专利名称：：抗角蛋白抗体的检测方法及试剂盒的制作方法
技术领域：
：本发明涉及测量体内血液特性的方法，具体是抗角蛋白抗体的检测方法及试剂盒
背景技术：
：类风湿性关节炎(rheumatoidarthritis,RA)是一种以关节滑膜炎为特征的慢性全身性自身免疫性疾病。滑膜炎持久反复发作，可导致关节内软骨和骨的破坏，关节功能障碍，严重甚至会至残。血管炎病变累及全身各个器官，故本病又称为类风湿病。目前，临床上诊断RA主要依靠美国风湿病协会(ARA)1987年修订的类风湿诊断标准，内容包括临床表现、X线改变、类风湿因子(RF)检测，而符合ARA标准的病人基本上已是RA的进展期或晚期，而早发现、早确诊及早期积极有效的治疗能在很大程度上减少骨关节受损，延缓病情的进展并改善预后，类风湿因子(RF)是ARA诊断标准中唯一的实验室指标，其敏感性较高、特异性较差，当临床症状不典型时，很难为早期诊断提供可靠的依据。RA是我国常见的风湿病，发病率约为0.3%。在类风湿关节炎患者血清中可出现多种自身抗体，近年来发现了抗核周因子、抗角蛋白抗体等。类风湿关节炎(RA)特异的诊断标记一直是研究的热点。国内外的研究表明抗角蛋白抗体(AKA)、抗核周因子(APF)和类风湿因子(RF)在RA具有诊断意义。IgG型抗角蛋白抗体出现于36%60%的RA患者血清中，特异性高达95%，随着AKA检测在临床的广泛应用，发现抗角蛋白抗体阳性的"健康人"几乎均发展成典型的RA患者。1.979年Young等人发现RA患者血清中有一种能与鼠食管角质层反应的抗体，对RA具有特异性，命名为AKA。1989年Vincent等提出应将AKA更名为抗角质层抗体更为恰当。AKA可以在RA患者发病以前若干年出现，所以具有早期诊断价值。国内一些单位如北京协和医院参照此方法制作了生物薄片，进行抗角蛋白抗体的检测来诊断类风湿性疾病。目前国内临床实验室大多采用德国欧蒙公司的抗角蛋白抗体试剂盒进行检验和实验研究。德国欧蒙公司的抗角蛋白抗体试剂盒，采用间接免疫荧光法进行检测，抗原来自大鼠食道。其方法为将已稀释的血清样本滴加在载片的反应区内，第1次温育时，血清与反应区上生物薄片中的大鼠食道角质层反应。如果样本是阳性，特异性IgG抗体与相应抗原结合。加入抗lgG抗体荧光标记物，第2次温育时，抗lgG抗体荧光标记物、类风湿患者抗角蛋白抗体、大鼠角质层抗原相结合，然后在荧光显微镜下观察特异性的荧光模型，如果抗"类风湿关节炎角蛋白"(丝集蛋白)抗体与大鼠食道组织切片反应，将会围绕角质层细胞产生细的线状荧光。'荧光模型与阳性对照基本一致。但是采用德国欧蒙公司的抗角蛋白抗体试剂盒仅能检测到IgG型抗角蛋白抗体，而lgG型抗角蛋白抗体仅占全部抗体的8596左右，因此还有15%左右的IgA和IgM型抗角蛋白抗体患者会被漏诊，而且此种方法荧光强度弱，非特异荧光强，有可能造成漏检。
发明内容本发明为了解决已知技术中抗角蛋白抗体试剂盒存在漏诊、漏检的缺陷，而提供一种准确性高，补体来源广泛的抗角蛋白抗体的检测方法及试剂盒。本发明所采取的技术方案是一种抗角蛋白抗体检测方法，检测时向反应区内加经过稀释的血清，经孵育、漂洗、甩干，加入补体后经孵育、漂洗、甩干，再加入抗补体抗体荧光标记物，经孵育、漂洗、去掉水滴，缓冲甘油封片，然后荧光显微镜下观察，以角质层出现典型规则的线状或板层状荧光为阳性。所述的补体、抗补体抗体均来自哺乳动物，也可以采用人重组基因方法制作的补体。所述的抗补体抗体为抗C3c抗体本发明检测抗角蛋白抗体的试剂盒，为六面体形状，由盒盖与盒底组成，在盒底内靠近长边的任意一条边设置有放置试剂瓶的瓶架；瓶架上设有多个放置试剂瓶的孔；盒底的中间设有一个将盒底分成放置试剂与放置载片两部分的挡片。上述试剂包括阴性对照血清、阳性对照血清、浓縮磷酸缓冲液、补体和抗补体抗体荧光标记物的应用液，其中补体为粉状。