装入了洗脱捕获后的目标菌的溶菌液的M-Cell3，在检测装置1的上表面设置有例如瓶B1～B5的5个瓶(数量不限)。
在这里，图2为本发明的实施方式的检测装置1所设置的生物柱2的放大图。图2中，该生物柱2通过在生物柱用玻璃管的内部填充可经抗原抗体反应捕获抗原的玻璃珠而制成。
更具体地，首先用氢氧化钠水溶液和盐酸对玻璃珠进行预处理后，将其干燥一晚。然后，对该玻璃珠进行烧结处理，采用硅烷化试剂的硅烷化处理后，进行漂洗，在室温下使其干燥，从而制成硅烷化玻璃珠。
接着，在生物柱用玻璃管中填充约0.5克该硅烷化玻璃珠。然后，在含有作为偶联剂的戊二醛的戊二醛溶液中浸渍数十分钟，用磷酸缓冲液清洗后，通过非特异性吸附进行一级抗体固定化处理。该一级抗体固定化处理中，通过适当清洗生物柱用玻璃管，除去未反应的一级抗体。
接着，一级抗体固定化处理结束后，注入含有作为封闭剂的牛白蛋白血清的封闭溶液，使封闭剂非特异性吸附到残存于硅烷化玻璃珠表面的非特异性吸附面上，防止以后发生其它有机物质等的非特异性吸附。
最后，用磷酸缓冲液等将生物柱用玻璃管内清洗多次，除去未反应的封闭剂，从而制成生物柱2。通过使用例如冷冻干燥法等保存方法，可以长时间以稳定化状态保存该生物柱2。
本发明的实施方式中对使用玻璃珠的生物柱2的制作进行了说明，但本发明并不局限于此，例如为了确立硅烷化处理和偶联处理等的各种条件，可以使用比较容易处理的平面类玻璃。此外，本发明的实施方式中使用球状的玻璃珠，但玻璃珠是固定化抗体的载体(固定化抗体的母体)之一，只要是具有可以固定化抗体的表面积、在将其填充到柱中的状态下可以充分使抗体与检测水样接触的形态的载体，可以是任意的形状。制作步骤与使用上述玻璃珠的生物柱2的制作步骤大致相同，所以将其说明略去。此外，本发明中，只要可以在固定化层表面固定一级抗体，可以使用任意的珠的材质、硅烷化处理条件、一级抗体固定化方法。
图3为使用图1所示的检测装置1进行微生物检查时的流路系统图。此外，图4为图3所示的流路系统图中的检查步骤的简略流程图。
图3中，在瓶B1中注入有含被检抗原的检测水样(例如100ml)，所述被检抗原中混有添加作为染色试剂的6-羧基荧光素二乙酸酯和稀释(CFDA稀释)液(含有标记物的溶液)并经水解而被标记化了的活菌(标记化抗原)和未进行水解的死菌，瓶B5和瓶B6中注入有作为柱清洗液的磷酸缓冲液，M-Cell3中注入有洗脱生物柱2中捕获的目标菌的碱性水溶液。此外，本实施方式中所用的CFDA可以对活菌染色，而且可以用能以荧光显色等检测的药剂代替它们。
图4中，首先进行固定化步骤(步骤S1)。更具体地，在图3中，通过使泵P1工作，注入到瓶B1中的添加CFDA稀释液的检测水样以瓶B1→阀V1→阀V2→泵P1→阀V3→生物柱2→阀4→阀5→阀6→瓶B2的顺序流动。所需时间为大约15分钟。然后，通过切换阀V1，贮留在瓶B2的检测水样以瓶B2→阀V1→阀V2→泵P1→阀V3→生物柱2→阀4→阀5→阀6→瓶B3的顺序流动。所需时间为大约15分钟。通过以上步骤S1的固定化步骤，使检测水样中的被检抗原经抗原抗体反应与固定化于生物柱2(玻璃珠)的一级抗体特异性结合。可以在瓶B1中预先添加增殖培养液，捕获通过该增殖培养液增殖了的标记化抗原。由此，可以提高标记化抗原浓度，提高标记化抗原的捕获几率。
在这里，为了维持高检测精度和检测灵敏度，必须使固定化特异性结合抗体而形成的固定相(玻璃珠)与循环的试样溶液(检测水样)充分接触。因此，本实施方式中，使用电磁式套筒节流阀PV(参看图3)，有效地搅拌生物柱2内的玻璃珠(固定相)。更具体地，使用图5进行说明。图5为有效地搅拌固定相的状态的说明图。
图5中，设于生物柱2与阀3之间的套筒节流阀PV从开状态(ON状态)变为关状态(OFF状态)时(图5左图→图5中图)，随着检测水样停止从套筒节流阀PV向生物柱2的流动，套筒节流阀PV的阀V3侧的管道压力增加。然后，经过规定时间后，若套筒节流阀PV从关状态(OFF状态)变为开状态(ON状态)时(图5中图→图5右图)，则检测水样再次从套筒节流阀PV向生物柱2流动。
