专利名称：快速检测四种硝基呋喃类药物的免疫纳米金试纸条的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种快速检测四种硝基呋喃类药物的免疫纳米金试纸条，总体属于农业领域(畜牧与水产业)，具体属于动物源性产品安全检测/兽药残留检测领域。
背景技术：
呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃妥因和呋喃它酮均属于化学合成的硝基呋喃类广谱抗菌药物，但由于它们的原形药和代谢物具有致癌性和致突变作用，已被中国农业部列为禁止用于食品动物的药物。但这些药物往往被添加在动物饲料中违法使用，因此而造成的兽药残留会严重影响动物性产品安全，威胁消费者身体健康。因此，检测饲料中非法添加的此类药物可从源头保护动物性产品的质量安全。目前，有些研究者采用免疫学方法对此类药物进行检测。如专利2005101112 ， 其声明将呋喃唑酮直接与载体蛋白连接作为免疫原，获得抗体制备免疫纳米金试纸条可检测饲料中的呋喃唑酮；再如专利200610041481，其声明制备了呋喃西林的单克隆抗体，建立的ELISA方法可检测呋喃西林。但其没有给出免疫原的制备方法，按免疫学原理推断，申请者也应是将呋喃西林直接与载体蛋白连接。这些方法技术均只能检测一种硝基呋喃类药物，而不能同时检测其他几种硝基呋喃类药物。因此，研究制备可同时对饲料中这四种硝基呋喃类药物进行快速检测的方法技术非常重要。目前已有的方法技术不能同时检测这四种硝基呋喃类药物，是因为它们的免疫原在合成时只针对一种药物，存在很大不足。硝基呋喃类药物的分子结构母核是5-硝基呋喃环，上述四种药物都含有这一结构。而一种药物合成中间体5-硝基糠醛也含有这一结构，针对5-硝基糠醛的抗体就能同时识别这四种药物。
发明内容
本发明要解决的问题是提供一种能快速检测四种硝基呋喃类药物的免疫纳米金试纸条。本发明采取的技术方案如下
一种快速检测四种硝基呋喃类药物的免疫纳米金试纸条，其制备方法如下
(1)合成通用半抗原称取5-硝基糠醛50-80mg溶于3_5mL乙醇中得A液；称取硫酸联氨70-100mg溶于5-10mL蒸馏水中得B液；室温下将A液逐滴滴加到B液中，搅拌反应 30-60分钟，得黄色沉淀；用饱和碳酸钠溶液中和上述反应液至pH6. 0-8. 0后，将此混和液抽滤至干；所剩固体用10-20mL蒸馏水洗涤，再抽滤至干，自然干燥即得通用半抗原；
(2)合成免疫原称取所述半抗原10-20mg溶于5-10mL甲醇中，搅拌条件下逐滴滴加到含牛血清白蛋白30-50mg的浓度为0. 01mol/L、pH7. 0-7. 4磷酸缓冲液5-lOmL中；然后逐滴加入浓度为25%的戊二醛溶液60-100μ L，20-25°C反应4小时即得免疫原溶液，然后在 4°C生理盐水中透析72小时，透析液冷冻保存；
(3)合成捕获抗原称取所述半抗原10-20mg溶于5-10mL甲醇中，冷却至4°C ；然后，在4 °C条件下用盐酸调节pH为1.0-3.0，再逐滴加入0.2-0. 5mol/L的亚硝酸钠溶液l_4mL，搅拌反应至淀粉碘化钾试纸检验呈灰蓝色为止；然后用氢氧化钠溶液调pH至 7. 5-9. 0 ；将所得溶液逐滴加入到含卵清蛋白10-20mg的浓度为0. 01mol/L、pH7. 0-7. 4的磷酸缓冲液5-10mL中，4°C搅拌反应8_16h即得捕获抗原溶液，然后在生理盐水中透析72小时，透析液冷冻保存；
