专利名称：定量检测小颗粒低密度脂蛋白的方法
技术领域：
本发明涉及分级定量检测小颗粒低密度脂蛋白的方法，其对于动脉硬化的临床诊断是重要的。
背景技术：
低密度脂蛋白(LDS)在血液中胆固醇运输中起重要作用并且是动脉硬化的危险因素。公知小颗粒低密度脂蛋白(下文中“小颗粒LDL”)在LDL中颗粒尤其小并且比标准LDL密度更高，并且与正常LDL相比，使动脉硬化的危险性增加数倍。小颗粒LDL的增加是动脉硬化的主要危险因素之一。分级检测小颗粒LDL在临床上非常重要。
检测小颗粒LDL的常规方法使用超速离心、电泳、高速液相层析，等等。超速离心方法通过使用密度的不同分离小颗粒LDL，并检测其中的胆固醇和蛋白质的量。小颗粒LDL在1.040到1.063之间的密度被分级分离(Atherosclerosis，48，33-49页，1993Atherosclerosis，106，241-253页，1994，等)。然而，该方法需要昂贵的设施，并且检测很耗时。电泳方法使用聚丙烯酰胺凝胶检测LDL的运动性和颗粒直径。小颗粒LDL的颗粒大小低于25.5nm(JAMA，260，1917-21页，1988，等)，并且LDL的相对运动性(从VLDL到LDL的移动距离除以从VLDL到HDL的移动距离)不小于0.4(Domyakukoka(alteriosclerosis)，25，67-70页，1997)。然而，这些方法用于检测LDL中小LDL颗粒的程度，并且它们不用于得到定量检测。而且，一次可以试验的样品数受到限制，并且进行检测耗费很长时间。最近，发明了检测脂蛋白的方法。在该方法中，电泳后，对琼脂糖凝胶进行脂质染色，并使用计算机分析染色图案，并得到脂蛋白的定量检测(日本专利公开号2000-356641)。这是用于分析变性LDL，如经氧化的LDL、乙酰化LDL、糖基化LDL、MDA-LDL等的方法。通过该方法不能准确检测小颗粒LDL。因为该分析需要非常昂贵的设备，该方法不适于一般用途。
通常，在HDL的检测中，公知聚阴离子与二价阳离子的组合可用作分离试剂用以通过凝聚不同于HDL的脂蛋白而分离HDL。例如，使用硫酸葡聚糖-Mg2+(Clin.Chem.28，1379-88页，1982，等)、肝素-Mn2+(J Lipid Res.19.65-76页，1978，等)、肝素-Ca2+(Arch.Biochem.Biophys.170，334-40页，1975，等)和磷钨酸-Mg2+(Clin.Chem，23，882-84页，1977，等)的方法等是公知的。此外，已经报导了使用一些分离试剂通过脂蛋白的逐步沉淀计算LDL和VLDL的级分的方法(日本专利公开号7-294532，Rinsho-Byori，特别版21，82，1975，等等)。此外，还报导了使用聚乙二醇分离HDL的方法(Ann.Clin.Biochem.18，177-8l页，1981)。
此外，还有常规方法，如使用多种分离试剂通过脂蛋白的逐步沉淀，基于浊度的不同检测每种脂蛋白的方法(Rinsho-Byori，特别版2l，82，1975，等等)，和根据不同的离子强度悬浮或者溶解小颗粒LDL并通过吸光度的不同检测小颗粒LDL的方法(日本专利公开号2003-28882)。然而，因为检测光吸光度，所以特异性和准确度不足。
专利文件1日本专利公开号2000-356641专利文件2日本专利公开号7-294532专利文件3日本专利公开号2003-28882非专利文件1 Atherosclerosis，48，33-49页，1993非专利文件2 Atherosclerosis，106，241-253页，1994非专利文件3 JAMA，260，1917-21页，1988非专利文件4 Domyakukoka，25，67-70页，1997非专利文件5 Clin.Chem.28，1379-88页，1982非专利文件6 J Lipid Res.19.65-76页，1978非专利文件7 Arch.Biochem.Biophys.170，334-40页，1975非专利文件8 Clin.Chem，23，882-84页，1977非专利文件9 Rinsho-Byori，特别版21，82，1975非专利文件10 Ann.Clin.Biochem.18，177-81页，1981