这时，由于套筒节流阀PV在规定时间内处于关状态(OFF状态)，生物柱2内产生剧烈的压力变化，使流过生物柱2内的检测水样的流速增加。其结果是，生物柱2内玻璃珠(固定相)被搅拌(参看图5右图)。
如上所述，本实施方式中，使检测水样在生物柱2内循环时，将套筒节流阀PV以规定的时间进行开关，形成定期地、且有效地搅拌固定相(玻璃珠)的结构。由此可以使固定相(玻璃珠)与检测水样充分接触。
本实施方式中使用了电磁式的套筒节流阀PV，但本发明并不局限于此，可以使用例如手动式或电动式的套筒节流阀。此外，只要是起到适度搅拌生物柱2内的固定相的效果的装置，可以任意使用，并不特定于套筒节流阀。
接着，进行清洗步骤(步骤S2)。具体来说，图3中，通过切换阀V2，贮留于瓶B5的磷酸缓冲液以瓶B5→阀V2→泵P1→阀V3→生物柱2→阀V4→阀V5→瓶B4的顺序流动。然后，关闭泵P1的开关。所需时间为大约15分钟。通过以上步骤S2的清洗步骤，使磷酸缓冲液流入生物柱2，洗净未反应的一级抗体等，从而将被检抗原凝缩化。
接着，进行洗脱步骤(步骤S3)。具体来说，图3中，通过切换阀V3和阀V4，使装入了洗脱被检抗原的溶菌液的M-Cell3和泵P2工作，从而将在生物柱2中被捕获了的被检抗原洗脱。然后，在具备流通池(图3中的右下)的荧光分光光度计中，对被检抗原中被标记化了的活菌(标记化抗原)进行光学检测(色谱图测定)。通过以上步骤S3的洗脱步骤，进行仅对引起食物中毒的活菌的检测。然后，经以上步骤S1～步骤S3的一系列步骤，微生物检查告一段落。
在瓶B4和瓶B6中注入数次实验量的药液连续进行微生物检查的情况下，如图4所示，追加进行清洗步骤(步骤S4)。具体来说，在图3中，使泵P2工作，切换阀V4和阀V7，利用贮留于瓶B6的磷酸缓冲液对生物柱2进行清洗。
由上述说明可知，若采用图4所示的步骤S1～步骤S3(步骤S4)的一系列检查步骤，则可以仅对作为抗原的微生物中的活菌进行检测。此外，通过本发明的实施方式的检测装置1可以检查的检测水样量与检查试剂盒等所用的检测水样量(约0.01ml～0.2ml)不同，为数十ml～数百ml，所以可以防止伴随试样的样本化而产生的大肠杆菌的含有几率的低下，进而可以提高检测精度和检测灵敏度。清洗、洗脱、清洗的各步骤中所用的试剂及其方法在不超出本发明的主旨的范围内可以进行变更。
另外，若采用图4所示的步骤S1～步骤S3(步骤S4)的一系列检查步骤，则可以在比以往的夹心法更短的时间内进行微生物检查。对于使用检测装置1的检查的迅速化，以下使用图6的模式图进行详细说明。
图6为本发明的实施方式的检测方法的主要步骤的模式图。(a)为抗体(一级抗体)的固定化步骤，(b)为含有被检抗原的试样液与荧光试剂的搅拌步骤，(c)为含有标记化抗原的捕获步骤，(d)为被检抗原的固定化步骤，(e)为被检抗原的洗脱步骤，(f)为仅检测洗脱了的被检抗原中的标记化抗原的检测步骤。图6(a)～(f)中，记载有固定化层表面10、一级抗体11、目标菌(活菌)12、标记物13、标记化抗原14、光源15、检测器16。
图6中，首先使一级抗体11非特异性吸附于生物柱用玻璃管中所填充的玻璃珠的固定化层表面10上，进行固定化(图6(a))。本步骤的具体细节如生物柱2的制作步骤中所述。
接着，通过在含有被检抗原的试样液中添加荧光试剂，使作为目标菌的活菌12发光(图6(b))。更具体地，在试样液中添加CFDA稀释液后，被检抗原中的活菌吸收作为细胞内pH指示剂的CFDA(标记物13)，通过水解而发出荧光。即，CFDA具有作为活菌染色剂的功能。在试样液中添加CFDA稀释液后，可以通过搅拌装置的搅拌，促进活菌引起的水解。由此，可以在更短时间内、且可靠地使活菌吸收CFDA，进而实现检查的迅速化。
