专利名称：离子钙诊断/测定试剂盒及离子钙浓度的测定方法
技术领域：
本发明涉及一种离子钙诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定离子钙浓度的方法，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。
背景技术：
血液中的钙几乎全部存在于血浆中，血浆钙有两种形式1非扩散性钙，也称结合钙。它同蛋白质结合，不能透过毛细血管壁，不具有生理活性，约占钙的40％；2可扩散性钙，包括离子化钙，约占总钙的46％，是具有生理活性的部分。与碳酸氢根、磷酸盐、柠檬酸、乳酸等阴离子结合的钙，约占总钙的14％。非扩散性钙与扩散性钙可以互相转变并保持动态平衡。
钙的生理功能主要为1构成骨骼和牙齿，维持和修补骨骼的完整性；2保持神经肌肉的正常应激性；3传导神经冲动；4维持细胞的正常生理通透性；5参与血疑过程；6激活某些酶的活性，如琥珀酸脱氢酶、ATP酶等；7对心肌收缩的影响，ca2+有利于心肌收缩，它和有利于心肌舒张的K+相拮抗，从而维持心肌正常的收缩与舒张。血钙与骨骼中的钙保持动态平衡。血钙含量的变化常能反映出骨组织的代谢情况，因此测定血钙对某些疾病的诊断有帮助。
总钙的测定方法很多，概括起来有滴定法(氧化还原滴定法、络合滴定法)，比色法(方法很多，最常用又便与自动化操作的是邻甲酚酞合络酮法、甲基麝香草酚蓝法、偶氮胂III法等)，火焰光度法、原子吸收分光光度法、同位素稀释质谱法、酶法。国际临床化学联合(IFCC)推荐的钙测定决定性方法为同位素稀释质谱法(IDMS)，参考方法为原子吸收分光光度法。世界卫生组织(WHO)推荐的中等实验室用的常规方法为邻甲酚酞络合酮法(O-CPC)。
离子钙的测定方法大致有生物学法、透析法、超滤法、金属指示剂法、离子选择性电极法.目前应用最多的是离子选择性电极法(ISE)。此方法简便、迅速、重复性好，正确和敏感性高。测定结果不受血浆蛋白质的影响，能反映机体钙代谢的实际情况。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提出一种利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶联法(Couple Reaction)技术，连续监测通过酶联反应生成吲嗒胺色原(Indamine dye)或醌亚胺色原(Quioneimine dye)，所导致在400-700nm波长处吸光度的上升，得以测定离子钙浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的离子钙诊断/测定试剂盒，采用该试剂盒不仅可以在可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行离子钙浓度测定，而且测定速度快、灵敏度大、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。
本发明离子钙浓度测定方法原理如下 还原型辅酶+氧NAD(P)H氧化酶/Ca2+辅酶+过氧化氢 过氧化氢+还原型色原体组合过氧化物酶吲嗒胺色原或醌亚胺色原+水 这种方法应用NAD(P)H氧化酶(NAD(P)H oxidase；EC 1.6.3.1)需要钙离子才能激活酶活性的酶促反应速率比色法。在钙离子的催化下，NAD(P)H氧化酶(NAD(P)H oxidase；EC 1.6.3.1)酶解反应产生过氧化氢，再通过(偶)联合过氧化物酶(peroxidase；EC 1.11.1.7)的作用，最终将无色的还原型色原体组合氧化成有色的染料，从而可以通过可见光分析仪器，在400700nm(根据还原型色原体组合的不同而定)波长处，测定染料，吲嗒胺色原(Indamine dye)或醌亚胺色原(Quioneimine dye)，含量高低的光吸收大小，通过测量400-700nm(根据还原型色原体组合的不同而定)处吸光度上升的速度，得出离子钙浓度大小测定结果。
实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，如下成分关系的本发明离子钙浓度诊断/测定试剂盒较为理想 缓冲液 100mmol/L 稳定剂 50mmol/L 还原型辅酶 0.25mmol/L NAD(P)H氧化酶 6000U/L 过氧化物酶15000U/L 还原型色原体组合 6mmol/L 所述还原型色原体组合(Chromogen)可以是下列28个组合中的任一个组合 3-甲基-2-苯噻唑酮腙 石碳酸 3-甲基-2-苯噻唑酮腙 N-乙基-N-(3-硫丙基)-m-噻啶胺 3-甲基-2-苯噻唑酮腙 N，N-双乙基-m-甲苯胺 3-甲基-2-苯噻唑酮腙 2，4-双氯石碳酸 3-甲基-2-苯噻唑酮腙 2，4，6-仨溴-3-羟基-苯磺酸 3-甲基-2-苯噻唑酮腙 3，5-双氯石碳酸磺酸 3-甲基-2-苯噻唑酮腙 3，5-双氯-2-羟基-苯磺酸 3-甲基-2-苯噻唑酮腙 N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐 3-甲基-2-苯噻唑酮腙 仨溴羥基苯甲酸 3-甲基-2-苯噻唑酮腙 双甲基苯胺 3-甲基-2-苯噻唑酮腙 N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺 3-甲基-2-苯噻唑酮腙 2，2’-AZINO-双(3-乙基苯噻唑-6-磺酸) 3-甲基-2-苯噻唑酮腙 4-羥基-3-甲氧基苯甲酸 3-甲基-2-苯噻唑酮腙 3-甲基-乙基-羥基苯胺 4-氨基抗砒 石碳酸 4-氨基抗砒 N-乙基-N-(3-硫丙基)-m-噻啶胺 4-氨基抗砒 N，N-双乙基-m-甲苯胺 4-氨基抗砒 2，4-双氯石碳酸 4-氨基抗砒 2，4，6-仨溴-3-羟基-苯磺酸 4-氨基抗砒 3，5-双氯石碳酸磺酸 4-氨基抗砒 3，5-双氯-2-羟基-苯磺酸 4-氨基抗砒 N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐 4-氨基抗砒仨溴羥基苯甲酸 4-氨基抗砒 双甲基苯胺 4-氨基抗砒 N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺 4-氨基抗砒 2，2’-AZINO-双(3-乙基苯噻唑-6-磺酸) 4-氨基抗砒 4-羥基-3-甲氧基苯甲酸 4-氨基抗砒 3-甲基-乙基-羥基苯胺 本发明的离子钙浓度诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括缓冲液、稳定剂、NAD(P)H氧化酶、还原型辅酶、过氧化物酶、还原型色原体组合、抗干扰剂。