(4)制备多克隆IgG抗体将所述免疫原用生理盐水稀释为lmg/mL，加与稀释后免疫原溶液等量的氟氏完全佐剂制成乳化剂，在实验动物家兔的背部皮内多点注射进行首免， 免疫剂量0. 2-0. Smg/只；3-4周后，取lmg/mL的免疫原溶液加与免疫原溶液等量的氟氏不完全佐剂乳化后在实验动物家兔背部皮下多点注射进行加强免疫，免疫剂量0. 2-0. Smg/ 只，每4周加强免疫一次，共免疫6-8次；最后一次免疫，为免疫原直接耳缘静脉注射，免疫剂量0. 2-0. Smg/只；然后，取兔全血分离血清，采用饱和硫酸铵法对血清中的IgG进行粗提；粗提液在浓度0. Olmol/L、pH7. 0-7. 4的磷酸缓冲液中透析2_3天以脱盐；透析液再用 DEAE-52层析柱进行纯化；纯化后的IgG溶液再在浓度0. 01mol/L, pH7. 0-7. 4的磷酸缓冲液中透析2-3天以脱盐，即得多克隆IgG抗体溶液，最后冷冻保存；
(5)制备纳米金溶液取0.01%-0. 05%的氯金酸溶液IOOmL恒温搅拌加热至沸腾，在持续搅拌的情况下加入1%_4%的柠檬酸三钠溶液l_4mL，继续搅拌加热20-30分钟，至溶液呈透亮红色，室温冷却，用去离子水恢复至IOOmL,即得纳米金溶液，4°C保存备用；
(6)制备金标抗体将步骤(5)所得的纳米金溶液用浓度0.01mol/L的碳酸钾溶液调节pH至6. 5-8. 5 ；向其中加入步骤(4)所得多克隆IgG溶液，使IgG抗体浓度为20-25 μ g/ mL，摇勻后4°C静置30-60分钟；然后加入牛血清白蛋白使其浓度为1%- ，搅拌反应1_2小时，4°C静置2-3小时；然后1500r/min离心20-30分钟，弃去沉淀，再将上清液以20000r/ min 4°C离心30-60分钟，弃去上清液；将沉淀悬浮于10_20mL浓度0. 01mol/L、ρΗ7· 0-7. 4 的磷酸缓冲液中，以20000r/min 4°C离心30-60分钟，沉淀悬浮于5_10mL浓度0. 01mol/L、 pH7. 0-7. 4的磷酸缓冲液中，即为金标抗体溶液，4°C保存；
(7)制备免疫纳米金试纸条(a)将步骤(6)所得金标抗体溶液用浓度0.Olmol/L、 pH7. 0-7. 4的磷酸缓冲液稀释4-6倍，所述磷酸缓冲液中含3%蔗糖、0. 1%牛血清白蛋白和 0. 05% Tween-20，按20μ1/αιι2的剂量喷涂在Glass 33型玻璃纤维素膜即结合释放垫上，然后37°C烘10-20分钟；(b):将所述捕获抗原用浓度0. 01mol/L、pH9· 0-9. 5的含3%甲醇的碳酸缓冲液稀释为8Pg/ml，在AE99型硝酸纤维素膜的检测线位置喷涂1_2μ1 ；在此硝酸纤维素膜的质控线位置喷涂1000-1500倍稀释的羊抗兔IgG抗体1_2μ1，检测线与质控线间距5-8mm ；将硝酸纤维素膜在37°C烘10-20分钟；再将硝酸纤维素膜在20 25°C下浸泡在浓度0. 01mol/L、pH7. 0-7. 4的磷酸缓冲液中封闭10分钟，所述磷酸缓冲液中含0. 5%BSA和 0. 05%叠氮钠，然后将硝酸纤维素膜在37°C烘10-20分钟；(c)依次将AE99硝酸纤维素膜、结合释放垫Glass 33玻璃纤维素膜、吸收垫Cotton Iinters沈68和样品垫Glass 33 粘贴在PVC背板上；最后裁剪为4X50mm的试纸条。所制备的免疫纳米金试纸条用于现场检测时，先处理待检样品，然后将处理好的待检样品100 μ L滴至样品垫上，5分钟内读取结果，若有两条红色显色带即质控线和检测线均显色，则判为阴性；若有一条红色显色带即质控线显色而检测线不显色，则判为阳性。所制备的免疫纳米金试纸条对呋喃西林、呋喃它酮、呋喃妥因和呋喃唑酮的检测限分别为 2 μ g/g、2 μ g/g、3 μ g/g 和 5 μ g/g。
与现有的方法技术相比，本发明取得的积极效果为
