专利名称：一种快速检测筛选阪崎肠杆菌的方法
技术领域：
本发明涉及微生物检测领域，公开了一种利用免疫化的超顺磁纳米粒子和免疫化 的荧光量子点快速检测筛选阪崎肠杆菌的方法。
背景技术：
食源性致病菌快速检测一直是研究关注的焦点，《中华人民共和国食品安全法》于 2009年2月28日在第十一届全国人民代表大会常务委员会第七次会议通过。食源性致病 菌快速检测是采用微生物学、化学、生物化学、生物物理、免疫学的方法对食品及其加工、贮 藏等环境中的致病菌进行分离、检测、鉴定和计数。现在广泛使用的检测方法主要有三种平皿培养分离计数法，聚合酶链式反应 (polymerase chain reaction，PCR)与焚光 PCR 检验方法。阪崎肠杆菌(又称阪崎氏肠杆菌)是肠杆菌科的一种，1980年由黄色阴沟肠杆菌 更名为阪崎肠杆菌。阪崎肠杆菌能引起严重的新生儿脑膜炎、小肠结肠炎和茵血症，死亡率 高达50%以上。目前，微生物学家尚不清楚阪崎肠杆菌的污染来源，但许多病例报告表明婴 儿配方粉是目前发现的主要感染渠道。阪崎肠杆茵的生物学性状及其对人群的健康危害受 到人们的关注并被报告。阪崎肠杆菌是奶粉(乳)制品中新发现的一种致病菌。由其引发的婴儿、早产儿脑 膜炎、败血症及坏死性结肠炎散发和暴发的病例已在全球相继出现。多份研究报告表明婴 儿配方奶粉是当前发现致婴儿、早产儿脑膜炎、败血症和坏死性结肠炎的主要感染渠道，在 某些情况下，由阪崎肠杆菌引发疾病而导致的死亡率可达40% 80%。阪崎肠杆菌已引起 世界多国相关部门的重视。据报道，国外乳业巨头曾因此被召回。在美国FDA2002年在本 土某一些国际乳业巨头生产的婴儿配方奶粉中检出阪崎肠杆菌后，2003年又一家国际乳业 巨头公司主动召回在美国生产的一批检出极微量阪崎肠杆菌的罐装早产儿特殊配方奶粉， 阪崎肠杆菌从此成为世界瞩目的焦点。但是国内企业鲜有自查能力，原因是国内以前还没 有专门的检测手段，而去买一套以前国内从未有过的检测设备也不是马上就可办到的。传统的平皿培养分离鉴定法是应用微生物检验的增菌培养、分离、生化鉴定等方 法对奶粉中可能存在的食源性致病菌进行定性和定量的检验。其特点是稳定可靠，是目前 最成熟，使用最广泛，作为基准的检验方法，但是存在检测时间长，过程繁琐，对操作人员技 术要求高以及对特定血清型难以分离鉴定的问题。PCR聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)是一种分子生物学技术， 用于放大特定的DNA片段。可看作生物体外的特殊DNA复制。样品(经前处理增菌后)，采 用细菌基因组DNA提取试剂盒提取DNA，以提取的DNA为模版进行PCR扩增。通过琼脂糖凝 胶电泳检验PCR产物是否有特征条带，从而对样品中是否污染食源性致病菌进行快速检验 用PCR技术检测有害微生物具有特异性强、灵敏度高和操作简便、省时等优点。荧光PCR在 普通PCR基础上加入一条特异的寡核苷酸荧光探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监 控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品的初始模版，可以通过测定放射性强度考查样品中微生物数量。但是PCR反应受样品情况的影响比较大，特别在食 源性有害微生物检查中，食品中的成分(糖类、酸类，油脂等物质)会干扰反应的正常进行。 而检测的环境，中间处理环节也会带来一些PCR反应抑制剂。从而使PCR反应呈现较高的 假阳性和假阴性率。为了对我国食品安全作出贡献，丰富致病菌检测方法，提高对食源性致病菌的检 测速度，为可能出现的食品安全问题提供应对方法，需要对现有技术做出改进，研发了“磁 性分离荧光标记定性定量检测乳粉中阪崎肠杆菌”方法。