所述载片上形成有三个以上的反应区，每个反应区包被一个大鼠食管制作的生物薄片作为抗原。本发明采用在生物薄片上加入血清、补体与标记荧光素的抗补体抗体，可显著提高检测效果。补体(complement,C)是存在于正常人和动物血清与组织液中的一组经活化后具有酶活性的蛋白质。早在19世纪末Bordet即证实，新鲜血液中含有一种不耐热的成分，可辅助和补充特异性抗原抗体反应，介导免疫溶菌、溶血作用，故称为补体。目前已知补体是由30余种可溶性蛋白、膜结合性蛋白和补体受体组成的多分子系统，故称为补体系统(complementsystem)。补体系统的各成分以无活性的前体存在于血浆中，需要时，在激活物如抗原-抗体复合物的作用下，依次被激活。RA患者血液中的特异性lgG、lgA和lgM等抗体与抗原结合形成免疫复合物。加入补体后其参与免疫反应，补体在代谢过程中产生C3C，此时加入抗C3c抗体荧光标记物，形成抗原-抗体-抗C3。抗体荧光素标记物。该复合物与大鼠食管结合，其它物质漂洗时被洗脱。荧光显微镜下能观察到典型的板层状特异性荧光。该实验主要特点在于检测范围包含有与角蛋白发生反应的所有免役球蛋白(如G、A、M、E、D)，一个抗原抗体反应簇可以结合2个或2个以上的补体成份，增加了荧光标记抗体的结合数量，从而使荧光强度显著增强。本方法在使用中直接在荧光显微镜下观察即可。当间隔时间长，不能马上看结果时，可用缓冲甘油封片，以保持反应结果的正确性。本发明补体参与的是免疫复合物型抗体的检测方法，使抗原-抗体-补体与荧光素的结合点多且牢固，荧光强度增大，提高了分辨率和灵敏度。能够同时检测lgG、lgA、lgM等型抗角蛋白抗体，减少漏诊、漏检率，为临床提供更为准确的实验结果。本发明的方法在灵敏度、特异性、阴性预测值、阳性预测值等指标方面均高于现有的方法，因此本方法在诊断类风湿性疾病方面有更好的诊断价值。本发明的试剂盒为一次性使用，内有盖片、带生物簿片的载片、补体和抗补体抗体及其他检测所需要的试剂。另外附有使用说明书，方便检测人员使用。图1是现有方法检测AKA为阴性的荧光图2是现有方法检测AKA为阳性的荧光图3是现有方法检测AKA为阴性的荧光图4是用本发明方法检测AKA为阳性的荧光图5是同一标本现有方法检测AKA为阴性的荧光图6是同一标本本发明方法检测AKA为阳性的荧光图7是本发明试剂盒的示意图8是本发明载片的示意图。.具体实施例方式实施例1抗角蛋白抗体的检测方法检测时在生物薄片反应区内加1:10的待测稀释血清2541，湿盒内37'C孵育30分钟，PBS漂洗，甩干，加入补体25Ma，湿盒内37°C孵育30分钟，PBS漂洗，甩干，再加入标记荧光素的抗C3c抗体25W，37°〇孵育30分钟，PBS漂洗，甩干，缓冲甘油封片。如果直接检测则不用封片。将载片放在荧光显微镜下观察，以角质层出现典型规则的线状或板层状荧光为阳性。为了更好地理解本发明，下面通过临床检测时用两种检测方法得出的结果来进一步说明本发明在检测抗角蛋白抗体方面的积极效果所选用的病例为2007年1月至2008年2月在我院风湿科门诊或住院的RA患者58例，男性18例，女性40例，年龄6080岁，平均69岁，病程4个月至.5.7年，平均2.6年。62例非类风湿对照者，年龄6182岁，平均67.8岁。全部符合1987年美国风湿病学会类风湿分会分类标准。AKA检测方法l.抗IgG荧光法，按欧蒙公司检测方法；2.本发明的检测方法。分别采用此两种方法检测58例类风湿患者和62例非类风湿对照者抗角蛋白抗体，并将两种方法进行统计学分析。判定标准以角质层出现典型规则的线状或板层状荧光为阳性。具体结果见表1及表2。表l用两种方法检测RA组、非RA组统计学比较表。