接着，使存在被检抗原(包括标记化抗原14)的试样液与生物柱2的固定化层表面10接触，通过与一级抗体11的抗原抗体反应捕获被检抗原(图6(c))。进行被检抗原的捕获后，通过使磷酸缓冲液等洗脱溶液流入生物柱2，去除杂质和未反应的一级抗体等，进行被检抗原的凝缩化(浓缩化)和被检抗原的固定化(图6(d))。图6(b)所示的搅拌步骤、图6(c)所示的捕获步骤和图6(d)所示的固定化步骤较好是重复进行多次。由此，未反应状态的被检抗原的数量减少，进而实现检测精度和检测灵敏度的提高。
接着，通过碱性水溶液对被一级抗体11固定化的含有标记化抗原14的被检抗原进行溶菌和洗脱(图6(e))。这时，通过减少循环路径内容量和流通池内容量，使溶菌和洗脱所需的碱性水溶液的量减少，可以提高溶菌抽提液中的菌浓度，进而提高检测灵敏度。本发明的实施方式中，使用高浓度碱性水溶液，例如通过同时使用酸性缓冲液和表面活性剂等，可以更迅速且可靠地对被检抗原进行溶菌和洗脱。
最后，利用与光源15对向配置的检测器16对标记化抗原14进行光学检测(图6(f))。更具体地，含有标记物13的标记化抗原14通过光源15发出的紫外线激发光而发出荧光，在具备聚光透镜的检测器16接收该荧光，从而得到电信号(色谱信号)。通过对该电信号进行测定和分析，可以对标记化抗原14(目标菌12)进行光学检测。本发明的实施方式中使用了荧光分光光度计，也可以使用例如粒子计数器等检测器等任意的检测方式。
如上所述，采用图6(a)～图6(f)所示的一系列步骤，可以在比以往的夹心法更短的时间内进行微生物检查。即，以往的夹心法中，到被检抗原的检出为止需要2次抗原抗体反应(参看图12(b)、(c))，若采用本发明，仅标记化抗原14与一级抗体11的1次抗原抗体反应即可(参看图6(c))，可以减少相应的检测时间，进而实现检查的迅速化。
图7为本发明的另一实施方式的检测装置的外观图。主要特征为设有2根可捕获特定目标菌的生物柱65、66。图7中设有2根生物柱65、66，但本发明并不局限于此，例如可以设置3根以上的生物柱。通过设置多根生物柱，可以同时检测多种目标菌。
图7中，本发明的另一实施方式的检测装置中，各设备、泵、瓶等设置在35±1℃的恒温槽(图中的方框)的内部，各设备和泵通过流路控制用程控装置69被控制在最适。恒温槽的内部设有含目标菌的试验试样供给槽(试样进样器)61、搅拌试样的搅拌装置(磁搅拌器)62、去除杂质的过滤器63、适当切换流路的流路切换阀64、填充了在表面固定化有目标菌抗体的玻璃微粒的生物柱65和66、使试样流动的循环泵67、对目标菌进行光学检测的高灵敏度荧光检测器68，还设有装入了清洗液的瓶B11、装入了固定化液的瓶B12和装入了捕获的染色菌的溶菌抽提液的瓶B13。以下，对使用图7所示的检测装置的检查步骤进行简要说明。
首先，通过规定方法将规定量的试样均质化(stomaching)，将试验溶液(50～100ml)加入到试验试样供给槽61中。然后，一边用搅拌装置62进行搅拌，一边添加作为荧光染色试剂的CFDA，对活菌进行染色。搅拌约10分钟后，通过过滤器63除去杂质，同时导入试样流路(生物柱65)。将流路切换阀64切换至过滤器反向清洗系统，将过滤器63洗净。
接着，将通过了过滤单元(过滤器63)的试验溶液通过生物柱65、66，在整个流路清洗系统流路中循环，在生物柱65、66内通过数次。然后，通过将从瓶B13少量添加到生物柱65、66内的再循环流路系统中的溶菌抽提液进行多次再循环，将被固定化抗体捕获的染色菌体(标记化抗原)以高浓度洗脱。洗脱结束后的试验溶液通过生物柱65、66下部的切换阀64导向高灵敏度荧光检测器68，形成电信号，绘成色谱图。
更具体地，洗脱结束后的试验溶液被导入高灵敏度荧光检测器68的流通池，该试样溶液中的染色菌体通过从光源发出的紫外线激发光而发出荧光。然后，该荧光通过聚光透镜接收，将光信号转变为电信号，从而绘成色谱图。
最后，溶菌和洗脱结束后，填充了固定化有目标菌抗体的玻璃微粒的生物柱65、66通过瓶B11内的清洗液进行清洗，进行更新。
