专利名称：：人类免疫缺陷病毒抗体化学发光免疫分析诊断试剂盒及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及免疫分析医学领域，具体地，本发明提供了一种人类免疫缺陷病毒(HIV)抗体化学发光免疫分析诊断试剂盒及其制备方法。
背景技术：
：获得性免疫缺陷综合征，又称艾滋病(AIDS)，是由人类免疫缺陷病毒(HIV)感染所引起的一种免疫缺陷性疾病。由于该病目前尚无有效的治疗方法和预防疫苗，目前正以大约1.4万人受感染的速度扩大流行。据估计，我国HIV感染者已近100万，如不采取积极有效的控制措施，到2010年我国HIV感染者将达1000万，因此形式非常严峻。HIV感染诊断进而识别出早期感染的人群是AIDS预防控制工作的首要任务。因此，建立敏感实用的检测方法对于检测、诊断或血液筛查，控制艾滋病的流行就显得非常重要。目前检测HIV的方法有100多种，其中HIV抗体检测的血清学诊断M展最早、最便宜和最简单的HIV感染分析方法。最常用的检测HIV抗体的方法有酶联免疫试验(ELISA)、明胶颗粒凝集i緣(PA)、免疫荧光分析(IFA)和斑点印迹等。其中ELISA由于具有操作简单、快速、适合大量样品的筛选和检测等优点，是目前临床上通用的初筛检测方法。但由于其灵敏度低从而受到了限制，后来又a了灵敏度较高的化学发光免疫分析方法。这些方法在检测HIV抗体的原理上大多应用的是双抗原夹心法，这种方法具有很好的特异性，在方法学上也具有很大的优势。但当前检测HIV抗体的方法均是将HIV重组抗原通过物理吸附的方法直接包被在固相栽体，然后通过洗涤除去未结合上去的分析物或样品基质。这种直接包被方法会对分析参数有一些影响(1)抗原通过物理吸附作用直接包被在固相上，会引起抗原在固相上结合的不均一性，因此，重现性差，温育时间长；(2)与在液相中抗原-抗体的结合反应不同，包被在固相上的蛋白(抗体或抗原)，其结合位点更不易被接近，因此会导致蛋白的免疫活性部分失活，有时活性甚至只达到包被蛋白量的10%左右；(3)结合到固相上抗原的量不仅与抗原自身的性质诸如疏水性、等电点等有关，还受抗原溶液的配制及保存等外在条件的影响。而本发明采用抗-FITC抗体与FITC标记的HIV抗原将HIV抗原结合到固相栽体上，从而克服了物理吸附法直接包被HIV抗原的许多缺点。近十年来标记免疫分析技术的研究和应用发展迅速，已广泛应用于生物医学基础理论研究及临床疾病诊断各领域。其中技术工艺成熟，具有先进性且实用性强，易于推广的主要有放射免疫分析、酶免疫分析、时间分辨焚光免疫分析和化学发光免疫分析等四种。这些超微量检测技术的基本理论大体相同，它们的共同特点是灵敏度好、特异性强；不同之处是所用示踪剂及所发出的信号各异。根据大量的实验结果及临床应用资料，从实用性、稳定性、准确性及发展前景来看，依次为化学发光免疫分析、时间分辨荧光免疫分析、放射免疫分析以及酶免疫分析。放射免疫分析法存在诸多缺点，如操作复杂、测定结果不稳定、试剂保存时间短、放射性污染、仪器昂贵等。然而，现有技术中的化学发光免疫分析试剂盒均为封闭式全自动化学发光测量系统，需要昂贵的全自动化学发光测量仪，从而限制了推广使用，无法有效广泛地应用于临床诊断和科研工作。
发明内容为了解决上述问题提出并完成了本发明。具体地，本发明解决了现有技术中的诊断试剂盒均一性、重现性差等问题。本发明的目的是提供一种人类免疫缺陷病毒(HIV)抗体化学发光免疫分析诊断试剂盒。本发明的再一目的是提供一种制备上述试剂盒的方法。根据本发明的HIV抗体诊断试剂盒包括以下组分1)抗-FITC抗体包被的固相栽体；2)FITC标记的HIV重组抗原；3)酶标记的HIV抗原；4)上述酶所作用的化学发光底物；以及5)阴性对照液，所述阴性对照液为正常人血清。6)阳性对照液，所述阳性对照液为新生牛血清稀释的阳性混合浆。其中，所述固相栽体为微:JU1、塑料珠、塑料管或磁汰颗粒。