发明公开本发明的目的是提供分级检测小颗粒LDL的快速而简单的方法。
如上所述，已经报导了在脂蛋白混合物中使用分离试剂如聚阴离子、二价阳离子等凝聚不同于HDL的脂蛋白。脂蛋白混合物中主要级分如VLDL、LDL和HDL由于它们的物理性质的不同可以通过分离试剂分离。然而，还没有尝试通过更简单的方法将LDL分离成亚级分。
本发明人已经广泛研究了分离小颗粒LDL的方法，发现通过用适宜浓度的聚阴离子和二价阳离子的处理试样可以将小颗粒LDL与其他LDL分离。还通过加入作为离子强度调节剂的一价阳离子实现小颗粒LDL的更好的分离。此外，通过使用PEG代替聚阴离子、二价阳离子和一价阳离子得到类似效果。
本发明人已经详细研究了聚阴离子、二价阳离子和一价阳离子联合使用时这些离子的浓度，还研究了使用PEG时PEG的浓度。通过建立所要使用的一系列浓度，他们发现这样的条件，在该条件下通过凝聚不同于小颗粒LDL的LDL将小颗粒LDL与LDL颗粒分离。通过该反应，不同于小颗粒LDL的LDL形成凝结块，其将通过离心或者过滤从反应混合物除去。凝胶块除去后，通过将检测LDL胆固醇的试剂、检测LDL中甘油三酯的试剂，或者抗人脱辅基蛋白质B抗体，可以定量检测小颗粒LDL中胆固醇、甘油三酯或者蛋白质，从而完成了本发明。
与利用离子强度的不同悬浮或者溶解小颗粒LDL后基于吸光度的不同检测小颗粒LDL的上述方法(日本专利公开号2003-28882)相比，本发明在特异性和准确度都更优，因为在分离后检测小颗粒LDL中胆固醇、甘油三酯和蛋白质。
本发明提供了下面的方法和试剂盒(1)定量试样中小颗粒低密度脂蛋白的方法，其包括第一步将小颗粒低密度脂蛋白与其他低密度脂蛋白分离，和第二步检测所分离的小颗粒低密度脂蛋白中胆固醇、甘油三酯或者蛋白质。
(2)根据(1)的方法，其中在第一步中用聚阴离子和二价阳离子将小颗粒低密度脂蛋白与其他低密度脂蛋白分离。
(3)根据(1)或者(2)的方法，其中在第一步中还用一价阳离子将小颗粒低密度脂蛋白与其他低密度脂蛋白分离。
(4)根据(2)或者(3)的方法，其中用于第一步的聚阴离子选自肝素、磷钨酸和硫酸葡聚糖。
(5)根据(2)到(4)任一项的方法，其中用于第一步的二价阳离子选自Mn2+、Mg2+和Ca2+。
(6)根据(3)或者(5)的方法，其中用于第一步的一价阳离子选自Na+、K+和Li+。
(7)根据(4)到(6)任一项的方法，其中当将聚阴离子加入试样中时，该聚阴离子的终浓度对于肝素为10-250U/mL，对于硫酸葡聚糖为0.02-1.25％，对于磷钨酸为0.02-1.25％。
(8)根据(5)到(7)任一项的方法，其中当将二价阳离子加入试样中时，该二价阳离子的终浓度对于Mn2+为2.5-35mmol/L，对于Mg2+为2.5-125mmol/L，对于Ca2+为1-75mmol/L。
(9)根据(6)到(8)任一项的方法，其中当将一价阳离子加入试样中时，该一价阳离子的终浓度为0-50mmol/L。
(10)根据(1)的方法，其中在第一步中用PEG将小颗粒低密度脂蛋白与其他低密度脂蛋白分离。
(11)根据(10)的方法，其中当将PEG加入试样中时，PEG的终浓度为2-5％。
(12)根据(1)到(11)任一项的方法，其中使用用于定量检测低密度脂蛋白中的胆固醇并且不需要分级分离的试剂实施第二步中胆固醇的检测。
(13)根据(1)到(11)任一项的方法，其中使用用于定量检测低密度脂蛋白中的甘油三酯并且不需要分级分离的试剂实施第二步中甘油三酯的检测。
