专利名称：低密度脂蛋白中胆固醇的多重定量方法
技术领域：
本发明涉及同时测量生物样品中作为被分析物的低密度脂蛋白中胆固醇和总胆固醇的方法，特别涉及可以稳定用于测量的液体试剂的方法。
背景技术：
低密度脂蛋白(以下称作“LDL”)在血液胆固醇运输中起主要作用，特别是，在动脉粥样硬化病例中血管壁上沉积的绝大部分胆固醇来自LDL。LDL胆固醇的增加是动脉粥样硬化疾病的主要危险因素，因此在临床上对其选择性定量是很有用的。总胆固醇测量包括测量所有的脂蛋白，例如乳糜微粒(CM)、极低密度脂蛋白(VLDL)、LDL以及高密度脂蛋白(HDL)中的胆固醇，总胆固醇测量仍然是脂类检验的主要项目。
定量LDL胆固醇的常规方法包括一种包含分级分离和胆固醇定量两个操作的方法以及基于总胆固醇、HDL胆固醇和甘油三酯值依照Friedewald方程通过计算的定量方法。
对于分级分离，包括了诸如超速离心、沉淀和免疫学技术的方法。这些方法需要通过离心或过滤处理样品，考虑到便利和经济的原因，很难在实验室检验部门推广应用。基于Friedwald方程的计算方法因不考虑个体变异，所以在精确度上有问题，限制了其使用。
近来，业已报道了不需要分级分离的定量LDL胆固醇的方法(特开平11-318496号公报)，其在检验作为临床检验用试剂时适用。该方法包括第一步，选择性除去样品中除LDL外的脂蛋白中胆固醇(“除去”意思是降解酯型胆固醇，并使降解产物在第二步中不被检测到)，以及第二步定量LDL胆固醇。
尽管上述用于LDL胆固醇测量的试剂在临床上很有用，但是该试剂并没有得到广泛使用，这是因为一直广泛地进行总胆固醇的常规测量，并且可以通过Friedewald方程等测定LDL胆固醇水平。然而，如上所述，通过Friedewald方程测定的LDL胆固醇水平存在问题，并且，LDL胆固醇水平的精确测量具有临床意义。因此，期望进一步改进该试剂，由此推广使用临床意义高的测量LDL胆固醇的试剂。
另一方面，下述文献中披露了仅用一次测定连续测量HDL中胆固醇和总胆固醇以及LDL中胆固醇和总胆固醇的方法(特表2003-501630号公报)。在该方法中，将样品放入试管中，使样品中非HDL胆固醇和抗apoB抗体之间形成复合物，并测量未参与形成复合物的脂蛋白，即HDL。接着，用表面活性剂解离复合物，并通过酶测定剩余的非HDL胆固醇。可通过将两次测量获得的值加起来得到总胆固醇水平。就LDL胆固醇来说，使用了类似的反应方法，其中在复合物形成时使用的是抗apoA-I或抗apoA-II抗体而非抗apoB抗体。常规测量HDL胆固醇、LDL胆固醇和总胆固醇在医学检查等领域中广泛应用，因此，同时测量HDL胆固醇、LDL胆固醇和总胆固醇很有意义。
专利文件1特开平11-318496号公报专利文件2特表2003-501630号公报发明概述本发明的目的是提供一种抑制下述试剂自发显色的稳定化方法，所述试剂用于通过一次测定同时定量LDL胆固醇和总胆固醇。该方法作为一种多重定量方法，其中仅用一次测量就可获得多个项目的定量值。
鉴于最近引起注意的LDL胆固醇的精确测量的重要性，以及通常已知的总胆固醇测量的重要性，本发明人坚持不懈地研究以建立同时测量LDL胆固醇和总胆固醇的系统。
本发明人已开发了一种能同时测量LDL胆固醇和总胆固醇的方法(特愿2002-362970，PCT/JP03/15995)。该方法包括在作用于除LDL外的脂蛋白的表面活性剂存在下，使胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶作用于脂蛋白，通过将所产生的过氧化氢转化为醌染料来测量除LDL外的脂蛋白中胆固醇，随后添加至少作用于LDL的表面活性剂，使胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶作用于残留的LDL，并通过将所产生的过氧化氢转化为醌染料来测量LDL胆固醇，在此可通过对上述两次测量值求和计算总胆固醇值。该方法是一种有效的多重定量方法，其中仅用一次测量就可获得多个项目的定量值。但是，在该方法中，存在于第一试剂中的、产生醌染料的成分以液体试剂的形式使用，因此该试剂被空气氧化，带来了自发显色和液体试剂缺乏稳定性的问题。
因此，本发明人坚持不懈地针对用于仅用一次测量就能同时定量LDL胆固醇和总胆固醇的试剂的稳定性进行研究，终于找到了一种通过抑制在同时测量LDL胆固醇和总胆固醇的方法中所用试剂自发显色来稳定地测量LDL胆固醇和总胆固醇的可靠方法。
在先前的定量方法中，对样品中除LDL外的脂蛋白中胆固醇进行酶促反应以检测胆固醇的步骤在第一步进行。但是，在本发明的定量方法中，该步骤得到改进以便能检测除LDL外的脂蛋白中胆固醇的酶促反应，其在第一步、第二步的早期进行并在随后检测LDL胆固醇的酶促反应。
图1显示了本发明的原理。如图1所示，本发明的方法包括两个步骤。在第一步中，基于样品中除LDL外的脂蛋白中胆固醇的反应产生了过氧化氢。在第二步中，由第一步中所产生的过氧化氢引起发生反应溶液吸光度的改变，随后发生了基于LDL中胆固醇的反应，并测量由于上述反应的反应溶液吸光度的改变。第二步中吸光度的改变总量相应于总胆固醇量，而关相对于第二步中所产生的过氧化氢量的吸光度的改变量则相应于LDL胆固醇量。通过改变在测量这种吸光度改变时自动分析仪的分析条件，可仅用一次测量就可同时进行多项的测量。
