专利名称：D-二聚体时间分辨荧光免疫分析试剂盒及其制备方法
技术领域：
木发明属于免疫分析医学领域，木发明公开丫 -种D-聚体时间分辨荧光免疫分析试剂盒及其制备方法。
背景技术：
[)-聚体(D-dimer)是纤维蛋Π笮体(SFM)经活化因rXTTTa交联后冉经纤溶_ 水解产'+:的一种特异降解产物，D-聚体浓度升高反映体内纤维蛋Π溶解性增强,有助于血栓前状态及血栓形成性疾病的诊断,疗效观察及预后判断。B前检测D-聚体的免疫分析方法 要有乳胶凝集法，Sj联免疫法，免疫过滤胶体金 色反应法。上述方法都有各Π的缺点乳胶凝集法只能定性检测，不能测定血浆巾 D-聚体含it的变化。_联免疫法操作容易受到酶活性变化的影响，结果不太准确。免疫过滤胶体金显色反应法特异性不好。
发明内容
木发明的0的是克服现有技术巾的小足.提供-种D-聚体时间分辨荧光免疫分析试剂盒。木发明的第个B的是提供-种D-聚体时间分辨荧光免疫分析试剂盒的制备方法。木发明的技术方案概述如下[)-聚体时间分辨荧光免疫分析试剂盒，山下述成分组成DD-聚体校准品，用下述方法制成ffl人血浆或人红血球将D-聚体抗原纯品稀释成系列浓度.毎瓶装0. 5毫7卜每个浓度点，真空十燥,所述D-聚体抗原纯度> 90%;2) D-聚体中克隆抗体ti被的微孔板；3)铕元索标E的另-株D-聚体中.克隆抗体4)洗涤液，用下述方法制成取1. 212g三羟甲基鉍*甲烷，溶于900mL去离了-水中，用盐酸调节PH值为7. 8.加去离子水至lOOOmL，再加入氯化钠9g,加入Tween20 0. ImL, 完全溶解；5)增强液，用下述方法制成取IOOOmL双蒸水，加入3. 6mL冰醋酸.0. 5g醋酸钠， 0.002 O.Olg β-萘甲酰三氟丙酮，0. 01 0. 05g三辛基氧化膦，1 2mL Triton X-100, 混勻；6)分析缓冲液，用下述方法制成取6. 06三羟甲基氨基甲烷，溶于900mL去离子水中，用盐酸调节PH值为7. 8，加去离子水至lOOOmL,再加入IOg牛血清白蛋白，完全溶解。所述[)-聚体中克隆抗体包被的微孔板是用下述方法制成将D-聚体中克隆抗体溶解于ti被稀释液巾.使其浓度为5ug/mL,加入微孔扳巾，使200μ 1/孔,37'C放置；M 小时，用包被稀释液250微升/孔洗板1次,再用质量百分浓度为2% BSA溶液封闭，室温十燥，所述包被稀释液是ffl下述方法制成取6. 06三羟甲基鉍基甲烷，溶于900mL去离了-水中’用盐酸调节PH值为7. 8,加去离子水至1 OOOinL.再加入1 Og牛血清白蛋白，完全溶解。所述铕元索标β的另一株D-聚体φ.克隆抗体是用下述方法制成将50 IOOug D-聚体单克隆抗体溶于50 μ 1 0. OlM pH = 8. 5的碳酸盐缓冲液中，加λ使用 100 μ 1双蒸水溶解的40mg的.异硫氰酸苄基亚乙基三胺四乙酸铕钠,在4t反应12-18小时，将反应液转移到预先用0.05M pH = 7. 8TriS-HCl缓冲液平衡的Sephadex G50柱上层析分离，以0. 05M pH = 7. STris-HCl平衡液洗脱，自动收集.用紫外分光光度计检测蛋白浓度,收集第--个大峰。[)-聚体时间分辨荧光免疫分析试剂盒的制备方法，包括如下步骤1)配制D-聚体校准品，配制方法是用人血浆或人红血球将D-聚体抗原纯品稀释成系列浓度，毎瓶装0. 