试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂 试剂1 缓冲液、稳定剂、还原型色原体组合、抗干扰剂、还原型辅酶。
试剂2 缓冲液、稳定剂、过氧化物酶、NAD(P)H氧化酶。
NAD(P)H氧化酶、还原型辅酶、过氧化物酶、还原型色原体组合在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂 试剂1 缓冲液、稳定剂、还原型色原体组合、还原型辅酶、抗干扰剂。
试剂2 缓冲液、稳定剂、过氧化物酶。
试剂3 缓冲液、稳定剂、NAD(P)H氧化酶。
NAD(P)H氧化酶、还原型辅酶、过氧化物酶、还原型色原体组合在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
具体实施例方式 下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。
实施例一 本实施例的离子钙浓度诊断/测定试剂为单试剂，包括 三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液100mmol/L 稳定剂 50mmol/L 还原型辅 酶0.25mmol/L NAD(P)H氧化酶 6000U/L 过氧化物酶30000U/L 4-氨基抗砒2mmol/L 石碳酸10mmol/L 试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入纯净水，复溶后使用。
在全自动生化分析仪上设定温度37℃，反应时间10分钟，测试主波长505nm，测试副波长600nm，被测离子钙样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长505nm吸光度上升的速度，从而测算出离子钙浓度大小。
实施例二 本实施例的离子钙浓度诊断/测定试剂为双试剂，包括 试剂1 三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 50mmol/L 还原型辅酶 0.25mmol/L 2，4，6-仨溴-3-羟基-苯磺酸 0.2mmol/L 试剂2 三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 50mmol/L NAD(P)H氧化酶 6000U/L 过氧化物酶 25000U/L 4-氨基抗砒 0.6mmol/L 试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。
在全自动生化分析仪上设定温度37℃，反应时间10分钟，测试主波长546nm，测试副波长600nm，被测离子钙样品与试剂的体积比例为1/20，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长546nm吸光度上升的速度，从而测算出离子钙浓度大小。
实施例三 本实施例的离子钙浓度诊断/测定试剂为三试剂，包括 试剂1 三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 50mmol/L 还原型辅酶 0.25mmol/L 试剂2 三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 50mmol/L 过氧化物酶15000U/L 3-甲基-2-苯噻唑酮腙 0.6mmol/L 试剂3 三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂50mmol/L NAD(P)H氧化酶 6000U/L 双甲基苯胺2mmol/L 试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。
在全自动生化分析仪上设定温度37℃，反应时间10分钟，测试主波长578nm，测试副波长660nm，被测离子钙样品与试剂的体积比例为1/30，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长578nm吸光度上升的速度，从而测算出离子钙浓度大小。
申请人:经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他各种还原型色原体组合均能达到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不另一一例举。
总之，实验证明，采用本发明的测定方法完全可以通过可见光分析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好，不受内外源物质量污染。
权利要求
1.一种离子钙浓度的测定方法，其方法原理如下
将最终反应物置于可见光分析仪下，检测400-700nm处直接反映吲嗒胺色原或醌亚胺色原含量高低的光吸收大小，得出离子钙浓度大小测定结果。
2.一种离子钙诊断/测定试剂盒，主要成分包括
缓冲液 20——500mmol/L
稳定剂 1——50mmol/L
还原型辅酶 0.1——0.35mmol/L
NAD(P)H氧化酶 2000——20000U/L
过氧化物酶 500——500000U/L
还原型色原体组合0.1——20mmol/L
其特征在于试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；
也可以配制成液体试剂，直接使用。
3.根据权利要求2所述离子钙诊断/测定试剂盒，其特征在于
