专利名称：测定凝固抑制剂的方法
技术领域：
本发明属于凝固诊断学领域，并涉及在样品中测定蛋白水解活性凝固因子的抑制剂(抗凝剂，anticoagulant)，特别是直接的凝血酶和因子叙抑制剂的均相法，还涉及在这样的方法中使用的检测试剂盒。
背景技术：
一般的抗凝剂治疗主要目的是抑制前凝固因子凝血酶(因子IIa、FIIa)和因子fe (F Xa)。例如使用维生素K拮抗剂(例如香豆素)作用于抑制凝固因子合成的口服抗凝和由于在血流中抑制活性凝固因子而引起的抗凝之间存在区别。在抑制或失活血流中的活性凝固因子的抗凝剂中，分为直接作用的抗凝剂和间接作用的抗凝剂。直接作用的抗凝剂例如利伐沙班、达比加群或美拉加群结合凝血酶或因子fe，并因此是高度特异的。间接作用的抗凝剂例如肝素结合内源凝固因子抑制剂例如抗凝血酶，并多次放大其抗凝作用。通过特定的失活模式区分所有抑制血流中的活性凝固因子的抗凝剂。某些类型的物质，例如未分离的高分子量肝素，抑制凝血酶和因子)(a 二者。其他物质高度特异地发挥作用，因此抑制凝血酶(例如水蛭素、达比加群、美拉加群)或抑制因子fe (例如五糖，如磺达肝癸钠、利伐沙班)。血液凝固系统的主要前凝固因子(因子和凝血酶)的直接或间接抑制剂在治疗和预防心血管和血栓栓塞疾病中发挥了日益重要的作用。通过目前建立的测定仅可以非常复杂的方式检测这些抑制剂。用于所述物质的简单和灵敏的测定对治疗监控和在未知患者样品中检测所述物质的存在是很重要的。这些测定应当能够以高度灵敏的方式检测相对大量的结构上不相关的凝血酶或F叙抑制剂。目前用于测定抗凝剂的显色测定包括将通常由血浆组成的待分析的患者样品与凝固因子的底物混合。由于大多数血液凝固因子是丝氨酸肽链内切酶，即可切割肽键的水解酶，主要利用被待测的血液凝固因子尽可能地特异性切割的肽底物，且其具有可检测的信号基团。已建立的且也可商业获得的显色测定特别利用发色团对硝基苯胺(PNA)和5-氨基-2-硝基苯甲酸(ANBA)，其具有在405 nm处的吸收峰。通常通过光度测定仪来测定生成的黄色。在抗凝剂的测定中，测定混合物中的颜色浓度与样品中的抗凝剂浓度成反比。在第一类目前应用的用于测定抑制血液凝固因子活性的抗凝剂的显色测定中，待测患者样品通常与确定量的活化凝固因子混合以及与此凝固因子的底物混合。在样品中存在的抗凝剂越多，发生的对活化的凝固因子的抑制作用越强，和被切割的底物越少。基于此测定原理的可商业获得的测定的实例是Siemens Healthcare Diagnostics的Berichrom 肝素测定，其基于对添加的因子)(a的抑制作用而用于测定肝素；或Siemens Healthcare Diagnostics的水蛭素活性测定，其基于对添加的凝血酶的抑制作用而用于测定水蛭素 (hirudin)o在第二类目前应用的用于测定抗凝剂的显色测定中，待测患者样品与失活的凝固因子、凝固活化剂混合以及与凝固因子的显色底物混合。凝固活化剂的加入在一开始活化
5加入的失活的凝固因子。在样品中存在的抗凝剂越多，发生的对活化的凝固因子的抑制作用越强，和被切割的底物越少。基于此测定原理的可商业获得的测定的实例是用于测定合成的直接的凝血酶抑制剂的来自JenAffin的Haemosyf-ECA T测定，或用于测定水蛭素的来自JenAffin的Haemosys^ECA H，后者是基于由于加入凝血酶原和作为凝固活化剂的蛇静脉酶(ecarin)而在样品中形成的对凝血酶/meizothrombin的抑制作用。EP-A1-2 177 625描述了另一种测定抗凝剂的测定原理。此测定原理类似地包含测定凝固因子特异性底物的切割，但借助于不同类型的信号产生系统，而不是借助于显色底物。所述系统包含2种成分，当与完整的底物同时结合时，2种成分由于在空间上极为接近而相互作用并产生可检测的信号，例如荧光或化学发光。作为底物肽键切割的结果，2种成分彼此分离，并因此不产生信号。在样品中存在的抗凝剂越多，发生对活化的凝固因子的抑制作用越强，被切割的底物越少和产生的信号越多。基于荧光或化学发光的测定相比显色测定的优势基本上在于，它们更灵敏和还允许在全血中测量。