5毫:/I·毎个浓度点，真空十燥.所述D-聚体抗原纯度 5 90% ；2)制备D-聚体中克隆抗体ti被的微孔扳；3)制备铕元素标ill的另-株D-聚体中克隆抗体4)配制洗涤液，配制方法为取1. 212g三羟甲基氨基甲烷，溶于900raL去离子水中，用盐酸调节PH值为7. 8.加去离子水至lOOOmL，再加入氯化钠9g,加入Tween20 0. ImL, 完全溶解；5)配制增强液,配制方法为取IOOOmL双蒸水，加入3.6mL冰醋酸,0.5g醋酸钠， 0.002 O.Olg β-萘甲酰三氟丙酮，0. 01 0. 05g三辛基氧化膦，1 2mL Triton X-100, 混勻；6)配制分析缓冲液，配制方法为取6. 06三羟甲基氨基甲烷，溶于900ml.去离子水中，用盐酸调节PH值为7. 8，加去离子水至lOOOmL,再加入IOg牛血清白蛋白，完全溶解。所述[)-聚体中克隆抗体包被的微孔板是用下述方法制成将D-聚体中克隆抗体溶解于ti被稀释液巾.使其浓度为5ug/mL,加入微孔扳巾，使200μ 1/孔,37'C放置；M 小时，用包被稀释液250微升/孔洗板1次,再用质量百分浓度为2% BSA溶液封闭，室温十燥，所述包被稀释液是ffl下述方法制成取6. 06三羟甲基鉍基甲烷，溶于900mL去离了-水巾，用盐酸调节PfUSS 7.8,加去离了-水至IOOOmL,冉加入1 Og牛血淸Π蛋Π ,完个溶解。所述铕元索标β的另一株D-聚体笮克隆抗体是用下述方法制成将50 IOOug D-聚体单克隆抗体溶于50 μ 1 0. OlM pH = 8. 5的碳酸盐缓冲液中，加λ使用 100 μ 1双蒸水溶解的40mg的.异硫氰酸苄基亚乙基三胺四乙酸铕钠,在4t反应12-18小时，将反应液转移到预先用0. 05M pH = 7. 8Tris-HCl缓冲液平衡的Sephadex G50柱上层折分离，以0. 05M pH = 7. STris-HCl平衡液洗脱，自动收集，用紫外分光光度计检测蛋白浓度,收集第--个大峰。用木发明的试剂盒能定M检测人血浆中I)-聚体的含《,具有高灵敏，高特异， 高通S,准确度商,性能稳定.成木较低等特点。
阁1为实施例1所制备的试剂盒中的校准品线形阁(双对数标准曲线)。
具体实施方式
下而的实施例u丨以使木须域的技术人员更个而的理解本发明，似并小以仟何方式限制木发明。木发明使用时间分辨荧光免疫分析法,其*木原理是用三价镧系稀土离了-及其螯合物作为示踪物.代锌荧光物质、同位素、酶和化学发光物质,标E抗原、抗体、核酸探针等物质当免疫反应发牛后，根据镧系稀土离了·螯合物的荧光光谱的特点(特异性强、荧光光谱的Mokes位移、寿命Ii ),用时间分辨荧光分析仪,测定免疫反应最后产物的荧光强度。根据荧光强度和相对荧光强度比值,判断反应体系巾分析物的浓度,达到定 分析的B下面结合实施例对本发明作进--步的说明。实施例1 I)-聚体校准品的制备用人红血球(來Π天津塘沽血站)将丨)-聚体抗原(纯度> 90% )稀释成系列 ？农度，浓度分别是:0ng/mL, 10ng/mL,50ng/mL,200ng/mL,600ng/mL, 1000ng/mL=共 6 瓶’每瓶装O.I5mL,真空十燥，备用。施例中的人红血球，也4以ffl人血浆替代。实施例2 D-聚体中克隆抗体包被微孔板的方法配制fe被稀释液取6. 06三羟甲基鉍基甲烷，溶于900mL去离了·水中，用0. IM盐酸调节pH值为7. 