在常用的多重定量方法中，大多数与醌染料形成相关的试剂组合物整合到测量第一步所使用的第一试剂中。另一方面，在本发明方法中，因为醌染料仅在第二步形成，所以大多数与醌染料形成相关的试剂组合物能与第一步所使用的第一试剂和第二步所使用的第二试剂分开，故抑制了由于试剂空气氧化所致的自发显色。因为抑制试剂自发显色变得可能，所以试剂能得到稳定，因此能可靠地测量胆固醇。
当使用自动分析仪在各种可以设定的测量条件下执行本发明方法时，可在多项分析中设定分析仪的测量条件，即根据第二步中吸光度总的改变来定量总胆固醇。另一种测量条件是在第二步中添加第二试剂后，根据两点间(在添加第二试剂后吸光度刚快速改变后的点和反应终点之间)吸光度的差值定量LDL胆固醇。
即，本发明如下。
一种仅用一次测量定量生物样品中的低密度脂蛋白中的胆固醇和总胆固醇的方法，包括处理生物样品中除低密度脂蛋白外的脂蛋白以产生过氧化氢的第一步；和转化第一步中所获得的过氧化氢为醌染料并处理残留的低密度脂蛋白以及转化所产生的过氧化氢为醌染料的第二步，其中所述醌染料并不在第一步形成，并仅用一次测量根据第二步中形成的醌染料的量定量低密度脂蛋白中的胆固醇和总胆固醇；[2][1]的方法，其中与醌染料形成相关的试剂组合物包括4-氨基安替比林、酚类和苯胺类氢供体化合物以及过氧化物酶；在第一步中添加4-氨基安替比林(4-aminoantipyrine)、酚类(phenolic)和苯胺类氢供体化合物(anilinic hydrogen donor compound)中的任何一种；在第一步中没有添加的试剂组合物在第二步中添加；[3][1]或[2]的方法，其中在第一步中，在作用于除低密度脂蛋白外的脂蛋白的表面活性剂存在下，使胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶作用于生物样品中除低密度脂蛋白外的脂蛋白以产生过氧化氢；并在第二步中，在至少作用于低密度脂蛋白的表面活性剂存在下使胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶作用于生物样品中的低密度脂蛋白以产生过氧化氢；[4][1]-[3]任一的方法，其中在第二步中，第一步获得的过氧化氢被转化为醌染料；将至少作用于低密度脂蛋白的表面活性剂添加到测量系统中；使胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶作用于测量系统中残留的低密度脂蛋白；并通过转化为醌染料测量所产生的过氧化氢；[5][1]-[4]任一的方法，其中基于下述的两个值同时测量生物样品中的低密度脂蛋白中的胆固醇和总胆固醇的量，所述的两个值为作为反映存在的总胆固醇量的测量值的第二步中吸光度的改变总量，以及作为反映低密度脂蛋白中存在的胆固醇量的测量值的相对于第二步中所产生的过氧化氢量的吸光度改变量。
[1]-[5]任一的方法，其中第二步中吸光度的改变显示了两阶段的增加，其中在添加第二试剂后的快速增加和随后的缓速增加；根据后面吸光度的缓速改变量定量低密度脂蛋白中胆固醇；[7][1]-[6]任一的方法，其中根据第二步中总的吸光度的改变量定量总胆固醇； [1]-[7]任一的方法，其中在不同的测量条件下，使用供临床化学检验用的自动分析仪仅用一次测量来进行分析；[9]一种稳定仅用一次测量定量生物样品中的低密度脂蛋白中的胆固醇和总胆固醇方法中的液体试剂的方法，所述定量方法包括添加第一试剂以处理生物样品中除低密度脂蛋白外的脂蛋白以产生过氧化氢的第一步，和添加第二试剂以转化第一步中所产生的过氧化氢为醌染料并处理残留的低密度脂蛋白以产生过氧化氢以及转化为醌染料的第二步，其中在第一步中添加的第一试剂中包含作为与醌染料形成相关的试剂组合物的4-氨基安替比林、酚类或苯胺类氢供体化合物中的任意一种；和在第二试剂中含有4-氨基安替比林、酚类或苯胺类氢供体化合物以及过氧化酶之中未包含在第一试剂中的试剂组合物；[10]一种稳定[1]-[8]任一的方法中的液体试剂的方法，其中在第一步中添加的第一试剂中包含作为与醌染料形成相关的试剂组合物的4-氨基安替比林、酚类或苯胺类氢供体化合物中的任意一种；和在第二试剂中含有4-氨基安替比林、酚类或苯胺类氢供体化合物以及过氧化酶之中未包含在第一试剂中的试剂组合物；[11][9]或[10]的方法，其中在第一试剂中还含有作用于除低密度脂蛋白外的脂蛋白的表面活性剂、胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶；在第二试剂中含有至少作用于低密度脂蛋白的表面活性剂；[12]一种用于仅用一次测量定量生物样品中的低密度脂蛋白中的胆固醇和总胆固醇方法的试剂盒，所述定量方法包括添加第一试剂以处理生物样品中除低密度脂蛋白外的脂蛋白以产生过氧化氢的第一步，和添加第二试剂以转化第一步中所产生的过氧化氢为醌染料并处理残留的低密度脂蛋白以产生过氧化氢以及转化为醌染料的第二步，其中第一试剂中包含作为与醌染料形成相关的试剂组合物的4-氨基安替比林、酚类或苯胺类氢供体化合物中的任意一种；和第二试剂中含有4-氨基安替比林、酚类或苯胺类氢供体化合物以及过氧化酶之中未包含在第一试剂中的试剂组合物；[13][12]的试剂盒，其中在第一试剂中还含有作用于除低密度脂蛋白外的脂蛋白的表面活性剂、胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶；在第二试剂中含有至少作用于低密度脂蛋白的表面活性剂。