在上述方法中可切割的底物在一定程度上“安装”在信号系统的2种成分之间，此方法的缺点在于在切割位点两侧的底物配体必须具有与信号成分结合的区域。底物配体通常是合成的低分子量肽底物，其具有2个与信号成分结合的人工残基，例如氨基端的Flag 标签和羧基端的生物素残基。然而，这些残基与低分子量肽底物的结合始终具有这样的风险，即以使其不再结合或不再被待检测的酶切割的方式改变肽的结构，因此提供合适的底物配体在技术上是复杂的。因此，希望以这样的方式修改已知的测定抗凝剂的方法(所述方法使用由于在空间上极为接近而相互作用并产生可检测的信号的2种成分)，即可使用下述低分子量配体， 其需要具有不超过1个用于结合任何信号成分的人工残基。通过下述方法实现了此目的将等分试样的疑为包含抗凝剂的样品与确定量的蛋白水解活性凝固因子混合以及与配体混合，所述配体与蛋白水解活性凝固因子的活性位点结合但不因此在肽键处被切割，并测量由配体与活化的凝固因子结合引起的信号产生系统产生的信号。在样品中存在的活化的凝固因子的抑制剂，即抗凝剂以浓度依赖的方式与配体竞争结合蛋白水解活性凝固因子的活性位点并因此抑制信号产生。在样品中存在的抗凝剂越多，产生的信号越少。
发明内容
本发明因此涉及在样品中测定蛋白水解活性凝固因子的抑制剂，即抗凝剂的方法，其包括以下步骤
a)提供和孵育反应混合物，所述反应混合物包含
i.等分试样的样品，
.确定量的蛋白水解活性凝固因子，
iii.至少一种配体，所述配体与蛋白水解活性凝固因子的活性位点结合但不被后者在肽键处切割，
iv.信号产生系统的第一和第二成分，二者以这样的方式共同作用，即当所述信号产生系统的所述第一和第二成分变得彼此极为接近时产生可检测的信号，且其中蛋白水解活性凝固因子与信号产生系统的第一成分结合，或在孵育期间与其结合，且其中配体与信号产生系统的第二成分结合，或在孵育期间与其结合；
b)测量信号产生系统的信号，其中所述信号幅度(amplitude)与样品中的抗凝剂浓度成反比。在本发明上下文中使用的术语“抗凝剂”指蛋白水解活性凝固因子的抑制剂，其为天然或合成来源的，且其预期用途是在人或动物中抑制体内的凝血系统。其也包括在多个结合位点上结合酶的高分子量物质例如水蛭素或肝素，以及仅结合酶的活性位点就足以抑制反应性的低分子量化合物例如利伐沙班、达比加群或美拉加群。用于本发明的目的，术语 “抗凝剂”和“蛋白水解活性凝固因子的抑制剂”是同义地使用的。在本发明上下文中术语“配体”指这样的物质，其与蛋白水解活性凝固因子的活性位点结合并因此与抑制剂竞争结合位点。然而，合适的配体不被蛋白水解活性凝固因子在肽键处切割，因为它们缺乏可被所述蛋白水解活性凝固因子切割的肽键，即它们不含有任意可被蛋白水解活性凝固因子水解的肽键(R-CONH-R，R =氨基酸残基)。可逆和不可逆结合的配体都是合适的。配体可为合成、重组或通过生物技术产生的分子或天然存在的分子。配体可为肽衍生物，其序列来源于酶的天然底物的序列。用于本发明的目的的肽衍生配体与肽底物的区别在于，肽衍生配体不被蛋白水解活性凝固因子水解切割，而肽底物的切割产生从酶的活性位点释放的片段，且从反应中再次出现的酶没有变化。合适的肽衍生物优选地包含从3至约150个氨基酸残基。为了能够避免蛋白水解活性凝固因子在肽键处切割本发明的肽衍生物，后者的羧基端羧基优选地被置换为来自醛(-CH0)，酮(-C0R; R =烷基或芳基)，三氟甲基酮(-COCF3), α -酮羧酸(-C0C00H)， α-酮酰胺(-C0C0NHR; R =烷基或芳基)，和α-酮酯(-C0C00R; R =烷基或芳基)，酯 (-C00R; R =烷基或芳基)，硼酸(-B(OR)2),氯甲基酮(-COCH2Cl)和磺酰氟(-SO2F)的官能团。肽衍生物可还具有结构修饰，例如部分使用D-氨基酸代替天然存在的L-氨基酸。表1包含了用于可逆和不可逆结合的肽衍生配体的一般官能团的实例。表 权利要求
