专利名称：一种快速检测发酵液琥珀酸含量的方法
技术领域：
本发明涉及琥珀酸发酵技术领域的检测方法，具体地，涉及一种基于琥珀酸与硫酸铜显色反应快速检测发酵液中琥珀酸含量的方法。
背景技术：
琥珀酸(Succinic acid)是重要的有机酸产品，目前主要应用于以下四个领域 一是作为表面活性剂、清洁剂添加剂和起泡剂；二是作为离子鳌合剂，用于电镀行业防止金属的溶蚀和点蚀；三是应用于食品行业作为酸化剂、PH改良剂、风味物质和抗菌剂；四是应用医药、抗生素、氨基酸和维生素的生产。琥珀酸在这四大领域中的销售量每年超过4亿美元。近年，我国中科院理化技术研究所工程塑料国家工程研究中心利用琥珀酸为聚合单体， 与丁二醇缩聚合成高性能聚酯材料聚琥珀酸丁二醇酯(PBS)取得突破性进展，并经过了万吨级生产装置验证，PBS有望成为我国第一种全生物降解材料，这对作为聚合原料的琥珀酸的市场扩大产生巨大的推动。此外，以琥珀酸为原料，还可直接合成1，4_ 丁二醇、四氢呋喃、N-甲基吡咯烷酮、2-吡咯烷酮、γ-丁内酯等重要的大宗化学品。鉴于琥珀酸日益增大的市场需求和广泛的用途，美国能源部2004年发布的报告《Top Value Added Chemicals From Biomass》将琥珀酸列为12种最有潜力的生物基平台化合物之首。目前工业上生产琥珀酸的方法主要是以石油基产品丁烷为原料的化学合成方法， 但化学法存在生产工艺要求严格，产品得率和纯度都不高，易造成环境污染，且使用原料不可再生等不足，采用环境友好的微生物发酵法生产琥珀酸将逐渐成为化学法的替代方案。 在琥珀酸发酵生产菌的分离或选育过程中，需要及时、高通量地分析不同菌株发酵液中的琥珀酸含量，以快速鉴别挑取高产菌株；在琥珀酸发酵过程中，必须经常性的对发酵液中琥珀酸含量进行分析，以合理的控制发酵进程。目前，琥珀酸的分析检测方法包括液相色谱法、毛细管电泳法、气相色谱法、薄层色谱法等。其中液相色谱法(中华人民共和国国家标准GB/T 5009. 157-2003;曹剑磊等.产琥珀酸重组大肠杆菌的构建和发酵性能.应用与环境生物学报，2010，16(6) 851-857.)具有检出限低、重现性好、精密度高等优点，是目前发酵液琥珀酸的准确定量分析的常用方法，但HPLC需使用价格昂贵的液相色谱仪，成本高、检测时间长，而且对系统的各项要求也很高；毛细管电泳法(韦寿莲等.毛细管电泳对叶下珠中有机酸的分离检测.分析测试学报，2009，28 (6) :692-696.)，气相色谱法(赵大云等.雪里蕻腌菜卤汁中有机酸成分气相色谱分析.上海交通大学学报(农业科学版)，2003，21 (3) =220-225,245.) 都存在使用设备昂贵、操作复杂繁琐、检测分析耗时久的相似问题，而且气相色谱法还需对琥珀酸进行衍生化处理，因此，这两种方法较少应用于发酵液琥珀酸的检测分析；有报道使用薄层层析法(何凌云等.薄层扫描法测定不同产区半夏药材中琥珀酸的含量.中成药， 2002,24(4) =290-292.；王光忠等.薄层扫描法测定地龙类药材中琥珀酸的含量.药物分析杂志，1997，17 (4) =274-275.)分析中药成分中琥珀酸的含量，但检测分析过程需要较长时间的层析展开，由于使用酸碱指示剂类显色剂染色，定量分析容易受发酵液中其他有机酸的干扰。
发明内容