通过本发明的方法，在仅用一次测量同时定量LDL胆固醇和总胆固醇的方法中使用的试剂能稳定地保持为液体状态，使得由于空气氧化所致的自发着色无法发生。此外，仅用一次测量就能可靠地测量LDL胆固醇和总胆固醇。
本说明书包含了描述于本申请优先权所基于的JP专利申请号2004-106006说明书或附图或两者中的内容。
附图简述图1显示的是本发明多重定量方法的原理；图2显示的是用本发明多重定量方法测量的LDL中胆固醇水平和独立测量的LDL中胆固醇水平之间的相关性；以及图3显示的是用本发明多重定量方法测量的总胆固醇水平和独立测量的总胆固醇水平之间的相关性。
实施发明的最佳方式本发明是一种同时测量生物样品中的LDL中胆固醇和总胆固醇的方法，其中仅用一次测量定量生物样品中所含的LDL中胆固醇和总胆固醇，利用了通过处理脂蛋白形成的作为指示剂的染料的吸光度。此外，本发明是通过阻止空气氧化所致的试剂自发显色以增强试剂或试剂组合物稳定性且甚至当试剂放置一段长时间时仍能获得可靠结果的方法。在本发明的方法中，通过处理生物样品中的脂蛋白产生过氧化氢，接着将过氧化氢转化为醌染料，并测量醌染料的吸光度，由此测量生物样品中脂蛋白所含有的胆固醇。本发明的方法包括其中处理生物样品中除LDL外的脂蛋白以产生过氧化氢的第一步和其中转化第一步获得的过氧化氢为醌染料并处理残留的LDL以产生过氧化氢以及将过氧化氢转化为醌染料的第二步。也就是说，在本发明的方法中，在不同的步骤中分别处理除LDL外的脂蛋白和LDL，并在一个步骤中将处理产生的过氧化氢转化为醌染料并检测所形成的醌染料。在此，处理脂蛋白指用表面活性剂和酶处理脂蛋白。当用表面活性剂处理脂蛋白时，释放了脂蛋白中的胆固醇。当用酶(胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶)处理脂蛋白时，产生了过氧化氢。也就是说，处理脂蛋白包括一系列的处理，其中释放了脂蛋白中的胆固醇，且还从胆固醇产生了过氧化氢。此外，处理胆固醇还指通过用酶处理所释放的胆固醇产生过氧化氢。随后用过氧化物酶将所产生的过氧化氢转化为醌染料。在本发明中，“试剂”指含有试剂组合物的产品，以及“试剂组合物”指组成所述试剂的物质，例如表面活性剂和酶。
在第一步中，用表面活性剂和酶处理生物样品中除LDL外的脂蛋白以产生过氧化氢。因为在第一步中使用的第一试剂中并不包含与醌染料的产生相关的一组试剂组合物，所以产生的过氧化氢并不转化为醌染料。在第二步中，用表面活性剂和酶处理LDL，通过该反应才产生过氧化氢。当第二步中使用的第二试剂添加到测量系统时，在该测量系统中就含有了与醌染料的产生相关的该组试剂组合物，由此处理了LDL中的脂蛋白，同时发生了转化测量系统中所存在的过氧化氢为醌染料的反应。当第二步开始时，第一步中已形成的产生自除LDL外的脂蛋白中的胆固醇的过氧化氢存在于测量系统中，在第二步开始的同时所述过氧化氢转化为醌染料。另一方面，随着上述醌染料的产生，第二步中通过处理LDL产生的过氧化氢平行转化为醌染料。随着用酶处理胆固醇时间的延续，第二步中通过处理LDL产生的过氧化氢增加了。因为第二步中通过处理LDL产生的过氧化氢转化为醌染料，所以醌染料随时间的延续也得以增加了。第二步刚开始后由于醌染料的吸光度改变反映了第一步中产生的过氧化氢量，即除LDL外的脂蛋白中存在的胆固醇量。当第二步结束时由于醌染料的吸光度改变则反映了第一步中产生的过氧化氢量和附加的第二步中产生的过氧化氢量，即LDL中的胆固醇量。换句话说，第二步中吸光度的总改变作为反映生物样品中存在的总胆固醇量的测量值，第二步中产生的过氧化氢量的吸光度改变则作为反映LDL中存在的胆固醇量的测量值。基于这两种吸光度改变，即第二步中吸光度总改变和关于第二步中产生的过氧化氢量的吸光度改变，可以同时测量生物样品中所含的LDL中的胆固醇和总胆固醇。在本发明的方法中，在第一步和第二步中使用了不同的试剂。通过详细描述这两种试剂的成分分组，可得到与醌染料形成、试剂自身稳定相关的主要试剂组合物，且在胆固醇测量方法中亦可获得可靠结果。试剂组合物指进行化学反应所必需的试剂组合物的成分，例如于特定化学反应或缓冲液或两者相关的试剂。在本发明方法中，可获得以液体提供的稳定的液体试剂。在过氧化物酶、4-氨基安替比林、和酚类或苯胺类氢供体化合物存在下，通过处理胆固醇产生的过氧化氢形成为一种有色醌(醌染料)。当过氧化物酶、4-氨基安替比林、和酚类或苯胺类氢供体化合物以混合的液体状态存在于试剂中时，由于空气氧化作用随时间的延续形成了醌染料，甚至当不存在过氧化氢时，试剂也发生自发着色。因此，无法保持用于测量胆固醇的试剂或试剂组合物的稳定性，也就无法保证能进行可靠的胆固醇测量了。在本发明中，所有的过氧化物酶、4-氨基安替比林、和酚类或苯胺类氢供体化合物不允许同时存在于这两种试剂的任何一种中。只有在这两种试剂最终都添加到测量系统后，所有的过氧化物酶、4-氨基安替比林、和酚类或苯胺类氢供体化合物才被允许添加到系统中。