(14)根据(1)到(11)任一项的方法，其中通过使用抗人脱辅基蛋白质B抗体实施第二步中蛋白质的检测。
(15)从试样分离小颗粒低密度脂蛋白的方法，其包括通过向所述试样中加入聚阴离子和二价阳离子沉淀不同于小颗粒低密度脂蛋白的低密度脂蛋白的步骤。
(16)根据(15)的方法，其包括还通过向所述试样中加入一价阳离子沉淀不同于小颗粒低密度脂蛋白的低密度脂蛋白的步骤。
(17)根据(15)或(16)分离小颗粒低密度脂蛋白的方法，其中聚阴离子选自肝素、磷钨酸和硫酸葡聚糖。
(18)根据(15)到(17)任一项分离小颗粒低密度脂蛋白的方法，其中二价阳离子选自Mn2+、Mg2+和Ca2+。
(19)根据(15)到(18)任一项分离小颗粒低密度脂蛋白的方法，其中一价阳离子选自Na+、K+和Li+。
(20)根据(17)到(19)任一项分离小颗粒低密度脂蛋白的方法，其中当将聚阴离子加入试样中时，该聚阴离子的终浓度对于肝素为10-250U/mL，对于硫酸葡聚糖为0.02-1.25％，对于磷钨酸为0.02-1.25％。
(21)根据(18)到(20)任一项分离小颗粒低密度脂蛋白的方法，其中当将二价阳离子加入试样中时，该二价阳离子的终浓度对于Mn2+为2.5-35mmol/L，对于Mg2+为2.5-125mmol/L，对于Ca2+为1-75mmol/L。
(22)根据(19)到(21)任一项分离小颗粒低密度脂蛋白的方法，其中当将一价阳离子加入试样中时，该一价阳离子的终浓度为0-50mmol/L。
(23)从试样分离小颗粒低密度脂蛋白的方法，其包括向所述试样中加入PEG以沉淀不同于小颗粒低密度脂蛋白的低密度脂蛋白的步骤。
(24)根据(23)的分离小颗粒低密度脂蛋白的方法，其中当将PEG加入试样中时，PEG的终浓度为2-5％。
(25)检测小颗粒低密度脂蛋白的试剂盒，其含有包括聚阴离子和二价阳离子的分离试剂；和用于检测低密度脂蛋白的试剂，其中该试剂盒检测小颗粒低密度脂蛋白中的胆固醇、甘油三酯或者蛋白质。
(26)根据(25)的检测小颗粒低密度脂蛋白的试剂盒，其中分离试剂还包括一价阳离子。
(27)检测小颗粒低密度脂蛋白的试剂盒，其含有包括PEG的分离试剂；和用于检测低密度脂蛋白的试剂，其中该试剂盒检测小颗粒低密度脂蛋白中的胆固醇、甘油三酯或者蛋白质。
(28)根据(25)或者(26)的试剂盒，其中聚阴离子选自肝素、磷钨酸和硫酸葡聚糖。
(29)根据(26)或者(28)的试剂盒，其中二价阳离子选自Mn2+、Mg2+和Ca2+并且一价阳离子选自Na+、K+和Li+。
本说明书将日本专利申请号2002-35519的说明书和/或附图的完整内容并入，日本专利申请号2002-35519是本申请的优先权要求的基础。
附图简述
图1阐明了本发明的方法的第一步。
图2阐明了实施例1中本发明的第一步的效果。
图3阐明了实施例2中根据本发明的方法检测的小颗粒LDL中胆固醇的值和通过超速离心方法检测的小颗粒LDL中胆固醇的值之间的关系。
图4阐明了实施例3中根据本发明的方法检测的小颗粒LDL中apoB蛋白质的值和通过超速离心方法检测的小颗粒LDL中apoB蛋白质的值之间的关系。
图5阐明了实施例4中根据本发明的方法检测的小颗粒LDL中胆固醇的值和通过超速离心方法检测的小颗粒LDL中胆固醇的值之间的关系。
图6阐明了实施例5中根据本发明的方法检测的小颗粒LDL中胆固醇的值和通过超速离心方法检测的小颗粒LDL中胆固醇的值之间的关系。
图7阐明了实施例6中根据本发明的方法检测的小颗粒LDL中胆固醇的值和通过超速离心方法检测的小颗粒LDL中胆固醇的值之间的关系。
图8阐明了实施例7中根据本发明的方法检测的小颗粒LDL中胆固醇的值和通过超速离心方法检测的小颗粒LDL中胆固醇的值之间的关系。
图9阐明了实施例8中根据本发明的方法检测的小颗粒LDL中甘油三酯的值和通过超速离心方法检测的小颗粒LDL中甘油三酯的值之间的关系。
