专利名称：血型a抗原表位模拟多肽及其筛选方法
技术领域：
本发明涉及多肽生物技术领域，具体地说是血型A抗原表位模拟多肽及其筛选方法。
背景技术：
A血型抗原的化学结构属于糖蛋白，它们的结构主要涉及到两个分离座位的基因；H座位基因和A座位的基因，这些基因不直接产生抗原，而是产生糖基转移酶，糖基转移酶决定了A血型抗原的特异性。因此糖基转移酶是基因的直接产物，而血型抗原决定簇的单糖或寡糖是基因的间接产物。A血型的抗原决定簇是连接在血型物质的多聚糖前体或称为载体链上。血型物质的前体是多糖结构。目前认为A血型的抗原决定簇是低聚糖链结构，但其确切结构还不是很清楚。人体中ABO抗原广泛存在于多种细胞的细胞膜上以及体液和分泌液中。正常情况下，每个个体可针对自已缺乏的A、B和H抗原，自然产生相对的特异性抗体。A型的抗-B和B型的抗-A主要是IgM类抗体，O型的抗-A、抗-B和抗-A、B通常是IgG类抗体。ABO抗体是移植排斥反应的重要参与者。
噬菌体展示技术是后基因组时代蛋白质研究的重要工具。噬菌体展示技术的优越性在于外源多肽被展示于噬菌体表面的衣壳蛋白上；所展示外源蛋白或多肽的基因型和表型在单个噬菌体中得到统一；筛选的高效性；操作过程简单；耗费低廉。这项技术自确立以来已广泛用于对蛋白质和(或)非蛋白质之间配体-受体相互作用位点的研究。在抗原表位、细胞内信号分子相互作用残基的发现以及药物筛选等方面应用十分广泛。有学者甚至认为噬菌体展示文库中的随机多肽库的应用范围仅仅受到人的想象力的限制。本技术利用噬菌体展示的多肽模拟天然存在的抗原表位，其中具有相同抗原表位特性而又与天然抗原表位在成分或结构序列上不同的多肽被成为模拟表位(mimotope)。具有模拟抗原表位特性的噬菌体展示技术被广泛用于模拟存在于糖蛋白、多糖等成分中抗原表位。
目前在临床移植治疗中由于缺乏合适的供体，因此发展组织ABO不相容器官移植成为必要。为了降低抗体介导的超急性、急性排斥反应，就需要首先用血浆置换的方法去除ABO抗体。同时对受着血浆抗-A/B抗体水平的检测也显得尤为重要。基于血型抗原的抗体特异性亲和滤除是减少血浆中抗体的最有效办法。另外，目前所采用的血型抗体鉴定方法多是试管法，用目测来判断结果，主观因素影响程度高，检测结果难以统一标准化。另外凝集反应主要是检测IgM，而IgG的检测仍是一个挑战。采用包被血型抗原检测抗体的ELISA方法则可以解决这些问题(Rieben，1997；Galili，2002)，并且ELISA方法敏感度高，可以充分利用ELISA自动检测系统从而节省资源。由于目前在亲和滤除血型抗体和抗体检测试验中所用的ABO抗原都是天然来源，或人工合成的寡糖成分，这些抗原存在来源不足，纯度不高，不易于保存等缺点。
发明内容
本发明目的就是利用血型A单克隆抗体筛选噬菌体随机十二肽库以获得血型A抗原表位的模拟多肽，从而提供血型A抗原的表位模拟多肽以及提供一种血型抗原表位模拟多肽的筛选方法。
本发明所述的两种血型A抗原表位模拟多肽分别有如下氨基酸序列 Glu-Tyr-Trp-Tyr-Cys-Gly-Met-Asn-Arg-Thr-Gly-Cys 或Gln-Ile-Trp-Tyr-Glu-Arg-Thr-Leu-Pro-Phe-Thr-Phe 本发明的筛选方法为 (1)、用NaHCO3缓冲液稀释血型A抗原特异性的单克隆抗体NAM87-1F6并包被ELISA板，置于湿盒中4℃孵育16小时； (2)、用封闭缓冲液室温封闭，用含吐温20的TBS洗涤缓冲液进行洗涤； (3)、向包被有单克隆抗体的微孔中加入筛选用噬菌体，缓慢震摇使噬菌体与包被抗体充分接触，用含吐温20的TBS洗涤去除未结合的噬菌体； (4)、用甘氨酸-盐酸缓冲液室温洗脱结合的噬菌体，中和后在宿主菌ER2738中扩增噬菌体，作为下一轮筛选的投入物，同时测定洗脱物和投入物的滴度； (5)、重复上述步骤共进行三轮筛选，从第三轮筛选后的洗脱物滴定平板中随机挑选32个噬菌体克隆，进行噬菌体ELISA、噬菌体微筛选，得到本发明物，并采用DNA测序和噬菌体凝集抑制实验等方法分析。
本发明所述的血型A抗原表位模拟肽的筛选方法，通过改变每轮筛选中包被抗体量、封闭物、噬菌体与抗体的孵育时间以及TBST溶液(TBS+Tween20)中Tween20的浓度使噬菌体随机肽库中与抗体结合的阳性噬菌体递增。具体为第一、二、三轮筛选时抗体包被量分别为10μg、7.5μg、5μg；封闭物分别为牛血清白蛋白(BSA)、明胶、牛血清白蛋白；噬菌体与抗体孵育时间分别为60min、30min、30min；Tween20浓度为0.1％、0.5％、0.5％。
本发明的血型A抗原表位模拟多肽可以用于血型A抗体的检测和血型A抗体的亲合滤除。
本发明所述的筛选方法另一个特点是选用了噬菌体展示随机十二肽库，这样筛选到的噬菌体多肽为十二个氨基酸的序列。之所以选用噬菌体随机十二肽库是因为十二肽足以模拟构像性和线性抗原表位。
本发明所述的噬菌体ELISA方法是用噬菌体包被微孔板鉴定噬菌体与血型A抗原特异性抗体的结合，这与肽库的筛选过程相反，反方向证明噬菌体展示多肽与血型A抗原特异性抗体的特异性结合能力。
本发明所述的噬菌体微筛选方法分别采用单个噬菌体克隆与包被的血型A抗原特异性抗体结合，TBST反复洗涤后，用甘氨酸-盐酸缓冲液(pH2.2)洗脱结合的噬菌体并测定滴度。用噬菌体原肽库作为阴性对照。阳性噬菌体克隆的洗脱物滴度明显高于阴性对照中洗脱物滴度。表明单克隆噬菌体能与血型A抗原特异性抗体结合。
本发明所述的噬菌体凝集抑制实验采用不同浓度的单克隆噬菌体与血型A抗原特异性抗体预先孵育，用此孵育过的抗体与A型洗涤红细胞进行凝集实验。噬菌体原肽库作为阴性对照。直接证明噬菌体展示多肽与天然血型A抗原的交叉反应现象。
图1.ELISA检测各个噬菌体克隆与血型A抗原特异性单克隆抗体结合的结果 图2.噬菌体微筛选检测各个噬菌体克隆与血型A抗原特异性单克隆抗体结合的结果 图3.凝集抑制试验检测噬菌体克隆对血型单克隆抗体凝集A型红细胞的抑制作用的结果TU噬菌体转导单位
具体实施例方式 1.主要材料及其来源 1)血型A抗原单克隆抗体(cloneNaM87-1F6)购自美国BD公司。
2)噬菌体展示随机12肽库源自美国NEB公司。
3)ELISA微孔板购自德国Greiner公司。
4)生物素标记羊抗鼠IgG二抗，辣根过氧化物酶标记亲和素购自北京中杉。
5)其它试剂均为国产分析纯。
2.方法与结果 1)噬菌体肽库的筛选 0.1M NaHCO3(pH8.6)稀释抗体NAM87-1F6，50μl包被一ELISA微孔。溶于0.1M NaHCO3(pH8.6)缓冲液的5mg/mlBSA同时包被一孔作对照。包被微孔置于湿盒中4℃孵育16小时。含5mg/ml BSA的0.1M NaHCO3(pH8.6)缓冲液室温封闭1h后用TBS和Tween20的混合液(TBST)洗涤微孔。