脂蛋白中含有的胆固醇，即本发明方法的测量对象包括酯型胆固醇(胆固醇酯)和游离胆固醇。当在本说明书中提及“胆固醇”时，该术语包括这两种类型。
本发明的方法所检验的生物样品是可能含有脂蛋白，如HDL、LDL、VLDL、或CM的样品，且包括但不限于例如，体液，如血液、血清、和血浆，及其稀释液。“除LDL外的脂蛋白”指HDL、VLDL、CM等。
“反映存在的总胆固醇量的测量值”和“反映LDL中存在的胆固醇量的测量值”指当测定生物样品脂蛋白中所存在的胆固醇的浓度或绝对量时，获得的测量值。该测量方法没有特别限制，并当该值相应于生物样品脂蛋白中所存在的胆固醇的浓度或绝对量时，例如，通过组合多种测量最终获得成正比或反比的值，该值称为测量值。例如，测量值的一个实例是通过用特定的试剂对脂蛋白中的胆固醇进行一系列处理所形成的化合物的吸光度。在这种情况下，测量值包括绝对值和变化值。
例如，图1所示的第二步中吸光度的改变是由通过第二步处理所产生的过氧化氢转化为醌染料产生的吸光度加上由通过第一步处理所产生的过氧化氢转化为醌染料产生的吸光度测量值。在图1中，由步骤2中测量2获得的吸光度的吸光度改变量(测量2和测量1获得的吸光度之间的差值)获得了反映LDL中存在的胆固醇量的吸光度，该吸光度是“反映LDL中存在的胆固醇量的测量值”。第二步中测量2获得的总吸光度是相应于LDL中存在的胆固醇量的吸光度加上反映除LDL外的脂蛋白中存在的胆固醇量的吸光度的值，该吸光度是“反映存在的总胆固醇量的测量值”。但是，为了在实践中获得精确的测量值，基于通过将测量2获得的吸光度减去在添加第二试剂前的吸光度所获得的值计算胆固醇量。
在仅用一次测量就获得两类测量值情况下，“一次测量”包括在测量生物样品后以获得许多必需测量值之前的一系列连续处理。在一次测量过程中，包括了许多次添加试剂和获得测量值，但不包括离心分离操作等和通过形成复合物来进行的分离操作。更适宜地，在用于测量的一个试管或孔中一次完成测量。
“基于这两个测量值同时获得的生物样品中所含的LDL胆固醇和总胆固醇的量”指基于这两个值通过计算获得LDL中的胆固醇和总胆固醇的浓度或绝对值。例如，根据图1中测量2获得的测量值量的改变可以知道LDL中存在的胆固醇量，即测量1和2测量值之间的差值，通过测量2获得的测量值可以知道存在的总胆固醇量。
在作用于除LDL外的脂蛋白的表面活性剂存在下，通过酶促反应降解胆固醇进行第一步处理。该处理产生的过氧化氢一直保留到第二步中而不被除去或检测。表面活性剂作用指通过表面活性剂降解脂蛋白以释放脂蛋白中的胆固醇。
一种选择性地与除LDL外的脂蛋白即HDL、VLDL、CM等中含有的胆固醇反应的特定方法如下。
也就是说，在作用于除LDL外的脂蛋白的表面活性剂存在下使胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶作用于脂蛋白以产生过氧化氢。
第一步反应溶液中的胆固醇酯酶浓度优选为0.2-2.0IU/mL，且优选假单胞菌属细菌原生的胆固醇酯酶。此外，胆固醇氧化酶浓度优选为0.1-0.7IU/mL，优选使用来自细菌或酵母的胆固醇氧化酶。
第一步中使用的作用于除LDL外的脂蛋白的表面活性剂的优选实例包括具有HLB值为13以上至15以下，优选13以上至小于等于4的聚环氧烷衍生物。该衍生物的实例可包括高级醇缩合物、高级脂肪酸缩合物、高级脂肪酸酰胺缩合物、高级烷基胺缩合物、高级烷基硫醇缩合物、烷基酚缩合物等。应当指出的是表面活性剂HLB值的计算方法是众所周知的，且描述于例如“Shin Kaimenkasseizai(日文)(NewSurfactants)”，Hiroshi Horiuchi，1986，Sankyou Publishing Co.LTD中。
具有HLB值为13以上至15以下的聚环氧烷衍生物的特别优选的实例可包括聚氧乙烯十二烷基醚、聚氧乙烯鲸蜡基醚、聚氧乙烯油基醚、聚氧乙烯高级醇醚、聚氧乙烯辛基苯基醚、聚氧乙烯壬基苯基醚、聚氧乙烯苄基苯基醚等具有HLB值为13以上至15以下的化合物。但是，聚环氧烷衍生物并不限于这些。
作为第一步中使用的表面活性剂，如可以是具有13.2的HLB值的聚氧乙烯衍生物Emulgen B66(Kao Corporation产品)。
第一步中使用的表面活性剂的浓度优选为约0.1-10g/L，更优选为约0.5-5g/L。
第一步优选在pH 5-9的缓冲液中进行，含有胺的缓冲液是优选的，例如Tris缓冲液、三乙醇胺缓冲液或Good氏缓冲液。特别是，作为Good氏缓冲液的Bis-Tris、PIPES、MOPSO、BES、HEPES和POPSO是优选的，缓冲液的浓度优选为10-500mM。
第一步的反应温度为约30-40℃，最优选为37℃。反应时间(从添加第一试剂到添加第二试剂的时间)为约2-10分钟，优选5分钟。
