专利名称：还原态石墨烯与铂纳米粒子复合材料修饰分子印记膜电化学传感器的制备方法
还原态石墨烯与铂纳米粒子复合材料修饰分子印记膜电化学传感器的制备方法技术领域
本发明属于分析检测技术领域，具体涉及一种还原态石墨烯与钼纳米粒子复合材料修饰分子印记膜电化学传感器的制备方法。
背景技术：
近年来，大量研究表明，环境中存在多种能模拟和干扰动物及人类机体功能的物质，例如雌二醇、炔雌醇及双酚A等。这些外源性雌激素进入人体后，与正常分泌的激素竞争，结合细胞中的激素受体，造成人体激素过剩，内分泌系统紊乱，影响人体性激素的正常工作，多种机能出现障碍。这些雌激素的残留已引起国内外高度重视，对于雌二醇等环境雌激素的检测日益成为全球关注的热点。
目前，对于雌二醇的检测方法主要有液相串联质谱法，酶联免疫法等。虽然能获得较高的灵敏度，但这些方法都需要复杂的样品前处理过程，对实验条件的要求也较苛刻。 而且雌二醇本身在自然界中含量较低，较难从复杂的基质中检测出，所以建立一种快速、简单、花费低，具高灵敏度及选择性的方法是当今关注的课题。
电化学传感器在各个领域都有应用，例如DNA及蛋白质电化学传感器，有机分子电化学传感器，无极分子电化学传感器等。因其具有较高的灵敏度、设计简单、价格低廉、具有良好的稳定性及重复利用性、可实现实时监测等特点而为人熟知。但是电化学传感器往往缺乏选择性，这也限制了该技术的发展。
自从瑞典Lund大学的Vlatakis等在《Nature》上报道了有关茶碱的分子印记聚合物的研究成果，分子印记技术便成为了化学与生物学的交叉学科之一，并在近几年获得了蓬勃发展。分子印记技术以其特有的预定性、识别性以及实用性，普遍用于复杂基质中特定物质的分离与富集，以便于快速的检测。将电化学传感器与分子印记技术有机结合，便可实现实时检测，且可以获得较高的灵敏度。
目前，分子印记电化学传感器的制备方法主要为电聚合，但是电聚合形成的分子印记膜普遍为弱导电性膜，影响了电化学传感器的灵敏度。因此，提高分子印记电化学传感器的灵敏度渐成为当今研究的热点问题。发明内容
本发明的目的是针对电化学传感器以及电聚合分子印记膜的上述缺点，将还原态石墨烯与钼纳米材料、分子印记技术与电化学传感器技术有机结合，提供一种还原态石墨烯与钼纳米粒子复合材料修饰分子印记膜电化学传感器的制备方法，得到的分子印记膜电化学传感器可以扬长避短，实现具有高选择性的痕微量物质高灵敏度检测。目前，电聚合方法制备还原态石墨烯与钼纳米粒子复合材料修饰分子印记膜电化学传感器未见报道。
本发明的目的是通过以下方式实现的
一种还原态石墨烯与钼纳米粒子复合材料修饰分子印记膜电化学传感器的制备方法，该方法包括以下步骤
a)电极预处理将玻碳电极经抛光后，放入Piranha溶液中浸泡后洗净；本发明所述的 Piranha 溶液为 30% H2O2 浓 H2SO4 = 3:7，V/V。
b)钼纳米粒子电化学沉积将洗净的玻碳电极置于含硫酸和六氯钼酸的混合溶液中，于-0. 2 0. 6V电位范围内，以30 IOOmV -s—1的扫描速率循环扫描3 25min ;然后依次用无水乙醇和去离子水淋洗，氮气吹干，再置于Piranha溶液中浸泡,去离子水淋洗干净，氮气吹干，即得钼纳米粒子修饰电极；浸泡时间为2 5min ；
c)还原态石墨烯以及钼纳米粒子的组装将还原态石墨烯组装至电极表面，室温下晾干后将钼纳米粒组装至修饰电极，室温下晾干；组装还原态石墨烯时采用浓度为 0. 4 0. 6mg/mL的还原态石墨烯水溶液；
d)分子自组装膜修饰电极与电聚合反应将步骤c)得到的修饰电极浸入到含功能单体、17 P -雌二醇和NaClO4的四氢呋喃溶液中，充氮后密封，室温避光环境中放置15 24h ;于-0. 2 0. 6V电位范围，以50mV s_1的扫描速率循环伏安扫描5 20圈，取出， 去离子水淋洗，氮气吹干；其中，17 0-雌二醇、功能单体，NaClO4物质的量的比为6 6 180 0. 001 0. 03 ;