预先将含1mg/ml BSA的TBST与一定量的文库(或者第一，二轮筛选的洗脱扩增物)噬菌体室温孵育1h，然后投入到包被的ELISA微孔中，室温振荡孵育一定时间。TBST洗涤10次。加入0.2mol/L的甘氨酸-盐酸(含1mg/ml BSA，pH2.2)洗脱液振荡孵育10min，取出洗脱液并加入1mol/L Tris-HCl(pH9.1)中和液中和。取1μl中和液测定噬菌体滴度，其余加入准备好的宿主菌ER.2738中扩增并用PEG/NaCl纯化。总共进行三轮筛选第一轮筛选包被10μg抗体，TBST中Tween20浓度为0.1％(v/v)，噬菌体与包被抗体的孵育时间为1h；第二轮筛选中用明胶代替BSA封闭ELISA微孔和稀释噬菌体，另外在第二，三轮筛选中分别包被7.5μg、5μg抗体，TBST中Tween20浓度为0.5％(v/v)，噬菌体与包被抗体的孵育时间为30min。第三轮筛选后的洗脱物中和液只测定滴度。从滴度平板中随机挑取32个噬菌体克隆进行扩增、纯化并测定滴度。在第二轮筛选的靶分子较第一轮筛选的靶分子少，变换封闭物且孵育时间减半和洗涤液Tween20浓度提高了5倍的情况下富集率(产出/投入值)较第一轮降低近5.7倍。在接下来的第三轮筛选中靶分子量再次降低，富集率较第二轮提高近53倍(表1)。
表1.三轮筛选投入、产出及富集率情况 2)噬菌体ELISA 5×1010TU/ml噬菌体(溶于TBS)包被ELISA微孔，湿盒中4℃过夜。第二天TBST(含0.5％Tween 20)洗涤5次，每孔加入0.5μg抗体NaM87-1F6，37℃孵育1h后，TBST洗涤10次。每孔加入1∶5000稀释的HRP标记亲和素，37℃孵育30min后，TBST洗涤10次。以TMB(3，3′，5，5′-四甲基联苯胺)为底物显色，测定A450nm。每个克隆包被两孔。噬菌体原肽库作为阴性对照。随机挑取的32个噬菌体克隆与抗体结合后检测A值加图1。
3)噬菌体微筛选(micropanning) 抗体NAM87-1F60.25μg/孔包被ELISA平板，4℃湿盒中过夜。TBST洗涤5次。5mg/ml BSA封闭微孔。5×104TU/孔加入噬菌体，37℃震摇4h，湿盒中室温反应约2h。TBST洗涤10次。加入洗脱液室温震摇8min。取出洗脱物加入中和液中和，并测定滴度。原肽库扩增的噬菌体和不包被抗体的BSA封闭孔作为对照。噬菌体ELISA信号较强的11个克隆中有7个克隆在本实验后得到较高的噬菌体滴度。(图2) 4)噬菌体DNA序列的测定，以及展示多肽的推导提取单克隆噬菌体的基因组DNA。10μl送Ivitrogen公司测序，测序引物为CCC TCA TAG TTA GCG TAA CG。用DNAStar软件分析测序获得的噬菌体外源基因，7个噬菌体克隆的序列中有6个完全相同，最后推导出的两个多肽序列如下 1.GAG TAT TGG TAT TGT GGT ATG AAT AGG ACT GGT TGT Glu-Tyr-Trp-Tyr-Cys-Gly-Met-Asn-Arg-Thr-Gly-Cys 2.CAG ATT TGG TAT GAG AGG ACG CTT CCG TTT ACG TTT Gln-Ile-Trp-Tyr-Glu-Arg-Thr-Leu-Pro-Phe-Thr-Phe 5)噬菌体竞争凝集抑制试验 在BD公司抗体凝集试验说明书的基础上略有改动。1∶100稀释的抗体NAM87-1F6与不同量的单克隆噬菌体(0TU、108TU、1010TU)于37℃孵育30min后加入1％悬浮洗涤红细胞，37℃孵育4h。原肽库的扩增物作为阴性对照。取10μl涂片，显微镜下观察凝集现象。结果显示两种克隆的噬菌体都可以对抗体的凝集反应产生明显的抑制作用(图3)。