本发明的目的在于针对目前技术的不足，提供一种利用硫酸铜与琥珀酸显色反应快速检测发酵液中琥珀酸含量的方法。这一方法根据铜试剂与琥珀酸在固体支持物上反应显色，在一定浓度范围内，琥珀酸浓度与显色斑的吸光值成线性关系，通过外标两点法计算琥珀酸的含量。为实现以上目的，本发明专利采用的技术方案是(1)琥珀酸发酵液的预处理使用无机酸碱调节发酵液pH，使发酵液中琥珀酸充分溶解。离心除去发酵液中的固形物，用蒸馏水制备成适当稀释倍数的待测样。(2)薄层扫描快速分析琥珀酸含量①配制硫酸铜-甲醇溶液称取适量硫酸铜加入甲醇中，摇勻，至硫酸铜完全溶解。试剂现配现用。②检测波长的选择取标准琥珀酸溶液，点样于硅胶板(或醋酸纤维薄膜等固体支持物上)，加热固定后使用硫酸铜-甲醇溶液进行显色反应。使用薄层扫描仪对样品斑点及空白进行光谱扫描，以样品斑点最强吸收峰波长为测定波长，以空白最小光吸收为参比波长。③绘制工作曲线精确配制标准琥珀酸溶液，点样于硅胶板(或醋酸纤维薄膜等固体支持物上)，加热固定后与硫酸铜-甲醇溶液进行显色反应。设定测定波长为 600-750nm，参比波长为450-550nm，薄层扫描分析样品点光吸收值。以峰面积积分值为纵坐标，标准琥珀酸含量为横坐标绘制工作曲线。④样品中琥珀酸含量分析将待测样点样于硅胶板(或醋酸纤维薄膜等固体支持物上)，加热固定后与硫酸铜_甲醇溶液进行显色反应。设定测定波长为600-750nm，参比波长为450-550nm，薄层扫描分析样品点光吸收值。选择合适的稀释率，使检样峰面积积分值位于标准曲线线性范围内，按外标两点法，根据检样稀释倍数即可计算出发酵液中琥珀
酸含量。本发明的优点在于琥珀酸发酵液中主要的副产物甲醇、乙醇、甲酸、乙酸、乳酸都不与硫酸铜发生显色反应，只有琥珀酸与硫酸铜发生显色反应；此外，上述副产物挥发性强，在显色前进行加热固定处理阶段使其大部分挥发，对琥珀酸显色反应的干扰很小。因此，本发明方法不用对发酵液进行层析分离，节省了分析检测的时间，提高了效率。利用薄层扫描仪检测显色斑的吸光值，操作简单，提高检测结果的精确度。整个分析检测不需要贵重试剂，成本低。本发明方法尤其适用于对琥珀酸发酵野生菌种或突变菌种大规模筛选的快速分析。
图1检样的全波段薄层扫描分析图。图中曲线1、2、3琥珀酸浓度分别为2g/L、4g/ L、6g/L。图2硫酸铜显色法绘制琥珀酸含量工作曲线
具体实施例方式为了更好的理解本发明，下面结合实施例子对本发明做进一步的描述。(1)配制硫酸铜-甲醇溶液称取Ig硫酸铜加入干燥的锥形瓶中，量取20_200mL 甲醇与硫酸铜混合，摇勻，至硫酸铜完全溶解。试剂现配现用。(2)标准琥珀酸溶液称取80 °C烘干至恒重的分析纯琥珀酸(sigma公司)2000mg，加入蒸馏水溶解，定容至IOOmL,然后用蒸馏水稀释配制成浓度为0、2、4、6、8、 10、12g/L的标准琥珀酸溶液。(3)扫描波长的确定用微量进样器各吸取2ul浓度为2g/L、4g/L、6g/L的琥珀酸标准溶液，点样于硅胶板(或醋酸纤维薄膜等固体支持物上)，60-80°C加热固定l-5min，将硅胶板浸入硫酸铜_甲醇溶液进行显色反应l_5s后(也可将硫酸铜-甲醇溶液喷于硅胶板上进行显色反应)，40-60°C干燥l-5min。将显色好的硅胶板置于薄层扫描仪内扫描，先进行普通扫描定位待测物，再对定位的显色斑进行光谱扫描，波长范围从300nm-800nm。结果如下图1所示。选择薄层扫描检测的测定波长为680nm，参比波长为500nm。(4)绘制工作曲线用微量进样器准确吸取2μ L标准琥珀酸溶液，点样于硅胶板上(或醋酸纤维薄膜等固体支持物)，每个标准浓度设3个平行，60-80°C加热固定l-5min， 将硅胶板浸入硫酸铜_甲醇溶液进行显色反应l_5s后，40-60°C干燥l-5min。设定测定波长为680nm，参比波长为500nm，进行薄层扫描分析点样电光吸收值。以峰面积积分值为纵坐标，标准琥珀酸含量为横坐标绘制工作曲线，线性回归方程为Y = 1159. 5X+2258，决定系数R2 = 0. 9946。结果见图2。对空白测定20次，方法的检出限(3s/k)为0. 028mg/L。(5)制备微生物发酵液配制发酵培养基(初糖浓度20g/L)，高压蒸汽灭菌后按照 5%的接种量接入经紫外诱变获得的6株Actinobacillus succinogenes突变菌。在适宜的温度下厌氧发酵20h，获得发酵液。(6)琥珀酸发酵液的预处理取I-IOmL发酵液加适量氢氧化钠调节pH为 6. 