硝基呋喃类药物的分子结构母核是5-硝基呋喃环，呋喃西林、呋喃它酮、呋喃妥因和呋喃唑酮都含有这一结构，5-硝基糠醛也含有这一结构，针对5-硝基糠醛的抗体就能同时识别这四种药物。本发明以5-硝基糠醛为原料，合成了硝基呋喃类药物的通用半抗原， 制备了能同时快速检测饲料中呋喃西林、呋喃它酮、呋喃妥因和呋喃唑酮等四种药物的免疫纳米金试纸条，所制备的免疫纳米金试纸条可以在10分钟内检测被测样品中是否含有这四种药物，且该试纸条的成本价格低于5元，适合在饲料检测或食品动物检测中广泛应用。
图1为本发明中合成半抗原、免疫原和捕获抗原的示意图； 图2为本发明的免疫纳米金试纸条结构示意图。
具体实施例方式实施例1
(1)合成通用半抗原如图1所示，称取5-硝基糠醛60mg溶于3mL乙醇中(A液)，称取硫酸联氨70mg溶于7mL蒸馏水中(B液)。室温下将A液逐滴滴加到B液中，搅拌反应30 分钟，得黄色沉淀。用饱和碳酸钠溶液中和上述反应液至PH6. 0-8. 0后，将此混和液抽滤至干。所剩固体用15mL蒸馏水洗涤，再抽滤至干，自然干燥即得通用半抗原，合成反应的产率 74%，熔点243-245°C (5-硝基糠醛熔点39°C )，红外光谱特征吸收峰3150，3129，3099， 1641，1349，1251，1027，825，738 cnT1，紫外分光光度计对5-硝基糠醛和半抗原进行全波长扫描，结果两者的紫外吸收曲线基本相同，说明5-硝基糠醛本身的结构未被破坏，且半抗原中含有5-硝基糠醛的结构，表明半抗原合成成功；
(2)合成免疫原称取所述半抗原IOmg溶于7mL甲醇中，搅拌条件下逐滴滴加到含牛血清白蛋白40mg的磷酸缓冲液8mL (0. 01mol/L,pH7. 0-7. 4)中，然后逐滴加入25%的戊二醛溶液80 μ L，室温反应4小时。然后在4°C生理盐水中透析72小时，透析液冷冻保存；
(3)合成捕获抗原称取所述半抗原20mg溶于8mL甲醇中，冷却至4°C。然后，在4°C 条件下用盐酸调节PH为1. 0-3. 0，再逐滴加入0. 5mol/L的亚硝酸钠溶液lmL，搅拌反应至淀粉碘化钾试纸检验呈灰蓝色为止，然后用氢氧化钠溶液调pH至7. 5-9.0。将所得溶液逐滴加入到含卵清蛋白20mg的磷酸缓冲液8mL中(0. 01mol/L, pH7. 0-7. 4)，4°C搅拌反应 8_16h，然后在生理盐水中透析72小时，完全抗原的紫外全波长扫描曲线相当于载体的扫描曲线与半抗原紫外曲线的叠加，表明免疫原与捕获抗原合成成功；透析液冷冻保存；
(4)制备多克隆抗体将所述免疫原用生理盐水稀释为lmg/mL，加与稀释后免疫原溶液等量的氟氏完全佐剂制成乳化剂，在新西兰白兔的背部皮内多点注射进行首免，免疫剂量0.5mg/只；4周后，取lmg/mL的免疫原溶液加与此免疫原溶液等量的氟氏不完全佐剂乳化后在实验动物新西兰白兔背部皮下多点注射进行加强免疫，免疫剂量0. 5mg/只， 每4周加强免疫一次，共免疫8次；最后一次免疫，为免疫原直接耳缘静脉注射，免疫剂量 0. 5mg/只。然后，取兔全血分离血清，采用饱和硫酸铵法对血清中的IgG进行粗提；粗提液在磷酸缓冲液(0. 01mol/L, pH7. 0-7. 4)中透析3天以脱盐；透析液再用DEAE-52层析柱进行纯化；纯化后的IgG溶液再在磷酸缓冲液(0. 01mol/L,pH7. 0-7. 4)中透析3天以脱盐，最后冷冻保存；
(5)制备纳米金溶液取0.05%的氯金酸溶液IOOmL用恒温电磁搅拌器搅拌加热至沸腾，在持续搅拌的情况下加入3%的柠檬酸三钠溶液2mL，继续搅拌加热30分钟，至溶液呈透亮红色，室温冷却，用去离子水恢复至IOOmL,即得纳米金溶液，4°C保存备用；