在本发明方法中，期望在白蛋白存在下进行第一步。白蛋白没有特殊限制，只要是白蛋白即可。可优选使用商品化的白蛋白，如血清白蛋白，特别优选无脂肪酸的白蛋白。白蛋白的来源没有特殊限制，可以是任何动物，如人、牛、猪和马，特别优选使用广泛使用的牛血清白蛋白。在第一步的反应液中上述白蛋白的浓度优选0.1到5.0g/dL，更优选0.3到3.0g/dL。
如上所述，第一步中使用的第一试剂包括至少一种表面活性剂、胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶。该试剂还可包含合适的缓冲液和白蛋白。第一步中使用的试剂不含有所有与醌染料形成相关的试剂组合物，但含有4-氨基安替比林或酚类或苯胺类氢供体化合物。此外，第一步中使用的第一试剂不含有过氧化物酶。
在第一步中，产生的过氧化氢相应于生物样品中存在的LDL外的脂蛋白中的胆固醇量，及该过氧化氢被转移入第二步中而不被除去或检测。
在随后的第二步中，定量第一步中已被处理的除LDL外的脂蛋白中胆固醇所产生的过氧化氢，处理并定量第一步结束时残留的LDL中的胆固醇。
通过用至少作用于LDL的表面活性剂处理LDL，进行LDL中的胆固醇的处理。通过与表面活性剂、胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶的作用，LDL中的胆固醇产生了过氧化氢。在此，胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶包含在第一步使用的第一试剂中，且可以使用在第一步中被添加到测量系统中的那些。此外，胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶也可包含在第二步使用的第二试剂中。至少作用于LDL的表面活性剂可以是仅选择作用于LDL的表面活性剂或作用于所有脂蛋白的表面活性剂。
因为根据添加第二试剂后吸光度的改变量来计算LDL的测量值，测量值的精确度取决于反应速率，即所使用的表面活性剂的反应强度。因此，优先选择具有合适的反应强度的表面活性剂。
仅选择作用于LDL或作用于所有脂蛋白的表面活性剂的优选的实例可包括在第一试剂中不使用的聚环氧烷衍生物。所述衍生物的实例可包括高级醇缩合物、高级脂肪酸缩合物、高级脂肪酸酰胺缩合物、高级烷基胺缩合物、高级烷基硫醇缩合物和烷基酚缩合物。
聚环氧烷衍生物特别优选的实例可包括聚氧乙烯十二烷基醚、聚氧乙烯鲸蜡基醚、聚氧乙烯油基醚、聚氧乙烯高级醇醚、聚氧乙烯辛基苯基醚、聚氧乙烯壬基苯基醚、聚氧乙烯苄基苯基醚等在第一试剂中不使用的化合物。作为第二步中使用的表面活性剂，是具有13.3的HLB值的聚氧乙烯月桂基醇Polidocanol(Thesit)(Roche DiagnosticCorporation产品)。
第二步中使用的表面活性剂的浓度优选为约0.1-100g/L，更优选为约1-50g/L。
第二步中其他优选的反应条件与第一步中优选的反应条件相同。但是，在本发明方法的第二步中，测量系统中含有的来自除LDL外的脂蛋白中的胆固醇的过氧化氢在第二步一开始后就被转化为醌染料，而在第二步进行中LDL中的胆固醇则产生了过氧化氢，且该过氧化氢被转化为醌染料。由于通过处理除LDL外的脂蛋白形成的醌染料的吸光度增加与第二试剂的添加同时开始，快速进行且在短时间内就结束。另一方面，因为在添加第二试剂后LDL被处理以产生过氧化氢，且接着形成醌染料，故反映存在的LDL量的吸光度在添加第二试剂后的随时间开始缓速增加，增加的速率并不太高。换句话说，第二步中吸光度的增加显示出由第二步一开始后快速增加和缓速增加组成的两阶段增加。开始的快速增加是反映存在的除LDL外的脂蛋白量的增加，以及随后的缓速增加是反映存在的LDL量的增加。
因此，期望在添加第二试剂后大于等于30秒至小于等于5分钟内终止来自LDL中胆固醇的醌染料的形成，以便来自除LDL外的脂蛋白中的胆固醇的醌染料和来自LDL中胆固醇的醌染料能被独立测量，使得能精确定量LDL中存在的胆固醇的量。
在第一步中通过测定胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶作用所产生的过氧化氢，可以定量除LDL外的脂蛋白中的胆固醇。在第二步中通过添加至少作用于LDL的表面活性剂并测定表面活性剂和已在第一步中添加的胆固醇酯酶以及胆固醇氧化酶作用产生的过氧化氢，可以定量LDL中的胆固醇。可通过其中在过氧化物酶存在下，通过在4-氨基安替比林和酚类或苯胺类氢供体化合物之间引起的氧化缩合将所产生的过氧化氢转化为有色醌并在400-700nm波长下测量的方法进行过氧化氢的检测。这时，当添加第二步中使用的第二试剂到测量系统时，所有与醌染料形成相关的试剂组合物，即过氧化物酶、4-氨基安替比林和酚类或苯胺类氢供体化合物开始包含在测量系统中。也就是说，第二步中使用的第二试剂含有至少一种作用于LDL的表面活性剂，还含有第一步中使用的第一试剂中所不含有的过氧化物酶、4-氨基安替比林和氢供体化合物(酚类或苯胺类)中的试剂组合物。此外，第二步中使用的第二试剂可含有任何一种缓冲液、白蛋白、胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶。