图10阐明了实施例9中根据本发明的方法检测的小颗粒LDL中胆固醇的值和通过超速离心方法检测的小颗粒LDL中胆固醇的值之间的关系。
本发明的最佳实施方式将如下详细解释本发明。
本发明的方法包括第一步和第二步。在第一步中，将试样与含有聚阴离子和二价阳离子的分离液体或者与含有聚阴离子、二价阳离子和一价阳离子的另一种分离液体或者与PEG混合。将混合物反应预定时间后，不同于小密度颗粒的VLDLs和LDLs凝聚并通过离心或者过滤除去。在第二步中，检测小颗粒LDL中胆固醇、甘油三酯和蛋白质。在第一步中，除去上面提到的脂蛋白后，HDL以及小颗粒LDL保留在溶液中。然而，通过使用针对LDL的LDL胆固醇检测试剂或者甘油三酯检测试剂，或者通过应用抗人脱辅基蛋白质B抗体，可以仅对小颗粒LDL组分进行分级检测。
如上所述，可以将脂蛋白初步分级分离成VLDL、LDL和HDL，并且可以将LDL亚分级成小颗粒LDL和其他亚级分。小颗粒LDL也被称作SLDL(小LDL)、小致密LDL或者致密LDL，不同于小颗粒LDL的LDL有时也被称作LLDL(大LDL)或者轻LDL。这些级分和亚级分可以基于颗粒大小或者比重区分。颗粒直径大小对于VLDL为30nm-80nm(30nm-75nm)，对于LDL为22nm-28nm(19nm-30nm)，对于HDL为7nm-10nm，尽管它们可以根据研究人员而变。VLDL的密度低于1.006，LDL的为1.019-1.063，HDL的为1.063-1.21。通过梯度凝胶电泳(GGE)(JAMA，260，1917-21页，1988)或者NMR(脂蛋白试验手册，第二版，Nader Rifai等人编著，609-623页，AACC PRESSThe Fats of Life Summer 2002，LVDD 15YEAR ANNIVERSARY ISSUE，卷AVI号3，15-16页)可以检测LDL颗粒的直径，并且可以基于通过超速离心(Atherosclerosis，106，241-253页，1994Atherosclerosis，83，59页，1990)分析确定比重。
本发明中所要检测的小颗粒LDL通常为LDL级分的亚级分，其直径为约22.0nm到约25.5nm，其比重为1.040-1.063。为什么根据颗粒大小将LDL亚分级的原因是LDL中的小LDL需要按级分检测，因为具有小颗粒直径的LDL导致更多动脉硬化并且比其他LDL的恶性更高。因为LDL的直径和比重的分布是连续的，所以不可能确定这样的比重值，其中在该比重值以上恶性明显更高。从而，上述1.040-1.063的比重值不是小颗粒LDL的确定特征，但是它是1.019-1.063的比重范围的中值点，1.019-1.063被广泛使用并且确定为LDL的比重。例如，在不同报导中，小颗粒LDL在1.044-1.069的范围中分级分离(Atherosclerosis106 241-253 1994)。对于怎样设定小颗粒LDL的比重范围在研究人员中存在差异，但是使用任何所选的范围，都发现小颗粒LDL的存在与临床恶性有关。
在本发明中，将小颗粒LDL定义为在LDLs中具有低比重并且比其他LDL具有临床上与动脉硬化更高的关联的LDL。优选地，小颗粒LDL的比重范围大于LDLs的比重范围内的中值点。更优选地，小颗粒LDL是比重在1.040-1.063的LDL。
用于本发明的方法中的试样为血清或者血浆，优选血清。在第一步中，将适宜体积的样品与聚阴离子和二价阳离子或者聚阴离子、二价阳离子和一价阳离子混合，从而阴离子、二价阳离子和一价阳离子的终浓度为预定值。可以在聚阴离子和二价阳离子的存在下将小颗粒LDL与其他LDLs分开，但是通过还存在作为离子强度调节剂的一价阳离子可以实现含有小颗粒LDL和HDL的级分的更好分离。在该步骤中，可以制备含有预定浓度的聚阴离子和二价阳离子的分离溶液，或者含有预定浓度的聚阴离子、二价阳离子和一价阳离子的分离溶液并加入试样中。还可能单独制备预定浓度的聚阴离子、二价阳离子和一价阳离子的溶液并将这些溶液单独加入试样中。这些单独的溶液加入试样中的顺序不受限制。用于制备含有聚阴离子和二价阳离子的溶液或者含有聚阴离子、二价阳离子和一价阳离子的溶液的溶剂可以是纯化水、生理盐水和多种缓冲液。分离溶液的pH优选为3-8。