(6)制备金标抗体将步骤(5)所得纳米金溶液用碳酸钾溶液(0.01mol/L,pH9. 0-9. 5) 调节PH至6. 5-8. 5。向其中加入IgG溶液，使IgG浓度为20 μ g/mL,摇勻后4°C静置50分钟。然后加入牛血清白蛋白使其浓度为洲，搅拌反应2小时，4°C静置3小时。然后1500r/ min离心25分钟，弃去沉淀，再将上清液以20000r/min 4°C离心60分钟，弃去上清液。将沉淀悬浮于IOmL磷酸缓冲液(0. 01mol/L, ρΗ7· 0-7. 4)中，以20000r/min 4_6°C离心30分钟，沉淀悬浮于8mL (0.01mol/L, pH7. 0_7. 4)磷酸缓冲液中，4°C保存。采用间接竞争酶联免疫吸附法对抗体的特异性进行检测，结果所得抗体对呋喃西林、呋喃唑酮、呋喃它酮和呋喃妥因的交叉反应率分别为95%、68%、61%和59%，检测限分别为22. 5,31. 5,35. 1,36. 3ng/ mL。表明以5-硝基糠醛为半抗原获得了能识别四种硝基呋喃类药物的抗体；
(7)制备免疫纳米金试纸条(a)将步骤(6)所得金标抗体用磷酸缓冲液(0.Olmol/ L，ρΗ7· 0-7. 4，含 3% 蔗糖，0. 1% 牛血清白蛋白，0. 05% Tween-20)稀释 4 倍后，按 20μ1/αιι2 的剂量喷涂在Glass 33型玻璃纤维素膜上(结合释放垫)，然后37°C烘20分钟；(b):将所述捕获抗原用碳酸缓冲液(0. 01mol/L, ρΗ9· 0-9. 5，含3%甲醇)稀释为8Pg/ml，在ΑΕ99型硝酸纤维素膜的检测线位置喷涂 μ ，在此硝酸纤维素膜的质控线位置喷涂1000倍稀释的羊抗兔IgG抗体 μ ，检测线与质控线间距8mm。将硝酸纤维素膜在37°C烘10分钟。再将硝酸纤维素膜在室温条件下(20 25°C)浸泡在磷酸缓冲液中(0. 01mol/L, pH7. 0-7. 4，含 0. 5%BSA, 0. 05%叠氮钠)封闭10分钟后，37°C烘10分钟；(c)如图2所示，依次将AE99硝酸纤维素膜、结合释放垫Glass 33玻璃纤维素膜、吸收垫Cotton Iinters沈68和样品垫 Glass 33粘贴在PVC背板上，最后裁剪为4X 50mm的试纸条。(8)饲料样品检测称取磨碎后的饲料样品5克于试管中，加入IOmL 50%的甲醇/ 水溶液(1:1，v/v)，振荡5分钟，4000r/min离心5分钟。检测时吸取10倍稀释的IOOyL 样品提取液滴至试纸条样品垫上，5分钟内读取结果，质控线显色而检测线不显色，则判断为阳性，即样品中至少含有呋喃西林、呋喃它酮、呋喃妥因和呋喃唑酮中的一种。本发明可同时检测饲料中呋喃西林、呋喃它酮、呋喃妥因和呋喃唑酮，对四种药物的检测限分别为2、2、3、5 μ g/g。实施例2
(1)合成通用半抗原称取5-硝基糠醛50mg溶于5mL乙醇中(Α液)；称取硫酸联氨 85mg溶于5mL蒸馏水中(B液);室温下将A液逐滴滴加到B液中，搅拌反应60分钟，得黄色沉淀；用饱和碳酸钠溶液中和上述反应液至PH6. 0-8. 0后，将此混和液抽滤至干；所剩固体用20mL蒸馏水洗涤，再抽滤至干，自然干燥即得通用半抗原；
(2)合成免疫原称取所述半抗原15mg溶于5mL甲醇中，搅拌条件下逐滴滴加到含牛血清白蛋白30mg的5mL磷酸缓冲液(0. 01mol/L,pH7. 0-7. 4)中；然后逐滴加入25%的戊二醛溶液60 μ L，室温反应4小时；然后在4°C生理盐水中透析72小时，透析液冷冻保存；
(3)合成捕获抗原称取所述半抗原IOmg溶于IOmL甲醇中，冷却至4°C;然后，在4°C条件下用盐酸调节PH为1. 0-3. 0，再逐滴加入0. 3mol/L的亚硝酸钠溶液4mL，搅拌反应至淀粉碘化钾试纸检验呈灰蓝色为止；然后用氢氧化钠溶液调PH至7. 5-9. 0 ；将所得溶液缓慢加入到含卵清蛋白IOmg的5mL磷酸缓冲液中(0. 01mol/L, pH7. 0-7. 4),4 ！搅拌反应 8-16h ；然后在生理盐水中透析72小时，透析液冷冻保存；