e)洗脱模板分子将电聚合后电极浸入含H2SO4的丙酮水溶液中处理5 60min。
步骤“b) ”中扫描速率优选70mV s'循环扫描时间优选20 25min。步骤“b) ” 中的混合溶液优选为含0. 5mol L-1硫酸和5mmol L-1六氯钼酸混合水溶液。
步骤“c) ”中还原态石墨烯组装至电极表面使用的是滴涂方法。还原态石墨烯组装至玻碳电极=3mm)表面的量为S 30ii L，优选为10 y L，还原态石墨烯水溶液使用前超声20 40min。步骤“c) ”中钼纳米粒子组装至电极表面使用的是滴涂方法。钼纳米粒子组装至玻碳电极(①=3mm)表面的量为5 30ii L,优选为20 y L,钼纳米粒子使用前超声20 40min。
步骤“d)”中选用的功能单体为含巯基的吡啶类物质，所述的含巯基的吡啶类物质优选为6-巯基烟酸或4-氨基-3-巯基吡啶。步骤“d) ”中17 P -雌二醇、功能单体，NaClO4 物质的量的比为6 6 30 0.001 0.03。
步骤“e)”中使用的是含0. 5mol/L硫酸的丙酮水(丙酮与水体积比为I : I)溶液。
还原态石墨烯的制备方法取3. Og石墨，加入120ml浓硫酸，在冰浴条件下搅拌， 分3次加入总计16. Og高锰酸钾。控制反应温度35-40°C，搅拌20小时。搅拌结束后分批次加水250ml，加热水浴搅拌，控温80°C，反应2小时，反应物逐渐变为亮黄色。待冷却后加 A 40ml过氧化氢搅拌过夜，制得氧化态的石墨烯(GO)。然后依次经酸洗水洗至pH接近6。 超声分散GO 1-2小时。取60mg GO加入600mg聚苯乙烯磺酸钠(PSS)超声30min，在50°C 下搅拌24h。待冷却后加入氨水和水合肼各4ml，保持95-10(TC搅拌24h。经水洗且超声分散得到还原态石墨烯(PSS-RGO)。
钼纳米粒子的制备方法将IOmg NaBH4加入6mL十六烷基三甲基溴化铵水溶液 (0. 08mol L-1)并定义为溶液A。将ImL H2PtCl6水溶液(5mmol L-1)逐滴加入IOmL十六烷基三甲基溴化铵水溶液(0. OSmolL-1)，再加入25mg NH4F, 125mg H3BO3并搅拌混合，定义为溶液B。在超声情况下将A溶液缓慢逐滴加入B溶液中，继续超声lOmin，溶液由淡黄色逐渐4变为黑褐色，即得钼纳米粒子。
2.本发明通过以下方法对本发明电化学传感器进行检测
电化学检测方法和条件
循环伏安法(CV)法检测电位范围为-0. 2 0. 6V，扫描速率为50mV S-1。测试底液为0. Imol L^iKCI和Immol L—1铁氰化钾溶液。
差示脉冲法(DPV)法测试底液为含0. Imol [1KCl的PBS溶液(0. 05mol L-1， pH7. 0)，检测电位范围为0. 2 I. OV,扫描速率为50mV s'电位增量为0. 005V,振幅为0.05V，脉冲宽度为0. 05s，采样宽度为0. 0167s，静止时间为2s。测试前电极在H2SO4溶液中清洗至背景电流恢复。为使吸附完全，实验中可选择17 0-雌二醇(E2)富集时间为5min。
3.采用还原态石墨烯与钼纳米粒子复合材料修饰分子印记膜电化学传感器对已知浓度溶液的静态吸附测试取浓度范围分别为0. 004-50 u mo I L—1的雌二醇溶液进行测试，所测得浓度分别在0. 004-0. 06 u mo I L—1，0. 06-50 u mo I L—1范围内线性良好，检测限达到 0. 52ng/mL。
与现有技术比较本发明的有益效果