如上所述，采用图7所示的检测装置，通过设置2根生物柱65、66，可以在1次检查的流程中同时捕获2种目标菌，进而实现检查的高效化和迅速化。
通过将不同抗体的多根生物柱串联设置，可以同时检测多种目标菌。此外，通过将同一抗体的多根生物柱并联设置，可以同时检测多份特定目标菌的检测水样。另外，也可以同时使用这两种方式。
本发明的实施方式的检测方法中，基本上没有培养步骤也足以检测目标菌。但是，根据需要，通过培养目标菌，可以获得更可靠的检查结果。培养步骤的实施可以如下进行例如，通过在检测装置上预先设置加热器在固定化步骤前进行培养，或者使包括了检查步骤的检测装置整体达到一定温度来进行培养。
实施例1
图8为在图3所示的流路系统中进行生物柱2的性能实验时的测定结果的图。更具体地，表示了相对于大肠杆菌(E.coli)的注入量(CFU/100ml)的CFDA荧光强度。由图8所示的表可知，大肠杆菌注入量与溶菌抽提液中的CFDA荧光强度之间发现显著的相关。即，由将图8所示的表的各个数据在2维空间内作图得到的图9可知，随着大肠杆菌的注入量增加，CFDA荧光强度也增加，适合于目标菌的检测。
在这里，图8所示的表中，对于大肠杆菌的注入量为最小浓度10CFU/ml的检测水样，也获得了较强的荧光图谱(平均1.2050)，所以认为对于约5CFU/ml的检测水样，也适合于目标菌的检测。此外，通过减少循环路径内的容量和微流通池的容量，使溶菌抽提液的需要量减少，可以提高溶菌抽提液的菌浓度，认为对于约1～5CFU/ml的检测水样，也适合于目标菌的检测。
图10为在图3所示的流路系统中进行生物柱2的性能实验时的测定结果的表。特别是，图10(a)表示对于实施了染色处理的死菌的CFDA荧光强度。由图10(a)可知，即使注入被检抗原中的死菌，溶菌抽提液中的CFDA荧光强度也非常微弱。即，实际的检测水样中，即使混有不会直接引起食物中毒的死菌，也可以不受干扰地、高精度地评价活菌，进而可以解决排除仅含死菌的合格品的问题。
此外，图10(b)表示对于除大肠杆菌(E.coli)以外的多种菌(大肠菌群弗氏柠檬酸杆菌(C.freundii)，肠道细菌科菌粘质沙雷氏菌(S.marcescens))的注入量(CFU/100ml)的CFDA荧光强度。由图10的表可知，对于除大肠杆菌以外的菌，溶菌抽提液的CFDA荧光强度弱。即，与死菌同样地，即使在试样溶液中共存有目标菌以外的菌的情况下，也可以将其影响降到较低。
图11为在图3所示的流路系统中进行反复使用后的生物柱2的性能实验时的测定结果的表。更具体地，表示生物柱2的相对于累计使用次数(次)的CFDA荧光强度。由图11可知，若累计使用生物柱2两次，则第二次使用时，溶菌洗脱液中的CFDA荧光强度减少约98％。认为这是由于目标菌的洗脱中使用具有溶菌作用的高浓度的碱，这时作为蛋白质的抗体与菌一起受到破坏的缘故。因此，例如通过使用对抗体的破坏少的溶菌抽提液，生物柱2可以使用多次。
接着，对改变试验材料的种类和量后进行的评价试验进行以下的说明。
首先，将100ml通过MPN法等推定了菌数的菌液移入试验装置的试样供给瓶内，加入1ml含有CFDA的活菌染色液，使所有液体以每分钟10ml的流速在生物柱2中循环2次后，将水样排出。接着，将所有的试样液用于生物柱后，通过适量的生物柱清洗液，对生物柱的内部进行清洗后，切换流路，将残留在生物柱内部的生物柱清洗液全部排出。
然后，使用总量10ml的溶菌抽提液，对在上述步骤中被活菌染色的且被生物柱捕获的目标菌进行溶菌抽提，同时导入荧光分光光度计的流通池，进行荧光强度测定。该测定结束后，用灭菌磷酸缓冲稀释水溶液清洗整个流路系统。
以上为评价试验的概要，所需时间为约1小时。在所述评价试验中知道，如果试样中存在约30CFU以上的目标活菌，则具有足够的检测能力。此外，还知道除大肠杆菌以外的菌(大肠菌群和肠道细菌)的影响、死菌的影响极其轻微，实用上没有问题。因此，本发明中例举了大肠杆菌作为对象，但只要可以通过抗原抗体反应捕获，可以是任意的，例如也可以将霉类作为对象。