(4)制备多克隆抗体将所述免疫原用生理盐水稀释为lmg/mL，加与稀释后免疫原溶液等量的氟氏完全佐剂制成乳化剂，在新西兰白兔的背部皮内多点注射进行首免，免疫剂量0. 2mg/只；4周后，取lmg/mL的免疫原溶液加与此免疫原溶液等量的氟氏不完全佐剂乳化后在新西兰白兔背部皮下多点注射进行加强免疫，免疫剂量0. 2mg/只，每4周加强免疫一次，共免疫7次；最后一次免疫，为免疫原直接耳缘静脉注射，免疫剂量0. 2mg/只；然后，取兔全血分离血清，采用饱和硫酸铵法对血清中的IgG进行粗提；粗提液在磷酸缓冲液 (0. 01mol/L,pH7. 0-7. 4)中透析2天以脱盐；透析液再用DEAE-52层析柱进行纯化；纯化后的IgG溶液再在磷酸缓冲液(0. 01mol/L, pH7. 0-7. 4)中透析3天以脱盐，最后冷冻保存；
(5)制备纳米金溶液取0.01%的氯金酸溶液IOOmL用恒温电磁搅拌器搅拌加热至沸腾，在持续搅拌的情况下加入4%的柠檬酸三钠溶液lmL，继续搅拌加热20分钟，至溶液呈透亮红色，室温冷却，用去离子水恢复至IOOmL,即得纳米金溶液，4°C保存备用；
(6)制备金标抗体溶液将步骤(5)所得纳米金溶液用碳酸钾溶液(O.Olmol/L， ρΗ9· 0-9. 5)调节ρΗ至6. 5-8. 5 ；向其中加入IgG溶液，使抗体浓度为25 μ g/mL,摇勻后4°C 静置30分钟；然后加入牛血清白蛋白使其浓度为1%，搅拌反应1小时，4°C静置2小时；然后1500r/min离心20分钟，弃去沉淀，再将上清液以20000r/min 4°C离心30分钟，弃去上清液；将沉淀悬浮于15mL磷酸缓冲液(0. 01mol/L，pH7. 0-7. 4)中，以20000r/min 4°C离心 60分钟，沉淀悬浮于5mL (0. 01mol/L, pH7. 0-7. 4)磷酸缓冲液中，即得金标抗体溶液，4°C 保存；
(7)制备免疫纳米金试纸条(a)将步骤(6)所得金标抗体溶液用磷酸缓冲液 (0. 01mol/L, pH7. 0-7. 4，含 3% 蔗糖，0. 1% 牛血清白蛋白，0. 05% Tween-20)稀释 6 倍后， 按20μ Α:πι2的剂量喷涂在Glass 33型玻璃纤维素膜上(结合释放垫)，然后37°C烘10分钟；(b)将所述捕获抗原用碳酸缓冲液(O.Olmol/L，pH9. 0-9.5,3%甲醇)稀释为8μβ/ ml，在ΑΕ99型硝酸纤维素膜的检测线位置喷涂2μ1，在此硝酸纤维素膜的质控线位置喷涂 1500倍稀释的羊抗兔IgG抗体2μ1，检测线与质控线间距5mm ；将硝酸纤维素膜在37°C烘 15分钟；再将硝酸纤维素膜在室温条件下(20 25°C)浸泡在磷酸缓冲液中(0. 01mol/L, ρΗ7· 0-7. 4，0. 5%BSA, 0. 05%叠氮钠)封闭10分钟后，37°C烘15分钟；(c)依次将AE99硝酸纤维素膜、结合释放垫Glass 33玻璃纤维素膜、吸收垫Cotton Iinters沈68和样品垫 Glass 33粘贴在PVC背板上；最后裁剪为4X 50mm的试纸条。称取磨碎后的饲料样品5克于试管中，加入IOmL 50%的甲醇/水溶液(1 1，ν/ ν)，振荡5分钟，4000r/min离心5分钟。检测时吸取10倍稀释的100 μ L样品提取液滴至试纸条样品垫上，5分钟内读取结果，质控线和检测线均显色(两条红线)，则判为阴性，被测样品中不含呋喃西林、呋喃它酮、呋喃妥因和呋喃唑酮中的任何一种。实施例3