用于第一步中的聚阴离子优选为肝素、磷钨酸或者硫酸葡聚糖。加入聚阴离子和二价阳离子或者聚阴离子、二价阳离子和一价阳离子到试样中后，聚阴离子的优选终浓度对于肝素为10-250U/mL，对于磷钨酸为0.02-1.25％，对于硫酸葡聚糖为0.02-1.25％。
用于第一步中的二价金属离子可以是Mn2+、Mg2+、Ca2+，或者Co2+，并且优选为Mn2+、Mg2+、Ca2+。向试样中加入聚阴离子和二价阳离子后，二价阳离子的优选终浓度为如果用肝素作为聚阴离子，那么对于Mn2+为7.5-35mmol/L，对于Mg2+为40-125mmol/L，对于Ca2+为50-75mmol/L；如果用磷钨酸作为聚阴离子，那么对于Mn2+为2.5-7.5mmol/L，对于Mg2+为2.5-50mmol/L，对于Ca2+为1-30mmol/L；如果用硫酸葡聚糖作为聚阴离子，那么对于Mn2+为2.5-10mmol/L，对于Mg2+为7.5-30mmol/L，对于Ca2+为5-20mmol/L。
此外，当第一步中使用一价阳离子时，优选使用诸如Na+、K+和Li+的一价金属离子。一价阳离子的优选终浓度为0-50mmol/L。
例如，将100μl试样和100μl含有聚阴离子和二价阳离子的分离试剂，或者含有聚阴离子、二价阳离子和一价阳离子的分离试剂混合。可以调节分离试剂中聚阴离子、二价阳离子和一价阳离子的浓度，从而试样和分离试剂的混合物中聚阴离子、二价阳离子和一价阳离子的浓度为上述终浓度。分离试剂中聚阴离子的浓度优选对于肝素为20-500U/mL，对于磷钨酸为0.04-2.5％，对于硫酸葡聚糖为0.04-2.5％。分离试剂中二价阳离子的优选终浓度为如果用肝素作为聚阴离子，那么对于Mn2+为15-70mmol/L，对于Mg2+为80-250mmol/L，对于Ca2+为100-150mmol/L；如果用磷钨酸作为聚阴离子，那么对于Mn2+为5-15mmol/L，对于Mg2+为5-100mmol/L，对于Ca2+为2-60mmol/L；如果用硫酸葡聚糖作为聚阴离子，那么对于Mn2+为5-20mmol/L，对于Mg2+为15-60mmol/L，对于Ca2+为10-40mmol/L。一价阳离子的优选浓度为0-100mmol/L。
向试样加入聚阴离子和二价阳离子或者聚阴离子、二价阳离子和一价阳离子后，搅拌反应混合物导致第一步反应。
优选在2℃到45℃，更优选地20℃-37℃实施第一步反应。
优选实施第一步反应1分钟到30分钟，更优选5分钟到15分钟。
此外，第一步中聚阴离子、二价阳离子和一价阳离子的最适浓度可以根据所用的聚阴离子、二价阳离子和一价阳离子的类型的联合而变并且还取决于试样的pH、离子强度等等。从而，本发明的第一步反应不一定总是产生相同的比重范围。具体地，不一定得到比重为1.040-1.063的小颗粒LDL。然而，如果用上述浓度实施第一步反应，那么可以得到几乎相等的比重范围的LDL，并且该LDL包括在上面定义的LDL中。此外，上面的描述基于如下想法小颗粒LDL的比重具有1.040-1.063的固定范围，并且即使本发明的第一步中所得LDL的比重稍微在该范围外，差异也不大。该级分仍然含有完整LDLs中的相对的小颗粒LDL。从而本发明的第一步中所得小颗粒LDL的量反应了从其得到试样的患者的动脉硬化的危险性。
通过向试样中加入聚乙二醇(PEG)代替聚阴离子和二价阳离子或者聚阴离子、二价阳离子和一价阳离子实施第一步中含有小颗粒LDL和HDL的级分的分离。这里所用的PEG的分子量优选为4,000-20,000，PEG的终浓度优选为4-10％。