由缓冲液、稳定剂、NAD(P)H氧化酶(NAD(P)H oxidase；EC1.6.3.1)、还原型辅酶、过氧化物酶(peroxidase；EC 1.11.1.7)、还原型色原体组合及抗干扰剂组成单剂试剂。
4.根据权利要求2所述离子钙诊断/测定试剂盒，其特征在于
由缓冲液、稳定剂、NAD(P)H氧化酶(NAD(P)H oxidase；EC1.6.3.1)、还原型辅酶、过氧化物酶(peroxidase；EC 1.11.1.7)、还原型色原体组合及抗干扰剂组成双剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、还原型色原体组合及抗干扰剂组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、NAD(P)H氧化酶、过氧化物酶组成。NAD(P)H氧化酶、还原型辅酶、过氧化物酶、还原型色原体组合在试剂1或试剂2中的位置可以不限。
5.根据权利要求2所述离子钙诊断/测定试剂盒，其特征在于
由缓冲液、稳定剂、NAD(P)H氧化酶(NAD(P)H oxidase；EC1.6.3.1)、还原型辅酶、过氧化物酶(peroxidase；EC 1.11.1.7)、还原型色原体组合及抗干扰剂组成多剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、还原型色原体组合及抗干扰剂组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、过氧化物酶组成；试剂3，由缓冲液、稳定剂、NAD(P)H氧化酶组成。NAD(P)H氧化酶、还原型辅酶、过氧化物酶、还原型色原体组合在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。
6.根据权利要求2所述离子钙诊断/测定试剂盒，其特征在于还包括稳定剂1-4000mmol/L或0.1％-100％体积比。所述稳定剂为硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(PropyleneGlycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种。
7.根据权利要求2所述离子钙诊断/测定试剂盒，其特征在于所述还原型色原体组合可以是下列28个组合中的任一个组合
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
石碳酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
N-乙基-N-(3-硫丙基)-m-噻啶胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
N，N-双乙基-m-甲苯胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
2，4-双氯石碳酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
2，4，6-仨溴-3-羟基-苯磺酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
3，5-双氯石碳酸磺酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
3，5-双氯-2-羟基-苯磺酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
仨溴羥基苯甲酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
双甲基苯胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
2，2’-AZINO-双(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
4-羥基-3-甲氧基苯甲酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
3-甲基-乙基-羥基苯胺
4-氨基抗砒
石碳酸
4-氨基抗砒
N-乙基-N-(3-硫丙基)-m-噻啶胺
4-氨基抗砒
N，N-双乙基-m-甲苯胺
4-氨基抗砒
2，4-双氯石碳酸
4-氨基抗砒
2，4，6-仨溴-3-羟基-苯磺酸
4-氨基抗砒
3，5-双氯石碳酸磺酸
4-氨基抗砒
3，5-双氯-2-羟基-苯磺酸
4-氨基抗砒
N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐
4-氨基抗砒
仨溴羥基苯甲酸
4-氨基抗砒
双甲基苯胺
4-氨基抗砒
N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺
4-氨基抗砒
2，2’-AZINO-双(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)
4-氨基抗砒
4-羥基-3-甲氧基苯甲酸
4-氨基抗砒
3-甲基-乙基-羥基苯胺
全文摘要
本发明涉及一种利用酶比色法及酶联法技术的离子钙诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定离子钙浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括缓冲液、NAD(P)H氧化酶、还原型辅酶、过氧化物酶、还原型色原体组合、稳定剂及抗干扰剂；通过一系列的酶促反应，最终将无色的还原型色原体组合氧化成有色的染料，从而可以通过可见光分析仪器，在400-700nm波长处，测定染料含量的高低，进而直接反映出离子钙浓度的大小。
文档编号G01N33/84GK101169435SQ20061009720
公开日2008年4月30日 申请日期2006年10月24日 优先权日2006年10月24日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司