(1)合成通用半抗原称取5-硝基糠醛80mg溶于4mL乙醇中(Α液)；称取硫酸联氨 IOOmg溶于IOmL蒸馏水中(B液);室温下将A液逐滴滴加到B液中，搅拌反应40分钟，得黄色沉淀；用饱和碳酸钠溶液中和上述反应液至PH6. 0-8. 0后，将此混和液抽滤至干；所剩固体用IOmL蒸馏水洗涤，再抽滤至干，自然干燥即得通用半抗原；
(2)合成免疫原称取所述半抗原20mg溶于IOmL甲醇中，搅拌条件下逐滴的滴加到含牛血清白蛋白50mg的磷酸缓冲液(0. 01mol/L,pH7. 0-7. 4)中；然后逐滴加入25%的戊二醛溶液100 μ L，室温反应4小时；然后在4°C生理盐水中透析72小时，透析液冷冻保存；
(3)合成捕获抗原称取所述半抗原15mg溶于5mL甲醇中，冷却至4°C;然后，在4 °C 条件下用盐酸调节PH为1. 0-3. 0，再逐滴加入0. 2mol/L的亚硝酸钠溶液3mL，搅拌反应至淀粉碘化钾试纸检验呈灰蓝色为止；然后用氢氧化钠溶液调PH至7. 5-9. 0 ；将所得溶液逐滴加入到含卵清蛋白15mg的IOmL磷酸缓冲液中(0. 01mol/L, ρΗ7· 0-7. 4),4 °C搅拌反应 8-16h ；然后在生理盐水中透析72小时，透析液冷冻保存；
(4)制备多克隆抗体将所述免疫原用生理盐水稀释为lmg/mL，加与稀释后免疫原溶液等量的氟氏完全佐剂制成乳化剂，在新西兰白兔的背部皮内多点注射进行首免，免疫剂量0. 8mg/只；3周后，取lmg/mL的免疫原溶液加与此免疫原溶液等量的氟氏不完全佐剂乳化后在新西兰白兔背部皮下多点注射进行加强免疫，免疫剂量0. Smg/只，每4周加强免疫一次，共免疫6次；最后一次免疫，为免疫原直接耳缘静脉注射，免疫剂量0. Smg/只 ’然后，取兔全血分离血清，采用饱和硫酸铵法对血清中的IgG进行粗提；粗提液在磷酸缓冲液 (0. 01mol/L,pH7. 0-7. 4)中透析2天以脱盐；透析液再用DEAE-52层析柱进行纯化；纯化后的IgG溶液再在磷酸缓冲液(0.01mol/L，pH7. 0-7.4)中透析2天以脱盐，最后冷冻保存；
(5)制备纳米金溶液取0.03%的氯金酸溶液IOOmL用恒温电磁搅拌器搅拌加热至沸腾，在持续搅拌下加入1%的柠檬酸三钠溶液4mL，继续搅拌加热25分钟，至溶液呈透亮红色，室温冷却，用去离子水恢复至IOOmL,即得纳米金溶液，4°C保存备用；
(6)制备金标抗体溶液步骤(5)所得的纳米金溶液用碳酸钾溶液(O.Olmol/L， ρΗ9· 0-9. 5)调节ρΗ至6. 5-8. 5 ；向其中加入IgG溶液，使抗体浓度为23 μ g/mL,摇勻后4°C 静置60分钟；然后加入牛血清白蛋白使其浓度为1%，搅拌反应2小时，4°C静置3小时；然后1500r/min离心25分钟，弃去沉淀，再将上清液以20000r/min 4°C离心50分钟，弃去上清液；将沉淀悬浮于20mL磷酸缓冲液(0. 01mol/L，pH7. 0-7. 4)中，以20000r/min 4°C离心 40分钟，沉淀悬浮于IOmL (0. 01mol/L,pH7. 0-7. 4)磷酸缓冲液中，即得金标抗体溶液，4°C 保存；
(7)制备免疫纳米金试纸条(a)将步骤(6)所得金标抗体溶液用磷酸缓冲液 (0. 01mol/L, ρΗ7· 0-7. 4，含 3% 蔗糖，0. 1% 牛血清白蛋白，0. 05% Tween-20)稀释 5 倍后，按 20μ1/οπι2的剂量喷涂在Glass 33型玻璃纤维素膜上(结合释放垫)，然后37°C烘15分钟； (b)将所述捕获抗原用碳酸缓冲液(0. 01mol/L, ρΗ9· 0-9. 5,3%甲醇)稀释为8“g/ml，在 AE99型硝酸纤维素膜的检测线位置喷涂2μ1，在此硝酸纤维素膜的质控线位置喷涂1000倍稀释的羊抗兔IgG抗体2μ1，检测线与质控线间距6mm ；将硝酸纤维素膜在37°C烘20分钟； 再将硝酸纤维素膜在20 25°C下浸泡在磷酸缓冲液中(0. 