在第二步反应中形成的醌染料的吸光度测量值是由第二步中产生的过氧化氢所产生的吸光度加上通过第一步中反应产生的过氧化氢所产生的吸光度的测量值，并表示为生物样品中所有脂蛋白中存在的胆固醇量。通过将总吸光度减去由于第一步产生的过氧化氢的吸光度所获得的吸光度，即第二步中产生的过氧化氢的测定表示为LDL中存在的胆固醇量。
在氢供体化合物中，苯胺类氢供体化合物的实例包括N-(2-羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺(HDAOS)、N-乙基-N-磺丙基-3-甲氧基苯胺(ADPS)、N-乙基-N-磺丙基苯胺(ALPS)、N-乙基-N-磺丙基-3，5-二甲氧基苯胺(DAPS)、N-磺丙基-3，5-二甲氧基苯胺(HDAPS)、N-乙基-N-磺丙基-3，5-二甲基苯胺(MAPS)、N-乙基-N-磺丙基-3-甲基苯胺(TOPS)、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺(ADOS)、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)苯胺(ALOS)、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺(DAOS)、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲基苯胺(MAOS)、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺(TOOS)、N-磺丙基苯胺(HALPS)等。
当在第二步的反应溶液中过氧化氢转化为醌染料时，过氧化物酶的浓度优选为0.3-3.0mmol/L，以及酚类或苯胺类氢供体化合物的浓度优选为0.5-2.0mmol/L。
当在第二步中添加第二试剂时，因为所有与醌染料形成相关的试剂组合物开始包含在系统中，第一步中所产生的过氧化氢在第二步早期就转化为醌染料。与此同时，用第二试剂中含有的并作用于LDL的表面活性剂和包含在测量系统中的胆固醇酯酶及胆固醇氧化酶处理LDL中的胆固醇以产生过氧化氢。因为在其形成的同时，通过测量系统中所含有的与醌染料形成相关的试剂组合物的作用，由LDL中胆固醇所产生的过氧化氢转化为醌染料，随时间的延续醌染料量增加了。因此，在第二步中，在第二步开始的同时吸光度快速增加并随时间的延续而持续增加，如图1所示。在第一次测量中，测量快速增加的吸光度。在第二次测量中，测量随时间的延续增加的吸光度。第二次测量的测量值反映了存在的总胆固醇量，第二次测量的测量值和第一次测量的测量值之间的差值反映了LDL中存在的胆固醇量。
添加第二试剂后和第一次测量前的时间，即第一步中产生的过氧化氢转化为醌染料所需的时间是0-60秒，优选在30秒内。此外，进行第二次测量前的时间，即在第二步中通过酶促反应使LDL中存在的所有胆固醇产生过氧化氢并将所产生的过氧化氢转化为醌染料所需的时间是1-5分钟。当在第一次测量和第二次测量的两点进行测量并获得两个测量值时，根据计算处理这两个测量值，可通过计算定量总胆固醇和LDL中的胆固醇量。
计算公式如下所示。
总胆固醇ΔATsample-ΔATBLKΔATSTD-ΔATBLK×CTSTD]]>LDL胆固醇ΔALsample-ΔALBLKΔALSTD-ΔALBLK×CLSTD]]>ΔAT样品通过将样品的测量2所获得的吸光度减去仅由样品和第一试剂获得的吸光度测定的吸光度的改变量；ΔATSTD通过将标准样品的测量2所获得的吸光度减去仅由标准样品和第一试剂获得的吸光度测定的吸光度的改变量；ΔATBLK当盐水或纯水用作为样品时，通过将测量2所获得的吸光度减去仅由样品和第一试剂获得的吸光度测定的吸光度的改变量；CTSTD标准样品的总胆固醇值；ΔAL样品通过将样品的测量2所获得的吸光度减去样品的测量1所获得的吸光度测定的吸光度的改变量；ΔALSTD通过将标准样品的测量2所获得的吸光度减去标准样品的测量1所获得的吸光度测定的吸光度的改变量；ΔALBLK当盐水或纯水用作为样品时，通过将测量2所获得的吸光度减去测量1所获得的吸光度测定的吸光度的改变量；CLSTD标准样品的LDL胆固醇值。
在本发明的方法中，每种脂蛋白被处理形成醌染料的路线概述如下。应当指出的是以下概述了形成醌染料的过程(处理)，但没有显示试剂组合物。
除LDL的脂蛋白的处理 LDL的处理
在每个箭头下的试剂组合物是每种处理(反应)所需的试剂组合物，在此C酯酶表示胆固醇酯酶，C氧化酶表示胆固醇氧化酶。
在上述处理中，在本发明方法的第一步中进行处理1A，以及在第二步中进行处理1B、处理2A和处理2B。在第二步中，处理1B在第二步的早期完成，而处理2A和处理2B则在整个第二步中进行。
更适宜地，在一个反应容器中连续进行第一步和第二步，自动分析仪自动测量第二步中吸光度的改变量和第二步完成时吸光度量。
本发明方法中使用的分析仪是一种自动分析仪，具有执行多项同时分析方法的功能，其中多项可同时测量。所述自动分析仪包括TBA-30R(Toshiba Corporation)，BM1250、1650和2250(JEOL Ltd.)等。