所述酶为碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。上述酶所作用的化学发光底物为(金刚烷)-l，2-二氧乙烷、3-(2'-螺旋金刚烷)-4-曱氧基-4-(3"-磷酰ltJ0苯基-l,2-二氧乙烷、CSPD或CDP-Star、鲁米诺或异鲁米诺。此外，所述HIV重组抗原为gp41，gp^0，gp36。本发明还提供了一种制备上述试剂盒的方法，该方法包括以下步骤1)以抗-FITC抗体包被的固相载体；2)用FITC标记HIV重组抗原，获得FITC标记的HIV重组抗原；3)用酶标记HIV抗原，获得酶标记的HIV抗原；4)分装上述获得的FITC标记的HIV重组抗原、酶标记的HIV抗原、该酶所作用的化学发光底物、作为阴性对照液的正常人血清、和作为阳性对照液的新生牛血清稀释的阳性混合浆；以及5)组装为成品。其中，通过以下方法用抗-FITC抗体包被的固相栽体l)将包被用抗-FITC抗体加到pH-4.45.0、优选4.8的柠檬酸盐緩冲溶液中混匀，用所得混合液包被固相栽体；2)洗涤步骤l)中包被的固相栽体；以及3)使用牛血清白蛋白封闭经洗涤的固相栽体。根据本发明的方法，其中，所述固相载体为微孔板、塑料珠、塑料管或磁性颗粒。所述酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。该酶所作用的化学发光底物可以为(金刚烷)-1，2-二氧乙烷、3-(2'-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3"-磷酰氧基)苯基-1,2-二氧乙烷、CSPD或CDP-Star、鲁米诺或异鲁米诺。本发明的试剂盒可以采用如下具体形式，其包括抗-FITC抗体包被的96孔或48孔不透明微孔板、FITC标记的gp41、gpl20和gp36重组抗原、辣根过氧化物酶标记的HIV重组抗原、正常人血清的阴性对照液、样品稀释液为pH7.4的0.1MTris-HCl緩冲液+0.1%BSA+0.1%Proclin300、新生牛血清稀释的阳性混合浆、20倍浓缩洗涤液为含有10%生理盐水的pH8.5的2MTris-HCl緩沖液、化学发光底物A、B液分别为鲁米诺溶液、过氧化氢及其特效增强剂(对^f典苯酚)溶液，各1瓶。根据本发明，当使用二抗体系如FITC与抗-FITC抗体体系固定蛋白时，固定抗原蛋白的免疫活性在很大程度上可以得到保存。一个抗-FITC抗体分子也可以结合3~4个FITC分子，并且特异性和亲和力都很强。两者一经结合就极为稳定。FITC-抗-FITC抗体系统作为固相时，在固相上先预包被抗-FITC抗体，通过FITC-抗-FITC抗体反应而使FITC标记的HIV抗原固相化。这种包被方法不仅可增加固相载体上的抗原量，而且还可以使抗原上的结合点充分暴露。因此，使用二抗体系作为固相，不但会提高分析的灵敏度，均一性和重现性，还可以减少HIV重组抗原的使用量。并且抗-FITC抗体的包被微孔板可以作为统一的固相载体应用于许多分析4企测对象。根据本发明的试剂盒采用二抗体系作为固相载体，双抗原夹心模式原理，高灵敏度的鲁米诺-过氧化氢-辣根过氧化物酶及其增强剂的化学发光体系作为信号检测体系，建立了一种高灵敏、低成本的二抗固相化学发光免疫分析方法，并制备成测定血液或血浆中人类免疫缺陷病毒(HIV)抗体的诊断试剂盒，与ELISA检测试剂盒相比，灵敏度提高了约100倍；与已有的化学发光免疫分析检测方法相比，可以提高分析的灵敏度，均一性和重现性，减少HIV重组抗原的使用量。这种检测方法能在抗体产生初期即检出极微量的病毒抗体，比传统的酶联法检测可提前数天诊断，对降低死亡率以及减少疾病传播率都有十分重要的意义。使用本发明的试剂盒降低了成本，也使人们有限的健康投资得到更有效的利用。图1是本发明人类免疫缺陷病毒(HIV)抗体化学发光免疫分析诊断试剂盒所采用的测定原理示意图。