01mol/L, pH7. 0-7. 4,0. 5%BSA, 0. 05%叠氮钠)封闭10分钟后，37°C烘20分钟；(c)依次将AE99硝酸纤维素膜、结合释放垫Glass 33玻璃纤维素膜、吸收垫Cotton Iinters 2668和样品垫Glass 33粘贴在PVC 背板上；最后裁剪为4X50mm的试纸。 称取磨碎后的饲料样品5克于试管中，加入IOmL 50%的甲醇/水溶液(1 1，ν/v)，振荡5分钟，4000r/min离心5分钟。检测时吸取10倍稀释的100 μ L样品提取液滴至试纸条样品垫上，5分钟内读取结果，质控线显色而检测线不显色，则判断为阳性，即样品中至少含有呋喃西林、呋喃它酮、呋喃妥因和呋喃唑酮中的一种。
权利要求
1. 一种快速检测四种硝基呋喃类药物的免疫纳米金试纸条，其特征在于其制备方法如下(1)合成通用半抗原称取5-硝基糠醛50-80mg溶于3_5mL乙醇中得A液；称取硫酸联氨70-100mg溶于5-10mL蒸馏水中得B液；室温下将A液逐滴滴加到B液中，搅拌反应 30-60分钟，得黄色沉淀；用饱和碳酸钠溶液中和上述反应液至pH6. 0-8. 0后，将此混和液抽滤至干；所剩固体用10-20mL蒸馏水洗涤，再抽滤至干，自然干燥即得通用半抗原；(2)合成免疫原称取所述半抗原10-20mg溶于5-10mL甲醇中，搅拌条件下逐滴滴加到含牛血清白蛋白30-50mg的浓度为0. 01mol/L、pH7. 0-7. 4磷酸缓冲液5-lOmL中；然后逐滴加入浓度为25%的戊二醛溶液60-100μ L，20-25°C反应4小时即得免疫原溶液，然后在 4°C生理盐水中透析72小时，透析液冷冻保存；(3)合成捕获抗原称取所述半抗原10-20mg溶于5-10mL甲醇中，冷却至4。C；然后，在4 °C条件下用盐酸调节pH为1. 0-3. 0，再逐滴加入0. 2-0. 5mol/L的亚硝酸钠溶液l_4mL，搅拌反应至淀粉碘化钾试纸检验呈灰蓝色为止；然后用氢氧化钠溶液调pH至 7. 5-9. 0 ；将所得溶液逐滴加入到含卵清蛋白10-20mg的浓度为0. 01mol/L、pH7. 0-7. 4的磷酸缓冲液5-10mL中，4°C搅拌反应8_16h即得捕获抗原溶液，然后在生理盐水中透析72小时，透析液冷冻保存；(4)制备多克隆IgG抗体将所述免疫原用生理盐水稀释为lmg/mL，加与稀释后免疫原溶液等量的氟氏完全佐剂制成乳化剂，在实验动物家兔的背部皮内多点注射进行首免， 免疫剂量0. 2-0. Smg/只；3-4周后，取lmg/mL的免疫原溶液加与免疫原溶液等量的氟氏不完全佐剂乳化后在实验动物家兔背部皮下多点注射进行加强免疫，免疫剂量0. 2-0. Smg/ 只，每4周加强免疫一次，共免疫6-8次；最后一次免疫，为免疫原直接耳缘静脉注射，免疫剂量0. 2-0. 8mg/只；然后，取兔全血分离血清，采用饱和硫酸铵法对血清中的IgG进行粗提；粗提液在浓度0. Olmol/L、pH7. 0-7. 4的磷酸缓冲液中透析2_3天以脱盐；透析液再用 DEAE-52层析柱进行纯化；纯化后的IgG溶液再在浓度0. 01mol/L, pH7. 0-7. 4的磷酸缓冲液中透析2-3天以脱盐，即得多克隆IgG抗体溶液，最后冷冻保存；(5)制备纳米金溶液取0.01%-0. 05%的氯金酸溶液IOOmL恒温搅拌加热至沸腾，在持续搅拌的情况下加入1%_4%的柠檬酸三钠溶液l_4mL，继续搅拌加热20-30分钟，至溶液呈透亮红色，室温冷却，用去离子水恢复至IOOmL,即得纳米金溶液，4°C保存备用；(6)制备金标抗体将步骤(5)所得的纳米金溶液用浓度0.01mol/L的碳酸钾溶液调节pH至6. 5-8. 