考虑到分析仪执行多项同时分析方法的功能，可添加第一试剂至第四试剂到反应容器中并可设定反应时间为3-20分钟。此外，因为光度测量在反应的大多数时间中进行，可以设定不同的测量时间，由此比色法和速率分析以及比色法和速率方法的组合可具有不同的时间设定。更进一步，也可在不同波长下执行同时测量。可通过适当地设定这些分析用的测量条件完成本发明多项的同时测量。
对于具有执行多项同时分析方法功能的自动分析仪而言，可使用市场上可买到的分析仪。
本发明还包括一种同时测量生物样品中的LDL中的胆固醇和总胆固醇的试剂盒。本发明的试剂盒包括第一试剂和第二试剂。第一试剂含有至少作用于除LDL外的脂蛋白的表面活性剂、胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶。第一试剂还可含有与醌染料形成相关的试剂组合物，所述试剂组合物包括过氧化物酶、4-氨基安替比林和酚类或苯胺类氢供体化合物，但所有的过氧化物酶、4-氨基安替比林和酚类或苯胺类氢供体化合物不能同时含有。更进一步地，含4-氨基安替比林或酚类或苯胺类氢供体化合物的任何一种，不含过氧化物酶。此外，第一试剂可含合适的缓冲液、白蛋白等。第二试剂含有至少作用于LDL的表面活性剂和在第一试剂使用的包括过氧化物酶、4-氨基安替比林和酚类或苯胺类氢供体化合物的与醌染料形成相关的试剂组合物之中不含有的附加的试剂组合物。第二试剂还可含合适的缓冲液、白蛋白等。可以测量通过试剂组合物反应形成的有色醌的吸光度。本发明的试剂盒还含有具有已知浓度的标准脂蛋白溶液、缓冲液等。
实施例在下文中，基于实施例本发明得到更具体的解释。但是，本发明不限于下述实施例。
制备第一步和第二步中使用的试剂组合物(分别为第一试剂组合物和第二试剂组合物)，使得分别产生如下组合物。分别制备相应于两种测量系统的试剂组合物，所述试剂组合物对于第一试剂和第二试剂而言具有不同组分。
测量系统1第一试剂组合物PIPES缓冲液，pH 7.050mmol/L4-氨基安替比林 1.4mmol/L胆固醇酯酶 0.6IU/mL胆固醇氧化酶 0.5IU/mL表面活性剂，Emulgen B66(Kao Corp) 0.27％第二试剂组合物PIPES缓冲液，pH 7.050mmol/L表面活性剂，Polidocanol(Thesit)1％(Roche Diagnostic Crop)TOOS6mmol/LPDO(过氧化物酶) 6.5IU/mL测量系统2第一试剂组合物PIPES缓冲液，pH 7.0 50mmol/LTOOS2mmol/L胆固醇酯酶 0.6IU/mL
胆固醇氧化酶 0.5IU/mL表面活性剂，Emulgen B66(Kao Corp)0.27％第二试剂组合物PIPES缓冲液，pH 7.0 50mmol/L表面活性剂，Polidocanol(Thesit) 1％(Roche Diagnostic Crop)4-氨基安替比林 4mmol/LPOD 6.5IU/mL作为用于评估的对照产品，使用市场上可买到用于自动分析的试剂LDL-EX N(Denka Seiken Co.，Ltd.产品)和用于自动分析的试剂T-CHO(S)N(Denka Seiken Co.，Ltd.产品)。(样品)制备58份人血清样品。
作为自动分析仪，使用TBA-30R(Toshiba Corporation产品)。(用于同时分析LDL-C和T-CHO的试剂(多重试剂))测量条件多项自动分析将37℃下预热的300μL第一试剂与各4μL样品混合并在37℃下反应5分钟后，添加100μL的第二试剂并继续反应5分钟。在添加第二试剂后，在30秒和5分钟后测量600nm处吸光度。根据添加第二试剂后30秒和5分钟之间的吸光度的改变量计算LDL胆固醇(LDL-C)水平，并根据添加第二试剂后吸光度的改变量计算总胆固醇(T-CHO)水平。这时，预先测量由盐水(在下文中，称为空白)引起的吸光度的改变量和当使用已知浓度样品作为标准样品时吸光度的改变量，并根据LDL-C和T-CHO这两个值的差值计算“每mg/dL的吸光度的改变量”。然后，测量样品，通过将测量的吸光度的改变量减去空白获得吸光度的改变量，并与“每mg/dL的吸光度的改变量”比较以分别计算LDL-C和T-CHO的浓度。
通过用于评估的对照产品LDL-EX N测量的LDL中胆固醇的测量值和通过本发明方法测量的测量值之间的相关性如图2所示。通过用于评估的对照产品T-CHO(S)测量的总胆固醇的测量值和通过本发明方法测量的测量值之间的相关性如图3所示。如图2和3所示，根据本发明方法同时的定量，获得了与当LDL-C和T-CHO分别测量时获得的值相似的测量结果。
在本说明书中引用的所有出版物、专利、以及专利申请其全文引入本说明书中作为参考。
权利要求
1.一种仅用一次测量定量生物样品中的低密度脂蛋白中的胆固醇和总胆固醇的方法，包括处理生物样品中除低密度脂蛋白外的脂蛋白以产生过氧化氢的第一步；和转化第一步中所获得的过氧化氢为醌染料并处理残留的低密度脂蛋白以及转化所产生的过氧化氢为醌染料的第二步，其中所述醌染料并不在第一步形成，并仅用一次测量根据第二步中形成的醌染料的量由此定量低密度脂蛋白中的胆固醇和总胆固醇。