发明内容
本发明旨在提供一种快速检测筛选阪崎肠杆菌的方法。一种快速测筛选阪崎肠杆菌的方法，步骤包括(1)向待测样品中加入免疫化超顺磁纳米粒子，15 35V混合反应10 60min， 使免疫化超顺磁纳米粒子与阪崎肠杆菌发生特异性结合；(2)在外加磁场吸引作用下，收集免疫化的超顺磁纳米粒子，洗涤后加入免疫化荧 光量子点，15 35°C混合反应10 60min，使之与载于免疫化超顺磁纳米粒子的致病微生 物阪崎肠杆菌发生特异性结合；(3)利用外加磁场吸引作用下收集载于免疫化超顺磁纳米粒子的阪崎肠杆菌与免 疫化荧光量子点结合物，洗涤后定性或定量荧光检测；所述免疫化超顺磁纳米粒子为以四氧化三铁纳米粒子为内核，以二氧化硅为外 壳，表面偶联特异性抗体的磁性粒子；所述的特异性抗体为抗阪崎肠杆菌多克隆抗体或抗 阪崎肠杆菌单克隆抗体；所述的免疫化荧光量子点为与联特异性抗体连接的量子点，所述的特异性抗体为 抗阪崎肠杆菌多克隆抗体或抗阪崎肠杆菌单克隆抗体。步骤(2)和(3)所述的外加磁场为2000 6500Gs。所述免疫化超顺磁纳米粒子的制备方法包括(i)将包裹二氧化硅的四氧化三铁磁性纳米粒子与N-(2_氨基乙基)_3_氨基丙基 三甲基硅烷反应，得到表面氨基化的磁性纳米粒子；N-(2-氨基乙基)-3_氨基丙基三甲基 硅烷与包裹二氧化硅的四氧化三铁纳米粒子比例0. 05 0. lml/g，所述的包裹二氧化硅的 四氧化三铁磁性纳米粒子粒径为50nm 150nm ；可通过现有技术制备包裹二氧化硅的四氧化三铁磁性纳米粒子，例如，制备 Y "Fe203磁核，再通过反相微乳液法对磁核、"Fe203进行包裹并煅烧。(ii)将表面氨基化的磁性纳米粒子分散于pH 7. 25 7. 5、并且戊二醛质量浓度 为 2%的磷酸缓冲液中，将特异性抗体与步骤(i)所得表面氨基化的磁性纳米粒子偶 联，得到免疫化的磁性纳米粒子；所述的特异性抗体为抗阪崎肠杆菌多克隆抗体或抗阪崎 肠杆菌单克隆抗体。所述的表面氨基化的磁性纳米粒子与抗阪崎肠杆菌多克隆抗体的重量比为 1 (0. 004 0. 04)；所述的表面氨基化的磁性纳米粒子与抗阪崎肠杆菌单克隆抗体的重量比为 1 (0. 001 0. 02)。
所述免疫化荧光量子点的制备方法包括如下步骤(A)将pH 7. 25 7. 5、含有交联剂的磷酸缓冲液的与表面修饰有羧基的量子点混 合，反应5 20min以活化羧基；交联剂优选为1_ (3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺 盐酸盐，浓度为10mg/ml至50mg/ml ；(B)加入保护剂反应20 60min ；保护剂优选为N_羟基硫代琥珀酰亚胺；(C)加入特异性抗体混合，反应0. 5 4hr，除去未反应的特异性抗体，收集免疫化 荧光量子点；所述的特异性抗体为抗阪崎肠杆菌多克隆抗体或抗阪崎肠杆菌单克隆抗体；所述抗阪崎肠杆菌多克隆抗体与量子点的比例为1 (4X 105 4X 106)mmoml/ mg ；所述抗阪崎肠杆菌单克隆抗体与量子点的比例为1 (1X105 2X106)mmoml/ mg。量子点，又可称为纳米晶，是一种由II-VI族或III-V族元素组成的纳米颗粒。量 子点的粒径一般介于1 lOnm之间，由于电子和空穴被量子限域，连续的能带结构变成具 有分子特性的分立能级结构，受激后可以发射荧光。基于量子效应，量子点在太阳能电池， 发光器件，光学生物标记等领域具有广泛的应用前景。其具有传统荧光染料和镧系配合物 无法比拟的荧光特性更宽的激发光谱、更窄的发射光谱、更长的寿命等。本方法首先制备具有超顺磁性的四氧化三铁纳米粒子，在纳米粒子表面包裹二氧 化硅，然后表面修饰氨基，使之能与抗体结合，具有生物相容性。