完成第一步反应后，通过离心并收集上清液可以得到含有小颗粒LDL和HDL的级分。离心条件为9,000g-36,000g下1-30分钟。
完成第一步反应后，通过将反应混合物过滤得到作为穿过级分的含有小颗粒LDL和HDL的级分。滤器可以是压力过滤型或者离心过滤型。滤器的孔大小为0.10-0.80微米，例如，可以使用通过商业途径可得到的Milex，Ultrafree(MILLIPORE，Co.)、Ministart(Sartorius，Co.)、DISMIC(ADVANTEC Co.)、HT Tuffryn Acrodisc注射器滤器(PALL Genman Laboratory Co.)等等。
通过检测含有第一步中所得小颗粒LDL和HDL的级分中LDL，就可以检测试样中小颗粒LDL。
通过检测LDL中胆固醇、LDL中甘油三酯或者LDL中apoB蛋白质可以实施LDL检测。
对于第二步，已经报导了不需要分级分离步骤的检测LDL胆固醇的若干方法(日本专利出版物公开号11-318496、2002-202314、10-080300、09-313200、11-155595、日本专利出版物号3256241，等等)，可以优选使用这些方法。
例如，可以根据日本专利出版物公开号11-318496中描绘的方法如下检测含有小颗粒LDL和HDL的第一步中所得级分中的LDL。所述试样是第一步中所得含有小颗粒LDL和HDL的级分，将其在表面活性剂的存在下用胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶处理，所述表面活性剂作用于不同于LDL的脂蛋白。除去该反应中产生的过氧化氢。这些反应从试样(步骤A)除去了不同于LDL的脂蛋白，然后可以检测试样中的残留LDL(步骤B)。作用于不同于LDL的脂蛋白的表面活性剂包括HLB值为13或者更高和15或者更低的聚烷撑氧衍生物。例如，包括聚氧乙烯月桂基醚、聚氧乙烯十六醚、聚氧乙烯油烯基醚、聚氧乙烯高级醇醚、聚氧乙烯辛基苯基醚、聚氧乙烯壬基苯基醚等等，它们是HLB值为13或者更高和15或者更低的化合物。用于步骤A中的上面提到的表面活性剂的优选浓度为约0.1-10g/L，更优选约0.5-5.0g/L。除去过氧化氢的方法包括使用过氧化氢酶将过氧化氢分解为水和氧气的方法，和使用过氧化物酶的方法，通过过氧化物酶，酚或者苯胺氢供体与过氧化氢反应并被转化成无色苯醌，但是不限于这些方法。
步骤A的反应混合物中胆固醇酯酶的优选浓度为约0.2-1.0U/mL，假单胞菌属(Pseudomonas)细菌产生的胆固醇酯酶是有效的。胆固醇氧化酶的优选浓度为约0.1-0.7U/mL，优选使用细菌或者酵母产生的胆固醇氧化酶。此外，过氧化氢酶的优选浓度为约40-100U/mL。此外，过氧化物酶当其用于将过氧化氢转化成无色苯醌时的优选浓度为0.4-1.0U/mL，酚或者苯胺氢供体的优选浓度为0.4-0.8mmol/L。在步骤B中，检测试样中残留胆固醇。例如，通过加入至少作用于LDL的表面活性剂并检测胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶的作用产生的过氧化氢实施测定法。作用于LDL的表面活性剂包括HLB值为11或者更高和13或者更低的聚烷撑氧衍生物。例如，包括聚氧乙烯月桂基醚、聚氧乙烯十六醚、聚氧乙烯油烯基醚、聚氧乙烯高级醇醚、聚氧乙烯辛基苯基醚、聚氧乙烯壬基苯基醚等等，它们是HLB值为11或者更高和13或者更低的化合物。步骤B的优选反应条件类似于步骤A的优选条件。
用于检测LDL的试剂盒是通过商业途径可得到的，并且可以使用这些商业试剂盒检测LDL。例如，可以使用通过商业途径可得到的LDL-EX(N)(DENKA SEIKEN Co.)。
对于第二步，可以用若干种方法检测LDL中的甘油三酯，这些方法不需要分级分离(WO公布号00/43537)，并且可以适宜地使用这些方法。