2.根据权利要求1的方法，其中与醌染料形成相关的试剂组合物包括4-氨基安替比林、酚类和苯胺类氢供体化合物以及过氧化物酶；在第一步中添加4-氨基安替比林、酚类和苯胺类氢供体化合物中的任何一种；在第一步中没有添加的试剂组合物在第二步中添加。
3.根据权利要求1或2的方法，其中在第一步中，在作用于除低密度脂蛋白外的脂蛋白的表面活性剂存在下使胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶作用于生物样品中除低密度脂蛋白外的脂蛋白以产生过氧化氢；并在第二步中，在至少作用于低密度脂蛋白的表面活性剂存在下使胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶作用于生物样品中所含的低密度脂蛋白以产生过氧化氢。
4.根据权利要求1-3任一的方法，其中在第二步中，第一步获得的过氧化氢被转化为醌染料；将至少作用于低密度脂蛋白的表面活性剂添加到测量系统中；使胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶作用于测量系统中残留的低密度脂蛋白；并通过转化为醌染料测量所产生的过氧化氢。
5.根据权利要求1-4任一的方法，其中基于下述的两个值同时测量生物样品中的低密度脂蛋白中的胆固醇和总胆固醇的量，所述的两个值为作为反映存在的总胆固醇量的测量值的第二步中吸光度总的改变量，以及作为反映低密度脂蛋白中存在的胆固醇量的测量值的相对于第二步中所产生的过氧化氢量的吸光度改变量。
6.根据权利要求1-5任一的方法，其中第二步中吸光度的改变显示了两阶段的增加，其中在添加第二试剂后的快速增加和随后的缓速增加；根据后面吸光度的缓速改变量定量低密度脂蛋白中胆固醇。
7.根据权利要求1-6任一的方法，其中根据第二步中吸光度总的改变量定量总胆固醇。
8.根据权利要求1-7任一的方法，其中在不同的测量条件下，使用供临床化学检验用的自动分析仪仅用一次测量来进行分析。
9.一种稳定仅用一次测量定量生物样品中的低密度脂蛋白中的胆固醇和总胆固醇方法中所用的液体试剂的方法，所述定量方法包括添加第一试剂以处理生物样品中除低密度脂蛋白外的脂蛋白以产生过氧化氢的第一步，和添加第二试剂以转化第一步中所产生的过氧化氢为醌染料并处理残留的低密度脂蛋白以产生过氧化氢以及转化为醌染料的第二步，其中在第一步中添加的第一试剂中包含作为与醌染料形成相关的试剂组合物的4-氨基安替比林、酚类或苯胺类氢供体化合物中的任意一种；和在第二试剂中含有4-氨基安替比林、酚类或苯胺类氢供体化合物以及过氧化酶之中未包含在第一试剂中的试剂组合物。
10.一种稳定根据权利要求1-8任一的方法中所用液体试剂的方法，其中在第一步中添加的第一试剂中包含作为与醌染料形成相关的试剂组合物的4-氨基安替比林、酚类或苯胺类氢供体化合物的任意一种；和在第二试剂中含有4-氨基安替比林、酚类或苯胺类氢供体化合物以及过氧化酶之中未包含在第一试剂中的试剂组合物。
11.根据权利要求9或10的方法，其中在第一试剂中还含有作用于除低密度脂蛋白外的脂蛋白的表面活性剂、胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶；以及在第二试剂中含有至少作用于低密度脂蛋白的表面活性剂。
12.一种用于仅用一次测量定量生物样品中的低密度脂蛋白中的胆固醇和总胆固醇方法的试剂盒，所述定量方法包括添加第一试剂以处理生物样品中除低密度脂蛋白外的脂蛋白以产生过氧化氢的第一步，和添加第二试剂以转化第一步中所产生的过氧化氢为醌染料并处理残留的低密度脂蛋白以产生过氧化氢以及转化为醌染料的第二步，其中其中第一试剂中包含作为与醌染料形成相关的试剂组合物的4-氨基安替比林、酚类或苯胺类氢供体化合物中的任意一种；和第二试剂中含有4-氨基安替比林、酚类或苯胺类氢供体化合物以及过氧化酶之中未包含在第一试剂中的试剂组合物。
13.根据权利要求12的试剂盒，其中在第一试剂中还含有作用于除低密度脂蛋白外的脂蛋白的表面活性剂、胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶；在第二试剂中含有至少作用于低密度脂蛋白的表面活性剂。
全文摘要
提供了一种通过抑制其自发显色而稳定试剂的方法，使得仅用一次测量就能同时定量LDL胆固醇和总胆固醇。一种仅用一次测量定量生物样品中所含的低密度脂蛋白中的胆固醇和总胆固醇的方法，包括处理生物样品中除低密度脂蛋白外的脂蛋白以产生过氧化氢的第一步，和转化第一步中获得的过氧化氢为醌染料并处理残留的低密度脂蛋白以及转化所产生的过氧化氢为醌染料的第二步，这里在第一步中不形成醌染料，以及仅用一次测量根据第二步中产生的醌染料的量定量低密度脂蛋白中胆固醇和总胆固醇。
文档编号G01N33/92GK1961079SQ200580017679
公开日2007年5月9日 申请日期2005年3月30日 优先权日2004年3月31日
发明者松本京子, 松井宽史 申请人:电化生研株式会社