然后将特异性的抗体偶联 在磁性颗粒表面，使之能与样品中被检微生物食源性致病菌阪崎肠杆菌发生特异性结合。载有致病微生物阪崎肠杆菌的免疫化超顺磁纳米粒子在外加磁场的作用下，向磁 极方向聚集，利用外加磁场(2000 6500Gs)吸附磁性粒子收集上述免疫化超顺磁纳米粒 子，弃去检样混合液；在此基础上，将被特异性抗体偶联的免疫化荧光量子点加入到浓集后 的反应体系中，使之与载于磁性颗粒的致病微生物阪崎肠杆菌发生特异性结合。提供外加 磁场，被载于磁性颗粒并且偶联有荧光量子点的目标微生物阪崎肠杆菌向磁极方向聚集， 弃去检样混合液，利用外加磁场(2000 6500Gs)吸附磁性粒子收集磁性粒子，可进行荧光 定性定量检测。若样品中含有阪崎肠杆菌，通过上述方法，可将免疫化的荧光量子点(间 接)连接到免疫化超顺磁纳米粒子，经过磁性收集，进行荧光检测；复合物结构免疫化荧 光量子点_阪崎肠杆菌_免疫化超顺磁纳米粒子。本方法不仅能从各种样本中迅速分离目标菌，同时加以高效富集，且分离后的细 菌经快速的荧光标记，既能通过荧光显微镜定性鉴定，又能被荧光分光光度计定量的检测。 整个检测过程仅需2个小时，操作方便、简单，可靠性好，对配套设备要求低。
图1为载于免疫化超顺磁纳米粒子的阪崎肠杆菌与免疫化荧光量子点结合物在 紫外激发下的2为载于免疫化超顺磁纳米粒子的阪崎肠杆菌与免疫化荧光量子点结合物在 可见光激发下的图
具体实施例方式实施例1 免疫化超顺磁性纳米磁珠的制备以及抗体的连接1.磁核Y_Fe203的合成及其包裹用二次蒸馏水分别配制FeS04 7H20和FeCl3 6H20的溶液及NaOH溶液，将所配 两种铁盐溶液混合。使铁盐的混合溶液中Fe2+离子的浓度为0. 15mol/L,，Fe3+的浓度为 0. 25mol/L，NaOH溶液的浓度为2. 5mol/L。在剧烈搅拌下将上述配置好的NaOH溶液缓缓滴 加到混合铁盐溶液中，将所得的沉淀在60°C陈化2小时，用二次蒸馏水将沉淀物清洗3 5 次，过滤后在60°C 70°C干燥24h，在玛瑙研钵中研磨后即为产物，干燥并室温保存备用。由于磁核Y_Fe203的分散性不好，粒径也不均勻，且易于和其它物质发生反应，所 以必须对磁核进行包裹，来得到化学性能稳定、分散性好的核壳型磁珠。采用反相微乳液法 对磁核Y-Fe203进行包裹，将TritonX-100、正己醇、环己烷按照1 1 2 1 1 10 的体积比例混合均勻，超声使其形成稳定的微乳液体系，向其中再加入磁性Y_Fe203纳米 粒子，并用超声分散，取质量浓度为25% 35%浓氨水，滴至体系中至分散均勻，继续向体 系中缓慢滴加正硅酸乙酯(TE0S)。反应完后，向体系中加入丙酮或者静置过夜使粒子陈化。磁性分离后，用乙醇来洗 涤粒子，在400°C的条件下煅烧粒子，以去除粒子表面的有机物，收集二氧化硅包裹的磁性 纳米粒子(其粒径为50 150nm)，干燥并室温保存备用。2.表面氨基化磁性纳米粒子的制备及其免疫化取lOOmg的二氧化硅包裹的磁性纳米粒子分散于400ml甲醇/丙三醇的混合溶液 (甲醇与丙三醇的体积比为1 1)中，同时加入100至lOOOul的蒸馏水，超声使纳米粒子 在混合体系中分散均勻，向搅拌体系中加入6ml N-(2-氨基乙基)-3_氨基丙基三甲基硅 烷，反应完成后3000Gs磁场下磁性分离，分别用乙醇和蒸馏水洗涤3次，得到表面修饰了伯 氨基的磁性纳米粒子，置于真空干燥箱中干燥，干燥后取出并室温保存备用。取上述制备的表面功能化磁性纳米粒子100mg分散于磷酸缓冲溶液中(pH = 7. 4， O.Olmol/L)。向体系中加入戊二醛溶液(终浓度为1.5%)。