氨基酸序列表
<110>胡丽华，汤兆明
<120>血型A抗原模拟多肽及其筛选方法
<130>patentl
<140>2007-04-24
<141>2007-04-24
<160>2
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>12
<212>PRT
<213>人工(Artificial)
<400>1
Glu Tyr Trp Tyr Cys Gly Met Asn Arg Thr Gly Cys
1 5 10
<210>2
<211>12
<212>PRT
<213>人工(Artificial)
<400>2
Gln Ile Trp Tyr Glu Arg Thr Leu Pro Phe Thr Phe
1 5 10
权利要求
1、一种血型A抗原表位模拟多肽，其氨基酸序列为
Glu-Tyr-Trp-Tyr-Cys-Gly-Met-Asn-Arg-Thr-Gly-Cys
或Gln-Ile-Trp-Tyr-Glu-Arg-Thr-Leu-Pro-Phe-Thr-Phe。
2、血型A抗原表位模拟多肽的筛选方法，它包括以下步骤
(1)、用NaHCO3缓冲液稀释血型A抗原特异性的单克隆抗体NAM87-1F6，并包被ELISA板；
(2)、用封闭缓冲液室温封闭，用TBS和Tween20的混合液进行洗涤；
(3)、向包被有单克隆抗体的微孔中加入筛选用噬菌体，缓慢振摇，使噬菌体与包被抗体充分接触，用TBS和Tween20的混合液洗涤去除未结合的噬菌体；
(4)、用甘氨酸-盐酸缓冲液室温洗脱结合的噬菌体，中和液中和后在宿主菌ER2738中扩增噬菌体，作为下一轮筛选的投入物，同时测定洗脱物和投入物的滴度；
(5)、重复上述步骤共进行三轮筛选，从第三轮筛选后的洗脱物滴定平板中随机挑选32个噬菌体克隆，进行噬菌体ELISA、噬菌体微筛选，得到本发明物。
3、根据权利要求2所述的血型A抗原表位模拟多肽的筛选方法，其特征在于第一、二、三轮筛选中包被用抗体的量依次为10μg、7.5μg、5μg，Tween20的浓度依次为0.1％、0.5％、0.5％，ELISA微孔中的封闭依次为牛血清白蛋白、明胶、牛血清白蛋白。
4、血型A抗原表位模拟多肽用于制备多肽制剂的用途，其特征是将血型A抗原模拟多肽用于血型A抗体的检测和血型A抗体的亲合滤除。
全文摘要
本发明公开了一种血型A抗原表位模拟多肽及其筛选方法。其氨基酸序列为Glu-Tyr-Trp-Tyr-Cys-Gly-Met-Asn-Arg-Thr-Gly-Cys或Gln-Ile-Trp-Tyr-Glu-Arg-Thr-Leu-Pro-Phe-Thr-Phe。其筛选方法是用NaHCO3缓冲液稀释血型A抗原特异性的单克隆抗体并包被ELISA板；向包被有单克隆抗体的微孔中加入筛选用噬菌体，用甘氨酸-盐酸缓冲液室温洗脱结合的噬菌体，中和后在宿主菌ER2738中扩增噬菌体，作为下一轮筛选的投入物，共进行三轮筛选，对第三轮筛选后挑取的32个噬菌体克隆进行进一步鉴定后得到本发明物。它可以用于血型A抗体的检测和血型A抗体的亲合滤除。
文档编号G01N33/80GK101096381SQ200710052419
公开日2008年1月2日 申请日期2007年6月4日 优先权日2007年6月4日
发明者胡丽华, 汤兆明, 李一荣, 崔天盆 申请人:胡丽华, 汤兆明