8’加去离子水至IOOOmL,再加入IOg牛血清白蛋白.完全溶解，备用。将D-聚体中克隆抗体溶解于ti被稀释液中，使其浓度为5ug/mL.加入微孔板中，使200 μ 1/孔，37。C放置24小时，用包被稀释液250微升/孔洗板1次’再用质量百分浓度为2% BSA溶液封闭,6小时后室温干燥。实施例3铕元索标C的另一株D-聚体中克隆抗体的方法将80 μ g另一株D-二聚体单克隆抗体溶于50 μ 1 0. OlM pH = 8. 5的碳酸盐缓冲液中，加入使用100μ 1双蒸水溶解的40mg的异硫氰酸苄基亚乙*三胺四乙酸铕钠，在 4。C反应14小时，将反应液转移到预先用0. 05M pH = 7. 8Tris-HCl缓冲液平衡的kphadex G50柱上层析分离，以0. 05M pH = 7. 8Tris-HCl平衡液洗脱，自动收集.用紫外分光光度计检测蛋η浓度.收集第-个大峠，合并后加入防腐剂备用。另一株D-聚体中克隆抗体也Uj以用50 μ g或100 μ g锌代木实施例的80 U g.其它步骤同实施例3,用于铕元索标E的另-株D-聚体中克隆抗体的制备。在4'C反应的时间也可以用12小时或18小时替代本实施例的14小时，其它同步骤同实施例3,币于铕元素标β的另-tt D-聚体φ.克隆抗体的制备。实施例4 D-聚体时间分辨荧光免疫分析试剂盒，山下述成分组成DD- ι.聚体校准品，山实施例1公开的方法制备；2) D-聚体中克隆抗体ti被的微孔板，山实施例2公开的方法制备；3)铕元索标E的另-株D-聚体中.克隆抗体，山实施例3公开的方法制备4)洗涤液，用下述方法制成取1. 212g三羟甲基‘镇*甲烷，溶于900mL去离了-水中，用盐酸调节PH值为7. 8.加去离子水至lOOOmL，再加入氯化钠9g,加入Tween20 0. ImL, 完全溶解；5)增强液，用下述方法制成取IOOOmL双蒸水，加入3. 6mL冰醋酸.0. 5g醋酸钠， 0.002 O.Olg β-萘甲酰三氟丙酮，0. 01 0. 05g三辛基氧化膦，1 2mL Triton X-100,混勻；6)分析缓冲液，用下述方法制成取6. 06三羟甲基氨基甲烷，溶于900mL去离子水中，用盐酸调节PH值为7. 8，加去离子水至lOOOmL,再加入IOg牛血清白蛋白，完全溶解。实施例5本发明I)-聚体时间分辨荧光免疫分析试剂盒的使ffl方法1、样木要求毎次检测至少需要120微升人血浆样木。用静脉穿刺法采集静脉血，加入肝素抗凝血，用2000g离心15分钟分离出血浆。样品在2°C -8-C uj以保存8小时。严重溶血的样木对测定结果有影响。4能含有高浓度D-聚体的血浆应使ffl分析缓冲液稀释。2、检测方法2. 1试剂的准备(1)铕元素标ill的另一株D-聚体中克隆抗体(标E物)的稀释须在使用前半小时配制。每条反应孔需将15ul标记物和1. 5mL的分析缓冲液混匀(按照分析缓冲液标ill物=100 1稀释)，备用。稀释后的标ill物应在1小时内使用并YXffl完。(2)1)-聚体校准品的溶解将校准品瓶中加0. 5ml.去离7水，完:t溶解后备用。2.2从密封袋中取出D-聚体中克隆抗体包被的微孔板,取下所需数 的微孔条,将其固定于支架上，余下的微孔条放入密封袋巾。2. 3加样步骤如下(1)每孔加100 μ 1的D- 二聚体校准品或样品，室温振荡孵育1小时。