对于第二步，可以用若干种方法应用抗人apoB抗体(日本专利公布号2638137、日本专利公开号02-64458等)，并且可以适宜地使用这些方法。
本发明包括含有用于第一步(其中分离含有小颗粒LDL的级分)的试剂和用于检测经分离的小颗粒LDL的试剂的试剂盒。该试剂盒可以含有例如，用于检测LDL的上面提到的试剂试剂盒和聚阴离子和二价阳离子(或者含有聚阴离子和二价阳离子的分离试剂)等等。此外，该试剂盒可以含有离心管和小颗粒LDL的分离滤器。该试剂盒除了聚阴离子和二价阳离子之外可以还含有一价阳离子。在该情况中，该试剂盒可以含有分离试剂，其包括聚阴离子、二价阳离子和一价阳离子。此外，该试剂盒可以含有聚乙二醇，其代替聚阴离子和二价阳离子。
将基于下面的实施方案具体解释本发明。然而，本发明不限于下面描述的实施方案。
实施例1对已经通过电泳证实主要含有小颗粒LDL的样品和富含不同于小颗粒LDL的LDLs的其他样品研究第一步的效率。将50μl血清与50μl含有60U/mL肝素溶液和40mmol/L MnCl2的分离溶液混合，并允许反应在25℃持续15分钟。然后以18,500g离心混合物15分钟，回收上清液，并使用通过商业途径可得到的圆盘型聚丙烯酰胺凝胶黄色素细胞比较反应性。将分离溶液和反应前血清用等体积生理盐水稀释后电泳。图1显示了本发明的步骤1中的方法，图2显示结果。图2表明仅正常的LDL被选择性除去。在图2中，1号泳道阐明了反应前富含不同于小颗粒LDL的LDL的样品的电泳结果；2号泳道阐明反应前富含小颗粒LDL的样品的电泳结果；3号泳道阐明了反应后富含不同于小颗粒LDL的LDL的样品的电泳结果；4号泳道阐明反应后富含小颗粒LDL的样品的电泳结果。
实施例2根据本发明的方法检测血清样品中小颗粒LDL并将检测值与通过超速离心方法所得值比较。结果在图3中显示。
将100μl试样与100μl含有300U/mL肝素钠和150mmol/LMgCl2的分离溶液混合并允许在37℃反应10分钟。反应后，以18,500g离心混合物15分钟，回收上清液并通过商业试剂盒LDL-EX(N)(DENKA SEIKEN Co)使用Autoanalyzer(Hitachi 7170)分析小颗粒LDL中的胆固醇。在超速离心方法中，离心受试血清和密度溶液的混合物以回收密度为1.040-1.063的级分。检测回收的级分中的胆固醇得到小颗粒LDL中的胆固醇值。如图3中所示，本发明的结果表明与超速离心方法的结果的良好相关性。
实施例3将100μl血清试样与100μl含有平均分子量为5000的1.5％硫酸葡聚糖和40mmol/L MgCl2的分离溶液混合并允许在25℃反应10分钟。反应后，以18,500g离心混合物15分钟，回收上清液并通过浊度免疫测定法(Daiichi Pure Chemicals Co.，ApoB aouto N(Daiichi))使用抗人aopB抗体检测小颗粒LDL中apoB的量。在超速离心方法中，离心受试血清和密度溶液的混合物以回收密度为1.040-1.063的级分。检测apoB得到小颗粒LDL中的apoB值。结果在图4中显示。如图4中所示，如实施例2一样，本发明的结果表明了与超速离心方法的结果的良好相关性。
实施例4使用相似试剂根据实施例2实施所有操作，只是用0.3％磷钨酸钠和7.5mmol/L CaCl2代替分离溶液并将根据本发明的检测值与通过超速离心方法所得结果相比较。结果在图5中显示。如图5中所示，如实施例2一样，本发明的结果表明了与超速离心方法的结果的良好相关性。
实施例5使用相似试剂根据实施例2实施所有操作，只是用40U/ml肝素钠和30mmol/L MnCl2代替分离溶液并将根据本发明的检测值与通过超速离心方法所得结果相比较。结果在图6中显示。如图6中所示，如实施例2一样，本发明的结果表明了与超速离心方法的结果的良好相关性。