图2是本发明的化学发光免疫分析试剂盒测定HIV抗体与ELISA方法测定结果比较图，其中，横坐标X为ELISA试剂盒测定样品的OD值；纵坐标Y为本发明化学发光免疫分析试剂盒测定HIV抗体样品的RLU值；两种方法的直线方程y=567374x+31583，相关系数r=0.9758。具体实施例方式实施例1制备本发明的HIV抗体诊断试剂盒本发明的HIV抗体诊断试剂盒包括1)抗-FITC抗体预包被的96孔或48孔发光微孔板；2)FITC标记的gp41、gpl20、gp36HIV重组抗原；3)辣#>过氧化物酶标记的HIV重组抗原；4)阴性对照液为正常人血清；5)阳性对照液为新生牛血清稀释的阳性混合浆；6)样品稀释液为0.1MTris-HCl緩沖液、0.1%BSA、和0.1%Proclin300,pH7.4;7)20倍浓缩洗涤液为含有10%生理盐水的2MTris-HCl緩沖液，pH=8.5;8)化学发光底物A、B液分别为鲁米诺溶液、过氧化氢及特效增强剂(对碘苯酚)溶液。通过以下方法制备上述试剂盒1、将包被用抗-FITC抗体加到柠檬酸盐緩冲溶液(pH-4.8)中混匀，加至发光微孔板孔中，每孔100nL,4'C放置15h包被。用洗涤液洗涤五次之后，使用牛血清白蛋白(BSA)溶液室温封闭2小时。弃去孔内液体，干燥酶标板，密封，即完成预包被酶联板的制备。2、用直接标记法将FITC与HIV重组抗原进行标记，即得FITC标记的HIV重组抗原。直接标记法具体步骤如下(I)A液取重组蛋白HIV抗原1mg置50mMpH9.3的Na2C03-NaHC03緩冲液中4。C透析24h,最后体积控制在200pi之内。(II)B液取FITC(北京欣经科生物技术公司)2mg溶于1ml50mMpH9.3的Na2C03-NaHC03緩冲液中。(III)将A液置于磁力搅拌器，取B液25pl緩緩滴加至A液中，约在5-8分钟间加完，防止出现气泡，然后置4。C搅拌12-16小时。(W)将反应液取出于10000转/分的速度离心20分钟。除去微量沉淀物，上清液装透析袋，置10mMpH=7.4的PBS溶液中透析4天，每天更换透析液2次。(V)离心去沉淀物，将标记物稀释至lml，加入适量NaN3，分装，-20°C下保存。3、利用改良的过*舆酸钠法，将标记用HlV重组抗原与l^f艮过氧化物酶结合在一起，即得辣根过氧化物酶标记的HIV抗原标记物。改良的过碘酸钠法的具体步骤如下(I)称取2mgHRP溶于lml双蒸水中。(II)加入200W新配置的0.1mol/L的Nal04溶液，室温中轻轻搅拌20分钟。溶液呈棕绿色。(III)用pH=4.4的0.001mol/L的醋酸钠緩冲溶液于4'C下透析过夜。(IV)加入20pl0.2mol/LNa2C03緩冲液，使溶液pH提升至约9.0-9.5。(V)用0.01mol/L,pH=9.5的碳酸盐緩冲液将HCV抗原调配成8mg/ml的浓度。并将抗原溶液緩慢加入等体积的上述HRP溶液中，室温搅拌2小时。(VI)加入新鲜配置的4mg/ml的硼酸钠溶液，置于4°C中2小时。(VII)于4。C,在0.1mol/L的硼酸钠緩冲液中透析24小时，其间更换緩冲液3次。(VHl)加入等量60。/o中性甘油溶液，混匀后分装，-20°C下保存。4、通过实验选择最佳的对照品，阴性对照液为正常人血清、阳性对照液为新生牛血清稀释的阳性混合浆。5、配制试剂盒其他组分20倍浓缩洗涤液(含有10%生理盐水的2MTris-HCl緩冲液，pH=8.5)、样品稀释液(O.lMTris-HCl緩冲液，0.1%水凝胶，0.1%Proclin300,pH7.4)、化学发光底物A、B液分别为鲁米诺溶液、过氧化氬及其特效增强剂(对碘苯酚)溶液。6、鉴定该方法制成试剂盒的准确度、灵敏度、精密度和稳定性合格。7、才艮据试剂盒的需要量将这些组分分装在小^f瓦中，组装为成品。实施例2制备本发明的HIV抗体诊断试剂盒除以塑料珠作为栽体、以碱性磷酸酶标记HIV重组抗原、以AMPPD作为化学发光底物、以及包被过程中所用的柠檬酸盐緩冲溶液的pH为4.5外，以与实施例1相同的方法制备本发明的试剂盒。