I.将分子印记与电化学传感器结合，提高了电化学传感器的专属性，可实现复杂样品中痕微量17-0雌二醇的选择性检测。
2.将还原态石墨烯与钼纳米粒子的复合材料修饰于电极表面，利用了石墨烯与钼纳米粒具有的优良导电、催化和高比表面积等特性，从而极大的增加了电极的灵敏度。
3.钼纳米粒与功能单体通过Pt-S键自组装后再电聚合，形成致密与结合牢固的包含模板分子特异性孔穴的膜层。可通过控制电聚合条件、模板分子与功能单体、交联剂间组成比来调控印记纳米结构。
4.选用的功能单体为含巯基的吡啶类物质，即是功能单体又是传统分子印记中的交联剂，电聚合条件下形成具有导电性的聚吡啶膜。
图I为不同修饰电极的循环伏安图。
(A)a裸电极，b电沉积钼粒子的电极，c还原态石墨烯修饰电极，d按照实施例方法依次修饰还原态石墨烯与钼粒子的电极。说明与裸电极相比，电沉积钼粒子的电极电流响应明显增大，而依次修饰还原态石墨烯与钼粒子之后，电极电流的响应进一步增大，说明修饰后电极灵敏度大大提高。
(B) e分子印记传感器(洗脱模板分子17 0 -雌二醇前)，f分子印记传感器(洗脱模板分子17 0-雌二醇后)，g非印记传感器。洗脱模板分子以后相比于洗脱前电流响应增大，说明形成的分子印记空穴使得铁氰化钾探针得以进入，进而增大了电流响应。而非印记传感器并不具备分子印记空穴，形成的致密弱导电性聚合物膜阻碍了铁氰化钾的响应， 以致响应较弱。
图2为电子显微镜扫描图放大10000倍进行扫描。
图中，⑷电沉积制得钼纳米粒子⑶修饰在石墨烯表面的钼纳米粒子(C)分子印记膜的扫描电镜图。
图3为实施例I方法制备的电化学传感器在不同浓度的17 0 -雌二醇溶液中的静态吸附过程。
内插图为所加入17 @ -雌二醇浓度分别为0. 004，0. 006,0. 008,0. 02，0.04,0. 06 u mo I L—1差示脉冲伏安法测试结果。如图所示，在173-雌二醇浓度为0.004-0. 06 u mo I L-1与0. 06-50 u mo I L4范围内，电流响应与170-雌二醇浓度存在线性关系。回归方程分别为Ip(uA) = 57. 872C(iiM)+1.6678，R = 0.9977 与 Ip(IiA)=0.7915C(uM) +6. 6906，R = 0. 9957。检测限为 0. 52ng/mL，最大吸附浓度为 150 u mo I .L'具体实施方式
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明
药品和试剂A1203(0. 05 u m,上海辰华仪器有限公司)，17 P -雌二醇(浙江仙琚制药股份有限公司)，氯化钾(KC1)、铁氰化钾(K3Fe(CN)6)(分析纯，上海新宝精细化工厂)， 无水乙醇、乙腈(分析纯，国家集团化学试剂有限公司)，六氯钼酸(H2PtCl6，国药集团化学试剂有限公司)，四氢呋喃(分析纯，上海试四赫维化工有限公司)，苯酚(phenol)、磷酸二氢钾(KH2PO4)、磷酸氢二钾(K2HPO4)(分析纯，上海凌峰化学有限公司)，6_巯基烟酸 (Sigma-Aldrich公司)，四氢呋喃(上海试四赫维化工有限公司)，硫酸(H2SO4,上海化学试剂有限公司)，实验用水为二次蒸馏水。0. 05mol L-1KH2PO4和0. 05mol L^iK2HPO4水溶液配制 pH 7. 0 的憐酸盐缓冲溶液(phosphate buffered solution, PBS)。