(2)用洗涤液300 μ L/孔冲洗4次，轻轻拍干。(3)加入100μ 1以分析缓冲液稀释的标记物，室温振荡孵育1小时。(4)用洗涤液300 μ L/孔冲洗6次，轻轻拍干。(5)每孔加增强液200μ1。(加入增强液之前，吸头应使用增强液洗两次,加入过程中应避免碰到小孔边缘或其底部，以免产牛污染)。(6)室温振荡孵育5分钟后，ffl时间分辨荧光仪测:《,测 前保证毎个样品扳条平稳地放到测S架巾。2. 4以校准品浓度的Log值为横坐标，时间分辨荧光仪读数的Log值为纵坐标绘制标准曲线，以待测血浆的读数在标准曲线上查出该血浆中D--聚体的浓度。见附阁1。实施例6木发明试剂盒的方法学鉴定1、灵敏度试剂盒的灵敏度小高于Ing/mL。2、特异性与其它相关物质无明显交叉反应。3、测M范围试剂盒的测S范围0-1000ng/mI,。4、线性相关系数在试剂盒的测S范围内，剂S -反应曲线线性相关系数(r)应小低于0. 99。5、测定准确性
以D-―聚体Ul家标准品为对照品，试剂盒校准品的实测效价与标定效价的比值应该在0. 90 1. 10之间。6、测量精密度试剂盒的批内不精密度(CV% )应不超过10.0% ；批间不精密度(CV% )应不超过 15. 0%。7、质控品测定值质控品测定值应在允许范围内。8、稳定性将木发明试剂盒放置37Γ ±0. 5'C 7天后检测上述1 7各项，结果应符合各项目规定的要求。
权利要求
1.D-聚体时间分辨荧光免疫分析试剂盒,其特征是山下述成分组成DD-聚体校准品，用下述方法制成用人血浆或人红血球将D-聚体抗原纯品稀释成系列浓度，每瓶装0.5毫升毎个浓度点.真空十燥,所述D-聚体抗原纯度乡90% ；2)D-聚体φ.克隆抗体包被的微孔板..3)铕元素标β的另一株I)-聚体中.克隆抗体；4)洗涤液，用下述方法制成取1.212g三羟甲基鉍基甲烷，溶于900ml.去离了-水巾，用盐酸调节PH值为7. 8’加去离子水至1 OOOinI,,再加入氯化钠9g,加入Tween200. ImL,完全溶5)增强液，用下述方法制成取1OOOmL双蒸水’加入3. 6mL冰醋酸，0. 5g醋酸钠’ 0.002 0. OlgP-萘甲酰三氟丙酮,0.01 0. 05g三辛基氧化膦，1 ~~ 2mL Triton X-100, 混勻；6)分析缓冲液.用下述方法制成取6.06三羟甲基氨基甲烷，溶于900ml.去离子水中， 用盐酸调节PH值为7.8，加去离子水至IOOOmL,再加入IOg牛血清白蛋白，完全溶解。
2.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于所述D-聚体中克隆抗体包被的微孔板是用下述方法制成将D-聚体中克隆抗体溶解于包被稀释液中，使其浓度为5ug/mL,加入微孔板中，使200 μ 1/孔，37。C放置24小时’用包被稀释液250微升/孔洗板1次,再用质 浓度为2 。BSA溶液封闭，室温十燥，所述包被稀释液是用下述方法制成取6. 06三轻甲基氨基甲烷.溶于900mL去离子水中，用盐酸调节pH值为7. 8’加去离子水至IOOOinL. 冉加入IOg牛血淸Π蛋Π,完企溶解。