_RA组(r^58)非RA组(『62)曰标_阳性例数阳性率(%)阳性例数阳性率(%)抗IgG荧光法^^!1^^T"抗补体荧光法_^_^_^_~经卡方检验，在RA组两种方法比较有显著性差异，经t检验代0.05;在非RA组两种方法比较无显著性差异，/M).05。_表2两种方法检测结果比较(％)_<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>通过表1、表2可看本发明的测试方法在灵敏度，特异性，阳性预测值及阴性预测值均高于已有方法，本发明采用抗补体荧光标记物的检测方法高于抗IgG型荧光标记物检测方法，具有很高的诊断价值，可以作为类风湿性关节炎的早期诊断。同时通过观察荧光显微镜下抗角蛋白抗体荧光可看出已有技术与本发明之间的区别。下面是各种情况的荧光图。图1是现有技术检测AKA为阴性的荧光图，荧光仅出现在粘膜层，故AKA检测为阴性。图2是现有技术检测AKA为阳性的荧光图，荧光出现在粘膜下层，故AKA检测为阳性。图3是本发明检测AKA为阴性的荧光图，粘膜下层无特异性荧光，故AKA检测为阴性。图4是本发明检测AKA为阳性的荧光图，在粘膜下层有指纹样荧光，故AKA检测为阳性。图5、图6为分别用已有技术与本发明检测同一标本的荧光图。图5是用现有技术检测抗角蛋白抗体，粘膜层只有非特异荧光，故AKA检测为阴性。图6是用本发明检测抗角蛋白抗体，粘膜下层有指纹样荧光，故AKA检测为阳性。同一标本不同检测方法，得出不同结果，可以看出本发明在检测准确率方面有很大提高。实施例2试剂盒一.盒体本发明的试剂盒为一次性使用。盒体1为由纸板制作的六面体形状，由盒底5与盒盖2组成。盒底与盒盖连为一体。盒底5内在盒底5与盒盖2相连的长边处设置有瓶架3，瓶架上设有7个孔4，可放置装有各种试剂的瓶子10。在盒底5中间有一从瓶架3延伸至另一条长边，将盒底5分为两部分的挡片7，其中一部分放置缓冲剂及盖片，另一部分放置带有包装袋6的载片13及说明书(未图示)。盒体的长、宽、高与所装物品的外形相匹配。二.试剂盒配备的物品在本发明试剂盒的瓶架3上放置有1瓶1100W抗C3c抗体荧光标记物(荧光素/蛋白比为2.90)应用液、2瓶各100Pg的补体、各0.5ml的阴性和阳性对照血清各1瓶、4ml吐温20及1000W缓冲甘油各1瓶。以图7试剂盒示意图为例，盒底左部分放置有两瓶50ml浓縮的磷酸盐缓冲剂9及装有八片盖片(未图示)的小纸盒8。右部分放置有8张带有包装袋6的载片13及说明书(未图示)。本发明试剂中的补体、抗C3C抗体是采用兔的血液分离出的补体及抗C3C抗体，二者均采用不透光的瓶子包装，避光保存，禁止反复冻溶使用。补体为固体粉末，应现用现溶。本发明的补体、抗C3C抗体还可采用其他哺乳动物的补体、抗C3c抗体，如羊、鼠等，也可采用人重组基因方法制作的补体。本发明载片13的材质为聚苯乙烯，其尺寸与一般载片相似。其一面涂有聚赖氨酸涂层，载片带有涂层的一面，排列着五个向载片13内部凹陷形成的容积的凹槽反应区12。每个凹槽反应区12都包被一个大鼠食管冰冻切片的生物薄片11，载片13外部包有一层不透光的包装袋6。盖片的尺寸为62mmX23mm，每个外部包有包装袋，其八片装在--个小纸盒8内，放在磷酸盐缓冲液瓶子的右边。本发明试剂盒中的吐温20、抗补体抗体荧光标记物，补体、浓縮的磷酸盐缓冲剂、缓冲甘油、类风湿阴性血清和阳性血清都有市售，载片、盖片、包装袋通过外加工得到。本发明不限于实施例，比如试剂盒盒体也可采用其他材料制作如塑料；盒底盒盖也可分别设置；装试剂部分的盒底也可设置衬垫，浓縮缓冲液瓶子可放置在衬垫的凹陷处。载片的材质也可采用其他材料制作。载片上反应区形状也可采用圆形或其他形状。同时反应区的数量不限于五个。三.生物薄片的制作方法1.材料6周龄Wistar雄性大鼠由中国医学科学院放射医学研究所提供。2.