还原态石墨烯的制备方法取3. Og石墨，加入120ml浓硫酸，在冰浴条件下搅拌， 分3次加入总计16. Og高锰酸钾。控制反应温度35-40°C，搅拌20小时。搅拌结束后分批次加水250ml，加热水浴搅拌，控温80°C，反应2小时，反应物逐渐变为亮黄色。待冷却后加 A 40ml过氧化氢搅拌过夜，制得氧化态的石墨烯(GO)。然后依次经酸洗水洗至pH接近6。 超声分散GO 1-2小时。取60mg GO加入600mg聚苯乙烯磺酸钠(PSS)超声30min，在50°C 下搅拌24h。待冷却后加入氨水和水合肼各4ml，保持95-10(TC搅拌24h。经水洗且超声分散得到还原态石墨烯(PSS-RGO)。
钼纳米粒子的制备方法将IOmg NaBH4加入6mL十六烷基三甲基溴化铵水溶液 (0. 08mol L-1)并定义为溶液A。将ImL H2PtCl6水溶液(5mmol L-1)逐滴加入IOmL十六烷基三甲基溴化铵水溶液(0. OSmolL—1)，再加入25mg NH4F, 125mg H3BO3并搅拌混合，定义为溶液B。在超声情况下将A溶液缓慢逐滴加入B溶液中，继续超声lOmin，溶液由淡黄色逐渐变为黑褐色，即得钼纳米粒子。
实施例I
a)电极预处理玻碳电极(①=3mm)经0. 05 ii m的Al2O3悬池液抛光后，放入 Piranha溶液(30% H2O2 :浓H2SO4 = 3 7，V/V)中浸泡2min，然后分别用无水乙醇、去离子水超声清洗2min ；
b)钼纳米粒子电化学沉积将洗净的玻碳电极置于含0.5mol L—1硫酸和 5mmol L—1六氯钼酸的混合水溶液中，于-0. 2 0. 6V电位范围内，以30mV s—1的扫描速率循环扫描3min ;然后依次用无水乙醇和去离子水淋洗，氮气吹干，再置于Piranha溶液中浸泡2min后，去离子水淋洗干净，氮气吹干，即得钼纳米粒子修饰电极；
c)还原态石墨烯以及钼纳米粒子的组装将5 ii L 0. 5mg/mL还原态石墨烯水溶液超声30min，滴涂至钼纳米粒子修饰电极表面，室温下晾干，将5 ii L的钼纳米粒子超声30min,滴涂至晾干的电极表面,室温下晾干；
d)分子自组装膜修饰电极与电聚合反应将步骤c)得到的修饰电极浸入到含 6mmolL-16-巯基烟酸、6mmol 1^17 3 -雌二醇及0. Olmmol L^1NaClO4的四氢呋喃溶液中，充氮后密封，室温避光环境中放置15h ;于-0. 2 0. 6V电位范围，以50mV s 1的扫描速率循环伏安扫描5圈，取出，去离子水淋洗，氮气吹干；其中，17 0 -雌二醇、功能单体和NaClO4物质的量的比为6 6 0. 01 ；
e)洗脱模板分子将电聚合后电极浸入含0. 5mol L4H2SO4的丙酮水溶液中(其中丙酮与水的体积比为I : I) 5min，取出，去离子水淋洗干净，氮气吹干。
实施例2
a)电极预处理玻碳电极(①=3mm)经0. 05 ii m的Al2O3悬池液抛光后，放入 Piranha溶液(30% H2O2 :浓H2SO4 = 3 7，V/V)中浸泡2min，然后分别用无水乙醇、去离子水超声清洗2min ；
b)钼纳米粒子电化学沉积将洗净的玻碳电极置于含0.5mol L—1硫酸和 5mmol L—1六氯钼酸混合水溶液中，于-0. 2 0. 6V电位范围内，以50mV s—1的扫描速率循环扫描IOmin ;然后依次用无水乙醇和去离子水淋洗，氮气吹干，再置于Piranha溶液中浸泡2min后，去离子水淋洗干净，氮气吹干，即得钼纳米粒子修饰电极；
c)还原态石墨烯以及钼纳米粒子的组装将IOii L的0. 5mg/mL还原态石墨烯水溶液超声30min,滴涂至电极表面,室温下晾干；将10 y L的钼纳米粒子超声30min,滴涂至晾干的修饰电极，室温下晾干；