3.根据权利要求1所述的试剂盒.其特征是所述铕元索标E的另一株D-聚体中克隆抗体是ffl下述方法制成将50 100 μ g D-聚体中克隆抗体溶于50 μ 1 0. OlM pH = 8. 5的碳酸盐缓冲液中，加入使用IOOu 1双蒸水溶解的40mg的异硫氰酸苄基亚乙基三胺四乙酸铕钠，在4'C反应12-18小时，将反应液转移到预先用0. 05M pH = 7. 8 Tris-HCl缓冲液平衡的Sephadex G50柱上层析分离，以0. 05M pH = 7. 8 Tris-HCl平衡液洗脱，自动收集,用紫外分光光度计检测蛋Π浓度,收集第-个大畔-。
4.D-聚体时间分辨荧光免疫分析试剂盒的制备方法.其特征在于包括如下步骤1)配制I)-聚体校准品，配制方法是人血浆或人红血球将D-聚体抗原纯品稀释成系列浓度，毎瓶装0. 5毫升毎个浓度点，真空十燥,所述I)-聚体抗原纯度90% ；2)制备[)-聚体φ.克隆抗体包被的微孔板3)制备铕元素标记的另--株D-聚体单克隆抗体:4)配制洗涤液,配制方法为取1.212g三羟甲基氨基甲烧,溶于900mL去离子水中，用盐酸调节PH值为7. 8，加去离子水至1 OOOinI,,再加入氯化钠9g,加入Tween200. ImL,完全溶5)配制增强液’配制方法为取1OOOmL双蒸水，加入3. 6mL冰醋酸，0. 5g醋酸钠’ 0.002 0. Olg P-萘甲酰三氟丙酮，0.01 0. 05g三辛基氧化膦，1、2mL Triton X-100, 混勻6)配制分析缓冲液，配制方法为取6.06三羟甲基氨基甲烷，溶于900mL去离子水中， 用盐酸调节PH值为7.8，加去离子水至IOOOmL,再加λ IOg牛血清白蛋白，完全溶解。
5.根据权利要求书4所述的制备方法.其特征在于所述D-聚体φ.克隆抗体包被的微孔板是用下述方法制成将D-聚体中.克隆抗体溶解于包被稀释液中，使其浓度为J5ug/ mL,加入微孔板中，使200 μ 1/孔，37。C放置24小时’用包被稀释液250微升/孔洗扳1次’ 冉用质MTJ分浓度为2 。BSA溶液封闭，室温十燥,所述ti被稀释液是用下述方法制成取 6. 06三羟甲基鉍基甲烷，溶于900mL去离7水中，用盐酸调节pH值为7. 8,加去离了·水至 1 OOOinL,再加入1 Og牛血清白蛋白，完全溶解。
6.根据权利要求书4所述的制备方法,其特征在于所述铕元索标C的另_ -株D-二聚体单克隆抗体是用下述方法制成将50 IOOyg D-聚体单克隆抗体溶于50 μ 1 0. OlM pH =8. 5的碳酸盐缓冲液巾，加入使用100μ 1双蒸水溶解的40mg的异硫氰酸苄* 亚乙* 三胺四乙酸铕钠，在4°C反应12-18小时，将反应液转移到预先用0. 05M pH = 7. 8 Tris-HCl 缓冲液平衡的Sephadex G50柱上层析分离，以0. 05M pH = 7. 8 Tris-HCl平衡液洗脱，自动收集.用紫外分光光度计检测蛋Π浓度.收集第-个大峠。
全文摘要
本发明公开了一种D-二聚体时间分辨荧光免疫分析试剂盒及其制备方法，该试剂盒由下述成分组成1)D-二聚体校准品；2)D-二聚体单克隆抗体包被的微孔板；3)铕元素标记的另一株D-二聚体单克隆抗体；4)洗涤液；5)增强液；6)分析缓冲液，用本发明的试剂盒能定量检测人血浆中D-二聚体的含量，具有高灵敏，高特异，高通量，准确度高，性能稳定，成本较低等特点。
文档编号G01N33/577GK102183652SQ20111005136
公开日2011年9月14日 申请日期2011年3月3日 优先权日2011年3月3日
发明者董全文 申请人:协和生物制药(天津)有限公司