5 ；向其中加入步骤(4)所得多克隆IgG溶液，使IgG抗体浓度为20-25 μ g/ mL，摇勻后4°C静置30-60分钟；然后加入牛血清白蛋白使其浓度为1%- ，搅拌反应1_2小时，4°C静置2-3小时；然后1500r/min离心20-30分钟，弃去沉淀，再将上清液以20000r/ min 4°C离心30-60分钟，弃去上清液；将沉淀悬浮于10_20mL浓度0. 01mol/L、ρΗ7· 0-7. 4 的磷酸缓冲液中，以20000r/min 4°C离心30-60分钟，沉淀悬浮于5_10mL浓度0. 01mol/L、 pH7. 0-7. 4的磷酸缓冲液中，即为金标抗体溶液，4°C保存；(7)制备免疫纳米金试纸条(a)将步骤(6)所得金标抗体溶液用浓度0.Olmol/L、 pH7. 0-7. 4的磷酸缓冲液稀释4-6倍，所述磷酸缓冲液中含3%蔗糖、0. 1%牛血清白蛋白和 0. 05% Tween-20，按20μ1/αιι2的剂量喷涂在Glass 33型玻璃纤维素膜即结合释放垫上，然后37°C烘10-20分钟；(b):将所述捕获抗原用浓度0. 01mol/L、pH9· 0-9. 5的含3%甲醇的碳酸缓冲液稀释为8Pg/ml，在AE99型硝酸纤维素膜的检测线位置喷涂1_2μ1 ；在此硝酸纤维素膜的质控线位置喷涂1000-1500倍稀释的羊抗兔IgG抗体1_2μ1，检测线与质控线间距5-8mm ；将硝酸纤维素膜在37°C烘10-20分钟；再将硝酸纤维素膜在20 25°C下浸泡在浓度0. 01mol/L、pH7. 0-7. 4的磷酸缓冲液中封闭10分钟，所述磷酸缓冲液中含0. 5%BSA和 0. 05%叠氮钠，然后将硝酸纤维素膜在37°C烘10-20分钟；(c)依次将AE99硝酸纤维素膜、结合释放垫Glass 33玻璃纤维素膜、吸收垫Cotton Iinters沈68和样品垫Glass 33 粘贴在PVC背板上；最后裁剪为4X50mm的试纸条。
2.根据权利要求1所述的一种快速检测四种硝基呋喃类药物的免疫纳米金试纸条，其特征在于所制备的免疫纳米金试纸条用于现场检测时，先处理待检样品，然后将处理好的待检样品IOOyL滴至样品垫上，5分钟内读取结果，若有两条红色显色带即质控线和检测线均显色，则判为阴性；若有一条红色显色带即质控线显色而检测线不显色，则判为阳性。
3.根据权利要求1所述的一种快速检测四种硝基呋喃类药物的免疫纳米金试纸条，其特征在于所制备的免疫纳米金试纸条对呋喃西林、呋喃它酮、呋喃妥因和呋喃唑酮的检测限分别为 2 μ g/g、2 μ g/g、3 μ g/g 和 5 μ g/g。
全文摘要
本发明涉及一种快速检测四种硝基呋喃类药物的免疫纳米金试纸条，其是以5-硝基糠醛为原料，合成了针对呋喃西林、呋喃它酮、呋喃妥因和呋喃唑酮四种硝基呋喃类药物的通用半抗原以及免疫原和捕获抗原，然后通过免疫实验动物家兔获得多克隆IgG抗体，再用纳米金和多克隆IgG抗体制备金标抗体，将金标抗体溶液喷涂在Glass33型玻璃纤维素膜即结合释放垫上，捕获抗原和羊抗兔抗体分别涂在AE99型硝酸纤维素膜的检测线和质控线位置，然后依次将AE99硝酸纤维素膜、结合释放垫Glass33玻璃纤维素膜、吸收垫Cottonlinters2668和样品垫Glass33粘贴在PVC背板上，最后裁剪为4×50mm的试纸条。本发明能同时快速检测饲料中呋喃西林、呋喃它酮、呋喃妥因和呋喃唑酮四种药物，且该试纸条的成本价格低于5元，适合在饲料检测或食品动物检测中广泛应用。
文档编号G01N33/532GK102183634SQ20111005139
公开日2011年9月14日 申请日期2011年3月4日 优先权日2011年3月4日
发明者刘怡菲, 刘聚祥, 张治洲, 王建平, 王萍, 赵彦岭 申请人:河北省兽药监察所