d)分子自组装膜修饰电极与电聚合反应将步骤c)得到的修饰电极浸入到含 Bmmol L 1功能单体6_疏基烟酸、6mmol L 47 P -雌二醇及含0. OOlmmol L 1NaClO4的四氧呋喃溶液中，充氮后密封，室温避光环境中放置15h ;于-0. 2 0. 6V电位范围，以50mV .s—1 的扫描速率循环伏安扫描10圈，取出，去离子水淋洗，氮气吹干；其中，170-雌二醇、功能单体和NaClO4物质的量的比为6 : 6 : 0.001;
e)洗脱模板分子将电聚合后电极浸入含0. 5mol L4H2SO4的丙酮水溶液中(其中丙酮与水的体积比为I : I) lOmin，取出，去离子水淋洗干净，氮气吹干。
实施例3
a)电极预处理玻碳电极(①=3mm)经0. 05 ii m的Al2O3悬池液抛光后，放入 Piranha溶液(30% H2O2 :浓H2SO4 = 3 7，V/V)中浸泡2min，然后分别用无水乙醇、去离子水超声清洗2min ；
b)钼纳米粒子电化学沉积将洗净的玻碳电极置于含0.5mol L—1硫酸和 5mmol L—1六氯钼酸的混合溶液中，于-0. 2 0. 6V电位范围内，以70mV s—1的扫描速率循环扫描15min ;然后依次用无水乙醇和去离子水淋洗，氮气吹干，再置于Piranha溶液中浸泡2min后，去离子水淋洗干净，氮气吹干，即得钼纳米粒子修饰电极；
c)还原态石墨烯以及钼纳米粒子的组装将15 ii L的0. 5mg/mL还原态石墨烯水溶液超声30min，滴涂至电极表面，室温下晾干；将15 ii L的钼纳米粒子超声30min，滴涂至晾干的修饰电极，室温下晾干；
d)分子自组装膜修饰电极与电聚合反应将骤c)得到的修饰电极浸入到含6mmol r1功能单体4-氨基-3-巯基吡啶、IOOmmol L-1 17 3 -雌二醇及含0. Olmmol L1NaClO4的四氢呋喃溶液中，充氮后密封，室温避光环境中放置15h ;于-0. 2 0. 6V电位范围，以 50mV -s^1的扫描速率循环伏安扫描15圈，取出，去离子水淋洗，氮气吹干；其中，17 P -雌二醇、功能单体和NaClO4物质的量的比为6 100 0.01 ；
e)洗脱模板分子将电聚合后电极浸入含0. 5mol L4H2SO4的丙酮水溶液中(其中丙酮与水的体积比为I : I) 30min，取出，去离子水淋洗干净，氮气吹干。
实施例4
a)电极预处理玻碳电极(①=3mm)经0. 05 ii m的Al2O3悬池液抛光后，放入 Piranha溶液(30% H2O2 :浓H2SO4 = 3 7，V/V)中浸泡2min，然后分别用无水乙醇、去离子水超声清洗2min ；
b)钼纳米粒子电化学沉积将洗净的玻碳电极置于含0.5mol L—1硫酸和 5mmol L—1六氯钼酸的混合溶液中，于_0. 2 0. 6V电位范围内，以IOOmV s—1的扫描速率循环扫描25min ;然后依次用无水乙醇和去离子水淋洗，氮气吹干，再置于Piranha溶液中浸泡2min后，去离子水淋洗干净，氮气吹干，即得钼纳米粒子修饰电极；
c)还原态石墨烯以及钼纳米粒子的组装将30 ii L的0. 5mg/mL还原态石墨烯水溶液超声30min，滴涂至电极表面，室温下晾干；将30 ii L的钼纳米粒子超声30min，滴涂至晾干的修饰电极，室温下晾干；
d)分子自组装膜修饰电极与电聚合反应将骤c)得到的修饰电极浸入到含6mmol L—1功能单体巯基烟酸、6mmol L—1 17 P -雌二醇及含0. OOlmmol L^NaClO4的四氢呋喃溶液中，充氮后密封，室温避光环境中放置15h ;于-0. 2 0. 6V电位范围，以50mV s 1的扫描速率循环伏安扫描20圈，取出，去离子水淋洗，氮气吹干；其中，170-雌二醇、功能单体和 NaClO4物质的量的比为6 : 6 : 0.001;
e)洗脱模板分子将电聚合后电极浸入含0. 5mol L4H2SO4的丙酮水溶液中(其中丙酮与水的体积比为I : I)60min，取出，去离子水淋洗干净，氮气吹干。