反应lh后，用上述缓冲液洗 涤反应后的磁性纳米粒子2次以去除过量的戊二醛溶液，并向体系中加入抗阪崎肠杆菌多 克隆抗体，继续反应4 6h，磁性纳米粒子表面的氨基与抗体上的氨基连接，形成免疫化超 顺磁纳米粒子。3000GS磁场下磁性分离后，将得到的粒子重新分散于缓冲溶液中，4°C保存实施例2荧光量子点与抗体的连接将1-(3_ 二甲氨基丙基)_3_乙基碳化二亚胺盐酸盐(EDAC)作为交联剂，N_羟 基硫代琥珀酰亚胺(NHSS)作为保护剂，将表面修饰有羧基的量子点(QDs-COOH)与抗体 (Ab)上的末端氨基交联反应生成酰胺键，得到免疫化的量子点。抗体与量子点的摩尔比为 1 10 至 1 30。具体做法为40ul羧基修饰的量子点(发红色光)(5. 2 X 10_6mol)加入到 80ul (0. 01mol/L, pH = 7. 4)无菌磷酸缓冲液中，3mg的EDAC加入到溶液中(最终浓度为 15mg/mL)，并在室温下涡流lOmin，来充分活化功能化量子点表面上的羧基，然后向上述溶 液中加入lmg的NHSS，并在室温条件下涡流30min，充分反应后加入80ul (2mg/mL)抗阪崎 肠杆菌多克隆抗体，涡流lOmin，充分反应2h，制备免疫化的量子点，最后通过超滤浓缩离心管去除未反应的抗体，收集所制的免疫化的量子点并4°C保存备用。实施例3:样品的检测将实施例1所制备的免疫化的超顺磁性纳米粒子分散在磷酸盐缓冲液(0. Olmol/ L，pH = 7. 2)中，浓度为50mg/ml，取50ul滴入3ml不同浓度(103 105cfu/ml)的阪崎肠杆 菌菌液样品液中，室温摇床振荡充分反应0.5h，在外加磁场(3000Gs)的作用下，收集免疫 化的超顺磁纳米粒子，用磷酸盐缓冲液(0. 01mol/L,pH = 7. 2)洗涤2 3次，定容至0. 2ml 体系。然后向洗涤后的体系中分别滴加50ul的实施例2所制备的免疫化的荧光量子点， 在室温摇床下振荡0. 5h，使阪崎肠杆菌表面上的抗原与量子点上连接的抗阪崎肠杆菌多克 隆抗体充分免疫结合，在外加磁场(3000GS)的作用下，收集被载于磁性颗粒并且偶联有荧 光量子点的目标微生物阪崎肠杆菌，用磷酸盐缓冲液(0. 01mol/L, pH = 7. 2)洗涤3 4次， 最终分别定容至lOOul体系中。然后使用荧光显微镜定性检测，结果如图1和图2所示，免疫化的超顺磁性纳米粒 子与阪崎肠杆菌及免疫化荧光量子点形成复合物，载于免疫化超顺磁纳米粒子的阪崎肠杆 菌与免疫化荧光量子点结合物在可见光或紫外光下会产生荧光。 也可以通过荧光分光光度计定量检测。实施例1、2中的抗阪崎肠杆菌多克隆抗体可用三分之一用量的抗阪崎肠杆菌单 克隆抗体代替，结果相同，抗体浓度均为lmg/ml。结果判定和报告结果判定结合发荧光菌体的形态、荧光亮度与菌量综合判定。阳性及可疑阳性结果菌体红色荧光亮度为+，菌体形态特征符合阪崎肠杆菌，且 多数视野中均能检出数个菌体。阴性结果无红色与绿色荧光，或菌形模糊，为阴性。报告方法量子点荧光镜检结果为阴性报告为“未检出阪崎肠杆菌”。量子点荧光镜检结果为阳性或可疑阳性结果结果记录中出现阳性或可疑阳性结 果，均应按依照国家标准对阳性结果及可疑阳性结果进行培养法检查，并根据培养法检查 结果做报告。
权利要求
一种快速检测筛选阪崎肠杆菌的方法，其特征在于，步骤包括(1)向待测样品中加入免疫化超顺磁纳米粒子，15～35℃混合反应10～60min，使免疫化超顺磁纳米粒子与阪崎肠杆菌发生特异性结合；(2)在外加磁场吸引作用下，收集免疫化超顺磁纳米粒子，洗涤后加入免疫化荧光量子点，15～35℃混合反应10～60min，使之与载于免疫化超顺磁纳米粒子的阪崎肠杆菌发生特异性结合；(3)利用外加磁场作用吸附收集载于免疫化超顺磁纳米粒子的阪崎肠杆菌与免疫化荧光量子点结合物，洗涤后定性或定量荧光检测；所述免疫化超顺磁纳米粒子为以四氧化三铁纳米粒子为内核，以二氧化硅为外壳，表面偶联特异性抗体的磁性粒子；所述的特异性抗体为抗阪崎肠杆菌多克隆抗体或抗阪崎肠杆菌单克隆抗体；所述的免疫化荧光量子点为与联特异性抗体连接的量子点，所述的特异性抗体为抗阪崎肠杆菌多克隆抗体或抗阪崎肠杆菌单克隆抗体。