操作方法(l)取6周龄雄性Wistar大鼠食管中下1/3段作为抗原，取新鲜标本横切面进行冰冻，将冰冻的标本置冰冻切片机一20°C中做冰冻切片，厚4um5um，制成抗原生物薄片，直接包被在载片的反应区内，然后装入包装袋，密封。一70匸时可保存2年，在-].O"C时可保存1年，在4'C可保存3-5个月。本发明的试剂盒应密闭避光保存。实施例3试剂盒实验操作步骤准备从试剂盒中取出载片，恒温到室温。稀释先将50ml的浓縮磷酸盐缓冲液加蒸馏水稀释至1L，稀释液磷酸盐含量为10.2g，pH=7.2。将2ml吐温20加入到稀释好的磷酸盐缓冲液(PBS-Tween20)中，搅拌均匀。用PBS-Tween20按1:10的比例稀释待测的血清(阳性和阴性对照血清不需稀释)，使用前要混匀。将lOOPg粉状补体用50微升蒸馏水复溶成补体应用液。加样滴加25ul稀释后的血清至载片的反应区中，避免产生气泡。第一次温育将载片覆有生物薄片的一面朝上，反应区盖上盖片，反应立即开始。确保标本与生物薄片接触，室温温育30分钟。清洗用磷酸盐缓冲液流水冲洗载片1次，然后将其浸入装有磷酸盐缓冲液的小杯中浸洗至少l分钟，取出甩干。加补体在待测的反应区中滴加25ul补体，湿盒内37。C孵育30分钟，PBS漂洗方法同上。再加入抗C3c抗体荧光标记物25ul，37。C孵育30分钟，PBS漂洗方法同上。如不能马上看结果，需要进行下面步骤。封片在反应区上滴加磷酸甘油约25ul，将盖片盖在生物薄片反应区上，其后30分钟内可保持检测结果正确。结果判断以在荧光显微镜下观察到角质层出现典型规则的线状或板层状荧光为阳性。当检测结果有疑问时，用阴性和阳性对照血清进行参照对比检测。权利要求1.一种抗角蛋白抗体的检测方法，其特征在于检测时向反应区内加经过稀释的血清，经孵育、漂洗、甩干，加入补体后经孵育、漂洗、甩干，再加入抗补体抗体荧光标记物，经孵育、漂洗、去掉水滴，缓冲甘油封片，然后荧光显微镜下观察，以角质层出现典型规则的线状或板层状荧光为阳性。2.根据权利要求1所述的抗角蛋白抗体的检测方法，其特征在于补体、抗补体抗体均来自哺乳动物，也可以采用人重组基因方法制作的补体。3.根据权利要求3所述的抗角蛋白抗体的检测方法，其特征在于抗补体抗体为抗C3C抗体4.一种检测抗角蛋白抗体的试剂盒，为六面体形状，由盒盖与盒底组成，其特征在于盒底内在靠近长边的任意一条边设置有放置试剂瓶的瓶架；瓶架上设有多个放置试剂瓶的孔；盒底的中间设有一个将盒底分成放置试剂与放置载片两部分的挡片。5.根据权利要求4所述的检测抗角蛋白抗体的试剂盒，其特征在于上述试剂包括阴性对照血清、阳性对照血清、浓縮磷酸缓冲液、补体和抗补体抗体荧光标记物的应用液、吐温20,其中补体为粉状。6.根据权利要求4所述的检测抗角蛋白抗体的试剂盒，其特征在于载片上形成有三个以上的反应区，每个反应区包被一个大鼠食管制作的生物薄片作为抗原。全文摘要本发明公开了一种抗角蛋白抗体检测方法及试剂盒，属于测量体内血液特性的方法。本发明的方法为取大鼠食管制成生物薄片作为抗原，包被在载片的反应区内；向反应区内加待测血清，经孵育、漂洗、甩干后，加入补体，经孵育、漂洗、甩干，再加入抗补体抗体荧光标记物，经孵育、漂洗、甩干后，在荧光显微镜下观察，以角质层出现典型规则的线状或板层状荧光为阳性。本发明的试剂盒内装有检测用的阴性对照血清、阳性对照血清、浓缩磷酸缓冲液、补体和抗补体抗体荧光标记物应用液等试剂及盖片、带有生物薄片的载片。本发明的方法在灵敏度、特异性、阴性预测值、阳性预测值等指标均高于现有的方法，因此本方法在诊断类风湿性疾病方面有更好的诊断价值。文档编号G01N33/53GK101320042SQ20081005345公开日2008年12月10日申请日期2008年6月6日优先权日2008年6月6日发明者李立和,王高生申请人:天津市宝坻区人民医院