权利要求
1.一种还原态石墨烯与钼纳米粒子复合材料修饰分子印记膜电化学传感器的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤a)电极预处理将玻碳电极抛光后，放入Piranha溶液中浸泡后洗净；b)钼纳米粒子电化学沉积将洗净的玻碳电极置于含硫酸和六氯钼酸的混合溶液中， 于-0. 2 0. 6V电位范围内，以30 IOOmV s—1的扫描速率循环扫描3 25min ;然后依次用无水乙醇和去离子水淋洗，氮气吹干，再置于Piranha溶液中浸泡后，去离子水淋洗干净，氮气吹干，即得钼纳米粒子修饰电极；c)还原态石墨烯以及钼纳米粒子的组装将还原态石墨烯组装至电极表面，室温下晾干后将钼纳米粒组装至修饰电极，室温下晾干；组装还原态石墨烯时采用浓度为0. 4 0. 6mg/mL的还原态石墨烯溶液；d)分子自组装膜修饰电极与电聚合反应将步骤c)得到的修饰电极浸入到含功能单体、17 P -雌二醇和NaClO4的四氢呋喃溶液中，充氮后密封，室温避光环境中放置15 24h ;于-0. 2 0. 6V电位范围，以50mV s_1的扫描速率循环伏安扫描5 20圈，取出， 去离子水淋洗，氮气吹干；其中，17 0-雌二醇、功能单体，NaClO4物质的量的比为6 6 180 0. 001 0. 03 ;e)洗脱模板分子将电聚合后电极浸入含H2SO4的丙酮水溶液中处理5 60min。
2.根据权利要求I所述的分子印记膜电化学传感器的制备方法，其特征在于步骤“b)” 中以70mV s—1的扫描速率循环扫描。
3.根据权利要求I所述的分子印记膜电化学传感器的制备方法，其特征在于步骤“b)” 中循环扫描的时间为20 25min。
4.根据权利要求I所述的分子印记膜电化学传感器的制备方法，其特征在于步骤“c)” 中还原态石墨烯组装至电极表面使用的是滴涂方法，还原态石墨烯溶液组装至电极表面的量为5 30 ii L，使用前超声20 40min。
5.根据权利要求I所述的分子印记膜电化学传感器的制备方法，其特征在于步骤“c)” 中钼纳米粒子组装至电极表面使用的是滴涂方法，钼纳米粒子组装至电极表面的量为5 30 u L,使用前超声20 40min。
6.根据权利要求I所述的分子印记膜电化学传感器的制备方法，其特征在于步骤“d)” 中选用的功能单体为含巯基的吡啶类物质。
7.根据权利要求6所述的分子印记膜电化学传感器的制备方法，其特征在于所述的含巯基的吡啶类物质为6-巯基烟酸，4-氨基-3-巯基吡啶。
8.根据权利要求I所述的分子印记膜电化学传感器的制备方法，其特征在于步骤“d)” 中17 3-雌二醇、功能单体和NaClO4物质的量的比为6 6 30 0. 001 0. 03。
9.根据权利要求I所述的分子印记膜电化学传感器的制备方法，其特征在于步骤“e)” 中使用的是含0. 5mol/L硫酸的体积比为I : I的丙酮水溶液。
全文摘要
本发明公开了一种还原态石墨烯与铂纳米粒子复合材料修饰分子印记膜电化学传感器的制备方法。该方法依次包含电极预处理过程、铂纳米粒子电化学沉积至电极表面、聚电解质修饰还原态石墨烯以及铂纳米粒子的组装、分子印记层自组装、电聚合反应以及模板分子洗脱步骤。本发明制备的分子印记电化学传感器具有良好选择性，高灵敏度，较强的抗干扰能力，能够进行复杂基质中痕量环境雌激素的快速检测。
文档编号G01N27/26GK102539493SQ201110446939
公开日2012年7月4日 申请日期2011年12月27日 优先权日2011年12月27日
发明者刘莳, 周学敏, 姜慧君, 文婷婷, 李芸, 王若禹, 薛诚 申请人:南京医科大学