2.权利要求1所述一种快速检测筛选阪崎肠杆菌的方法，其特征在于，所述免疫化超 顺磁纳米粒子的制备方法包括(i)将包裹二氧化硅的四氧化三铁磁性纳米粒子分散在有机溶剂中，与N-(2-氨基 乙基)_3_氨基丙基三甲基硅烷反应，得到表面氨基化的磁性纳米粒子；N-(2-氨基乙基)-3-氨基丙基三甲基硅烷与包裹二氧化硅的四氧化三铁纳米粒子比例为0. 05 0. lml/ g ；(ii)将表面氨基化的磁性纳米粒子分散于PH7. 25 7. 5、并且戊二醛质量浓度为 2%的磷酸缓冲液中，将特异性抗体与步骤(i)所得表面氨基化的磁性纳米粒子偶联，得到免疫化超顺磁纳米粒子；所述的特异性抗体为抗阪崎肠杆菌多克隆抗体或抗阪崎 肠杆菌单克隆抗体；所述的表面氨基化的磁性纳米粒子与抗阪崎肠杆菌多克隆抗体的重量比为 1 (0. 004 0. 04)；所述的表面氨基化的磁性纳米粒子与抗阪崎肠杆菌单克隆抗体的重量比为 1 (0. 001 0. 02)。
3.权利要求1所述一种快速检测筛选阪崎肠杆菌的方法，其特征在于，所述免疫化荧 光量子点的制备方法包括如下步骤(A)将pH7. 25 7. 5、含有10 50mg/ml交联剂的磷酸缓冲液的与表面修饰有羧基 的量子点混合，反应5 20min以活化羧基；(B)加入保护剂反应20 60min；(C)加入特异性抗体混合，反应0.5 4hr，除去未反应的特异性抗体，收集免疫化荧光量子点；所述的特异性抗体为抗阪崎肠杆菌多克隆抗体或抗阪崎肠杆菌单克隆抗体； 所述抗阪崎肠杆菌多克隆抗体与量子点的比例为1 (4X 105 4X 106)mmol/mg ； 所述抗阪崎肠杆菌单克隆抗体与量子点的比例为1 (1X105 2X106)mmol/mg。
4.权利要求2所述一种快速检测筛选阪崎肠杆菌的方法，其特征在于，步骤(i)所述的 包裹二氧化硅的四氧化三铁磁性纳米粒子粒径为50nm至150nm。
5.权利要求3所述一种快速检测筛选阪崎肠杆菌的方法，其特征在于，步骤㈧所述的 交联剂为1- (3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐，浓度为10 50mg/ml。
6.权利要求3—种快速检测筛选阪崎肠杆菌的方法，其特征在于，步骤(B)所述的保护 剂为N-羟基硫代琥珀酰亚胺。
7.权利要求1所述一种快速检测筛选阪崎肠杆菌的方法，其特征在于，步骤(2)和(3) 所述的外加磁场为2000 6500Gs。
全文摘要
本发明公开一种快速检测筛选阪崎肠杆菌的方法，向待测样品中加入免疫化超顺磁纳米粒子，使免疫化超顺磁纳米粒子与阪崎肠杆菌发生特异性结合；收集免疫化超顺磁纳米粒子，洗涤后加入免疫化荧光量子点，使之与载于免疫化超顺磁纳米粒子的阪崎肠杆菌发生特异性结合；再利用外加磁场作用吸附收集载于免疫化超顺磁纳米粒子的阪崎肠杆菌与免疫化荧光量子点结合物，洗涤后定性或定量荧光检测。本方法能从各种样本中迅速分离目标菌，同时加以高效富集，操作方便、简单，可靠性好，对配套设备要求低。
文档编号G01N33/533GK101865919SQ201010165329
公开日2010年10月20日 申请日期2010年4月29日 优先权日2010年4月29日
发明者孟谨, 支援, 沈鹤柏, 韩奕奕, 顾鸣 申请人:上海师范大学