8-7. 0，使发酵液中琥珀酸充分溶解。在3000-10000rpm的转速下离心10-20min后，取上清，用蒸馏水制备成稀释倍数分别为1、5、10倍的待测样。(7)样品中琥珀酸含量分析用微量进样器准确吸取2 μ L发酵20h的发酵液待测样物，点样于硅胶板(每个样品3个平行)，60-80°C加热固定l-5min，将硅胶板浸入硫酸铜_甲醇溶液进行显色反应l_5s后，40-60°C加热干燥l-5min。设定测定波长为680nm，参比波长为500nm，进行薄层扫描分析样品点光吸收值。按外标两点法计算出发酵液中琥珀酸含量。检测结果发酵液中琥珀酸的浓度分别为7. 87,5. 94,6. 38,6. 41,7. 19,7. 93g/L(8)加标回收试验分别吸取0. 5ml浓度为2、4、6g/L的琥珀酸标准液与0. 5ml发酵液样品(琥珀酸浓度约为6. 38g/L)混合均勻。用微量进样器准确吸取2 μ L上述样品，点样于硅胶板上(每个样品5个平行)，60-80°C加热固定l-5min，将硅胶板浸入硫酸铜-甲醇溶液进行显色反应l_5s后，40-60°C加热干燥l-5min。设定测定波长为680nm，参比波长为500nm，进行薄层扫描分析样品点光吸收值。按外标两点法，计算上述样品中琥珀酸的检测含量。结果见表1。可见，本检测方法的精密度和回收率都较高。表1回收实验结果(η = 5)
权利要求
1.一种快速检测发酵液琥珀酸含量的方法，包括琥珀酸发酵液的预处理，琥珀酸与硫酸铜的显色反应，薄层扫描法快速分析琥珀酸含量，其特征在于发酵液经预处理后，点样固定于支持物上，使用硫酸铜-甲醇溶液进行特异性的显色反应，薄层扫描分析显色斑的光吸收值，根据外标法计算发酵液中琥珀酸的含量。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于发酵液经调节PH并适当稀释预处理，使发酵液中琥珀酸充分溶解，并使发酵液检样中琥珀酸浓度位于工作曲线线性范围内。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于琥珀酸浓度位于工作曲线线性范围为 l-12g/L。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于使用硅胶板、醋酸纤维薄膜、层析滤纸或其他的固体物作为点样显色的支持物。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于点样于固体支持物后，在40-80°C加热固定 l-5min。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于显色剂硫酸铜_甲醇溶液浓度为5-50g/L。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于使用薄层扫描仪分析显色斑的光吸收值，测定波长为600-750nm，参比波长为450_550nm。
全文摘要
本发明提供了一种快速检测发酵液琥珀酸含量的方法，属于生物化工技术领域。发酵液经预处理后，直接点样子支持物上(可使用硅胶板、醋酸纤维薄膜、或者层析滤纸等)，经过干燥固定后，使用硫酸铜-甲醇溶液中进行显色反应，充分干燥后，利用薄层扫描仪分析显色斑的吸光值，根据琥珀酸含量与吸光值的线性关系计算出发酵液中琥珀酸的含量。本发明方法简单易行，分析速度快、准确性高、重现性好、检测费用低，适合琥珀酸发酵的实验研究及实际生产的分析检测所需，是一种很好的琥珀酸检测分析方法。
文档编号G01N21/78GK102323263SQ201110238698
公开日2012年1月18日 申请日期2011年8月19日 优先权日2011年8月19日
发明者余运玲, 林日辉, 黄文勤 申请人:南宁奕德环境科技有限公司