实施例3本发明试剂盒的使用方法1、自4'C水箱中取出试剂盒，室温平衡20分钟，取一瓶浓缩洗液，加蒸馏水(lml+19ml)备用。2、将发光板从密封袋中取出，将100^LFITC标记的HIV重組抗原溶液(1:2000)加入到包被有抗-FITC抗体的酶标板中，37。C下温育1小时。3、弃去各孔内液体，将洗涤液注满各孔，静置10-20秒，甩掉洗涤液；重复洗板，最后在干净的吸水纸上拍干。4、设空白对照一孔，不加样本溶液，设阴性对照3孔，阳性对照2孔，取阴性对照液、阳性对照液和样本溶液各50于相对应板孔中，再加入酶标记物50[U，微量振荡器充分振荡混匀，用不干胶片封盖反应板，然后置反应板37。C温育30分钟。5、小心甩去反应液，然后洗涤五次同步骤3。6、使用前5分钟将发光底物A液与B液100:1混合后，依次在每孔中加入50^iL化学发光底物，室温避光反应10分钟后，对发光强度进行测量。7、根据样品测定RLU值与临界值的比较来判定结果，临界值=2.1倍的阴性对照孔平均RLU值，若样品RLIO临界值，则为阳性反应；若样品RLIK临界值，则为阴性反应。实施例4本发明试剂盒的性能检测我们对本发明试剂盒与直接将HIV抗原包被于固相微孔板的化学发光免疫分析试剂盒从成本和精密度两个方面进行了初步比较。结果如表l和2所示，结果表明，使用二抗体系作为固相，其HIV重组抗原的使用量可以减少大约4倍，精密度大大提高。另外，抗-FITC抗体包被的微孔板提供了一个通用的固相栽体，它们可以用于许多待测物的分析，避免了固相载体条件繁瑣的优化过程。本发明试剂盒检测的准确性用最新的国家标准参考品血清盘检测(如表3)，考察阴性及阳性参考品的符合率，根据国家标准，要求20份阴性参考品阴性率不小于18/20,20份阳性参考品阳性率不低于20/20,且12号阳性参考血清测值〉11号阳性参考血清测值。本发明试剂盒还接受了临床考核。以人类免疫缺陷病毒(HIV)抗体化学发光免疫分析诊断试剂盒对223例确诊艾滋病人血清进行了抗体检测，并与胶体硒法及AKZO公司Anti-HIVI/II-ELISA作对比，结果表明(表4)本发明的试剂盒阳性测定检出率优于AKZO-HIVI/II-ELISA试剂盒，远高于HIVI/II胶体硒试剂盒。另夕卜，取经过HIVI/II胶体硒试剂盒筛选的210例HIV疑似病人全部为阴性的血样，经过本发明的试剂盒及AKZO酶联试剂盒复检，阳性例数均为12例。我们将本发明的试剂盒与其他检测方法从灵敏度及特异性进行了比较，结果表明(表5)，本试剂盒的灵敏度优于其他方法，特异性也较好。表1种不同固相包被方法HIV重组抗原使用量的比较<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>表2两种不同固相包被方法化学发光免疫分析试剂盒精密度的比较<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>表3本试剂盒国家参考品血清的检测结果_<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>表4本发明试剂盒检测HIV血清样品与ELISA及胶体硒测定结果比较<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>由此我们认为本发明试剂盒灵敏度高、特异性好、完全可应用于对艾滋病人的临床诊断。权利要求1、人类免疫缺陷病毒抗体化学发光免疫分析诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括1)抗-FITC抗体包被的固相载体；2)FITC标记的HIV重组抗原；3)酶标记的HIV抗原；4)上述酶所作用的化学发光底物；以及5)阴性对照，所述阴性对照液为正常人血清。6)阳性对照，所述阳性对照液为新生牛血清稀释的阳性混合浆。