产业上利用的可能性本发明的检测方法和检测装置通过检测使被检抗原和被该被检抗原内的活菌所酶解的标记物作用而得到的标记化抗原，可以将试样溶液的活菌作为目标菌，而且能够保证检查的迅速性和可靠性，非常有用。
附图的简单说明图1为本发明的实施方式的检测装置的外观图。
图2为本发明的实施方式的检测装置中所设置的生物柱的放大图。
图3为使用图1所示的检测装置进行微生物检查时的流路系统图。
图4为图3所示的流路系统图中的检查步骤的简略流程图。
图5为有效地搅拌固定相的状态的说明图。
图6为本发明的实施方式的检测方法的主要步骤的模式图。
图7为本发明的另一实施方式的检测装置的外观图。
图8为在图3所示的流路系统中进行生物柱的性能实验时的测定结果的图。
图9为将图8所示的表的各个数据在2维空间内作图得到的图。
图10为在图3所示的流路系统中进行生物柱的性能实验时的测定结果的表。
图11为在图3所示的流路系统中进行反复使用后的生物柱的性能实验时的测定结果的表。
图12为以往的夹心法的主要步骤的示意图。
符号的说明1 检测装置2 生物柱3 M-Cell10 固定化层表面11 一级抗体12 目标菌(活菌)13 标记物14 标记化抗原15 光源16 检测器
权利要求
1.检测方法，它是通过被检抗原与被前述被检抗原内的活菌所酶解的标记物的作用、对前述被检抗原内的活菌进行特异性标记化而进行检测的检测方法，其特征在于，使前述标记物与前述被检抗原作用而生成光学上可检测的标记化抗原，在固定化可与前述被检抗原特异性结合的特异性结合抗体而形成的固定相上，捕获前述标记化抗原。
2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在前述固定相上，对通过增殖培养液增殖了的前述标记化抗原进行捕获。
3.如权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，使含有前述标记化抗原的试样溶液循环多次的同时，在前述固定相上捕获被循环的标记化抗原。
4.如权利要求1～3中任一项所述的检测方法，其特征在于，在固定化分别对应多种前述被检抗原可特异性结合的特异性结合抗体而形成的多种固定相上，捕获前述被检抗原。
5.检测装置，它是具有可设置固定化可与被检抗原特异性结合的特异性结合抗体而形成的固定相的柱的检测装置，其特征在于，在设置了前述固定相的柱中，捕获前述被检抗原被标记化而得到的标记化抗原。
6.如权利要求5所述的检测装置，其特征在于，前述检测装置还具备搅拌液体的搅拌装置，前述标记化抗原在前述搅拌装置中被标记化。
7.如权利要求5所述的检测装置，其特征在于，前述柱可以多次使用。
8.检测装置，它是具有多根可设置固定化可与被检抗原特异性结合的特异性结合抗体而形成的固定相的柱的检测装置，其特征在于，在设置了前述固定相的多根柱中，捕获前述被检抗原被标记化而得到的标记化抗原。
9.生物柱，其特征在于，设置了固定化可与被检抗原特异性结合的特异性结合抗体而形成的固定相。
10.搅拌方法，其特征在于，在设置了固定化可与被检抗原特异性结合的特异性结合抗体而形成的固定相的生物柱中，利用前述生物柱内的压力变化，搅拌前述固定相。
全文摘要
本发明提供通过对被检抗原内的活菌进行特异性标记化，可以在短时间内迅速检测出作为抗原的微生物中的活菌，而且也能保证检查的可靠性的检测方法及检测装置。该检测方法的特征在于，生成使大肠杆菌等被检抗原与被该被检抗原内的活菌(目标菌12)所酶解的标记物13作用而得到的标记化抗原14后，在固定化可与被检抗原特异性结合的特异性结合抗体而形成的固定相上，对该标记化抗原14进行捕获。
文档编号G01N30/50GK1989413SQ200580013890
公开日2007年6月27日 申请日期2005年3月3日 优先权日2004年4月28日
发明者御子柴徹, 佐佐木哲朗, 圆城寺隆治 申请人:安泰日本株式会社