实施例6使用相似试剂根据实施例2实施所有操作，只是用500U/ml肝素钠和140mmol/L MgCl2和34mmol/L KCl代替分离溶液并将根据本发明的检测值与通过超速离心方法所得结果相比较。结果在图7中显示。如图7中所示，如实施例2一样，本发明的结果表明了与超速离心方法的结果的良好相关性。
实施例7使用相似试剂根据实施例2实施所有操作，只是用8％PEG(分子量6,000)代替分离溶液并将根据本发明的检测值与通过超速离心方法所得结果相比较。结果在图8中显示。如图8中所示，如实施例2一样，本发明的结果表明了与超速离心方法的结果的良好相关性。
实施例8将100μl血清试样与100μl含有150U/mL肝素钠和90mmol/LMgCl2的分离溶液混合并允许在37℃反应10分钟。反应后，以18,500g离心混合物15分钟，回收上清液并使用用于检测LDL中甘油三酯的量的试剂检测小颗粒LDL中甘油三酯的量。在超速离心方法中，离心受试血清和密度溶液的混合物以回收密度为1.040-1.063的级分。检测回收的级分中的甘油三酯得到小颗粒LDL中的甘油三酯值。结果在图9中显示，如图9中所示，如实施例2一样，本发明的结果表明了与超速离心方法的结果的良好相关性。
实施例9将100μl血清试样与100μl含有150U/mL肝素钠和90mmol/LMgCl2的分离溶液混合并允许在37℃反应10分钟。反应后，使用离心滤器(Ultrafree-MC(0.1μm过滤单位)MILLIPORE Co.)以10,000g离心混合物1分钟。回收滤液后，检测小颗粒LDL中胆固醇并与通过超速离心方法所得的胆固醇检测值比较。结果在图10中显示，如图10中所示，如实施例2一样，本发明的结果表明了与超速离心方法的结果的良好相关性。
本说明书将该说明书中所引用的所有出版物、专利和专利申请完整并入作为参考。
工业应用性根据本发明，使用简单方法可以将小颗粒LDL与其他LDLs分离，并且可以分级检测小颗粒LDL中的胆固醇、甘油三酯或者apoB。因此，本发明对于临床应用非常有用。
权利要求
1.定量试样中小颗粒低密度脂蛋白的方法，该方法包括第一步将小颗粒低密度脂蛋白与其他低密度脂蛋白分离，和第二步检测所分离的小颗粒低密度脂蛋白中胆固醇、甘油三酯或者蛋白质，其中在所述第一步中用PEG将小颗粒低密度脂蛋白与其他低密度脂蛋白分离。
2.根据权利要求1的方法，其中当将PEG加入试样中时，PEG的终浓度为2-5％。
3.根据权利要求1的方法，其中通过使用用于定量检测低密度脂蛋白中的胆固醇并且不需要分级分离的试剂实施所述第二步中胆固醇的检测。
4.根据权利要求1的方法，其中通过使用用于定量检测低密度脂蛋白中的甘油三酯并且不需要分级分离的试剂实施所述第二步中甘油三酯的检测。
5.根据权利要求1的方法，其中通过使用抗人脱辅基蛋白质B抗体实施所述第二步中蛋白质的检测。
6.从试样分离小颗粒低密度脂蛋白的方法，其包括向所述试样中加入PEG以沉淀不同于小颗粒低密度脂蛋白的低密度脂蛋白的步骤。
7.根据权利要求6的分离小颗粒低密度脂蛋白的方法，其中当将PEG加入试样中时，PEG的终浓度为2-5％。
8.检测小颗粒低密度脂蛋白的试剂盒，其含有包括PEG的分离试剂；和用于检测低密度脂蛋白的试剂，其中该试剂盒检测小颗粒低密度脂蛋白中的胆固醇、甘油三酯或者蛋白质。
全文摘要
本发明的目的是提供用于小颗粒LDL的分级检测的快速而简单的方法。定量试样中小颗粒低密度脂蛋白的方法，该方法包括第一步将小颗粒低密度脂蛋白与其他低密度脂蛋白分离，和第二步检测所分离的小颗粒低密度脂蛋白中胆固醇、甘油三脂或者蛋白质。
文档编号G01N33/92GK101051051SQ200710101968
公开日2007年10月10日 申请日期2003年12月5日 优先权日2002年12月6日
发明者伊藤康树, 平野勉 申请人:电化生研株式会社