2、如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述固相栽体为微孔板、塑料珠、塑料管或磁性颗粒。3、如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。4、如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述化学发光底物为1,2-二氧乙烷类衍生物、鲁米诺或异鲁米诺。5、如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述1,2-二氧乙烷类衍生物为(金刚烷)-l，2-二氧乙烷、3-(2'-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3"-磷酰氧基)笨基-1,2-二氧乙烷、CSPD或CDP-Star。6、如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述HIV重组抗原为gp41、gpl20或gp36。7、一种制备权利要求1所述试剂盒的方法，其特征在于包括以下步骤1)以抗-FITC抗体包被固相载体，获得抗-FITC抗体包被的固相载体；2)用FITC标记HIV重组抗原，获得FITC标记的HIV重组抗原；3)用酶标记HIV抗原，获得酶标记的HIV抗原；4)分装上述获得的FITC标记的HIV重组抗原、酶标记的HIV抗原、以及该酶所作用的化学发光底物、作为阴性对照液的正常人血清、和作为阳性对照液的新生牛血清稀释的阳性混合浆；以及5)组装为成品。8、如权利要求7所述的方法，其特征在于，通过以下方法包被固相载体l)将包被用抗-FITC抗体加到pH=4.4~5.0的柠檬酸盐緩冲溶液中混匀，然后用所得混合液包被固相载体；2)洗涤被包被的固相载体；以及3)使用牛血清白蛋白封闭上述经洗涤的载体。9、如权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述固相载体为微孔板、塑料珠、塑料管或磁性颗粒。10、如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述酶为碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。11、如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述化学发光底物为1，2-二氧乙烷类衍生物、鲁米诺或异鲁米诺。12、如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述1,2-二氧乙烷类衍生物为(金刚烷)-l,2-二氧乙烷、3-(2'-螺旋金刚烷)-4-曱氧基-4-(3"-磷酰氧基)苯基-l，2-二氧乙烷、CSPD或CDP-Star。全文摘要本发明涉及免疫分析医学领域，具体地，本发明提供了一种人类免疫缺陷病毒抗体化学发光免疫分析诊断试剂盒及其制备方法。本发明的试剂盒包括抗-FITC抗体包被的固相载体、FITC标记的HIV重组抗原、酶标记的HIV抗原、上述酶所作用的化学发光底物、以及阴性和阳性对照液。制备上述试剂盒的方法包括以下步骤1)以抗-FITC抗体包被的固相载体；2)用FITC标记HIV重组抗原，获得FITC标记的HIV重组抗原；3)用酶标记HIV抗原，获得酶标记的HIV抗原；4)分装和组装。本发明的试剂盒成本低、灵敏度高，与已有的化学发光免疫分析检测方法相比，可以提高分析的灵敏度，重现性，减少使用重组抗原的量。文档编号G01N33/569GK101178404SQ200610114489公开日2008年5月14日申请日期2006年11月10日优先权日2006年11月10日发明者应希堂,胡国茂,詹先发申请人:北京科美东雅生物技术有限公司