1.一种在样品中测定蛋白水解活性凝固因子的抑制剂的方法，所述方法包括以下步骤a)提供和孵育反应混合物，所述反应混合物包含1.等分试样的样品， .确定量的蛋白水解活性凝固因子，iii.至少一种配体，所述配体与蛋白水解活性凝固因子的活性位点结合但不被后者在肽键处切割，iv.信号产生系统的第一和第二成分，二者以这样的方式共同作用，即当所述信号产生系统的所述第一和第二成分变得彼此极为接近时产生可检测的信号，且其中蛋白水解活性凝固因子与信号产生系统的第一成分结合，或在孵育期间与其结合，且其中配体与信号产生系统的第二成分结合，或在孵育期间与其结合；b)测量信号产生系统的信号，其中所述信号幅度与样品中的抑制剂浓度成反比。
2.根据权利要求1的方法，其中与蛋白水解活性凝固因子的活性位点结合的所述配体具有Ki=10_13- 10_4 M的与蛋白水解活性凝固因子的结合亲和力。
3.根据权利要求1和2中任一项的方法，其中所述信号产生系统的第一和第二成分各个包含微粒状固相，且其中测量在所述反应混合物中的所述微粒状固相的聚集。
4.根据权利要求1和2中任一项的方法，其中所述信号产生系统的第一成分是化学发光剂，且所述信号产生系统的第二成分是光敏剂，反之亦然，且其中测量在所述反应混合物中的化学发光。
5.根据权利要求4的方法，其中所述化学发光剂与第一微粒状固相结合和/或所述光敏剂与第二微粒状固相结合。
6.根据权利要求1至5中任一项的方法，其中所述配体具有第一结合对A/B的第一结合配偶体A，且其中所述信号产生系统的所述第二成分具有所述第一结合对A/B的第二结合配偶体B，且其中所述配体由于所述结合配偶体A和B的结合与所述信号产生系统的所述第二成分结合，或在孵育期间与其结合。
7.根据权利要求1至6中任一项的方法，其中所述配体是肽衍生物。
8.根据权利要求1至7中任一项的方法，其中所述配体是肽衍生物，所述肽衍生物具有选自醛、酮、三氟甲基酮、α-酮羧酸、α-酮酰胺、α-酮酯、酯、硼酸、氯甲基酮和磺酰氟的羧基端基团。
9.根据权利要求6的方法，其中选择所述结合配偶体A和B使其形成选自FLAG标签/ 抗FLAG标签抗体，HIS标签/抗HIS标签抗体，荧光素/抗荧光素抗体，生物素/抗生物素和生物素/链霉抗生物素的结合对A/B。
10.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述蛋白水解活性凝固因子具有第二结合对χ/γ的第一结合配偶体X，且其中所述第二结合对χ/γ的第二结合配偶体Y与所述信号产生系统的所述第一成分结合，且其中所述蛋白水解活性凝固因子由于所述结合配偶体 X和Y的结合与所述信号产生系统的所述第一成分结合，或在孵育期间与其结合。
11.根据前述权利要求中任一项的用于测定凝血酶抑制剂的方法，其中提供和孵育反应混合物，所述反应混合物包含确定量的蛋白水解活性凝固因子凝血酶。
12.根据权利要求11的方法，其中提供和孵育反应混合物，所述反应混合物包含与凝血酶的活性位点可逆结合但不因此被切割的肽生物素基-Ttds-D-Phe-Pro-Arg-H。
13.根据权利要求11和12中任一项的用于测量凝血酶抑制剂的方法，所述凝血酶抑制剂选自肝素、肝素衍生物、比伐卢定、水蛭素、达比加群、阿加曲班、美拉加群、希美加群、来匹卢定、MCC-977、SSR-182289、TGN-255、TGN-167、ARC-183 和 odiparcil。
14.根据权利要求1至10中任一项的用于测定因子叙抑制剂的方法，其中提供和孵育反应混合物，所述反应混合物包含确定量的蛋白水解活性凝固因子因子似。
15.根据权利要求14的用于测定因子叙抑制剂的方法，所述因子叙抑制剂来自肝素、 肝素衍生物例如磺达肝癸钠、利伐沙班、阿哌沙班、奥米沙班、LY 517717,YM 153、DU-176b、 DX-9065a和 KFA-1982。
16.根据权利要求14和15中任一项的方法，其中提供和孵育反应混合物，所述反应混合物包含与因子fe的活性位点可逆结合但不因此被切割的肽生物素基-Ttds-D-Arg-Gly-Arg-H0
17.—种实施根据权利要求1至16中任一项的方法的检测试剂盒，所述检测试剂盒包含以下单独的成分i.第一试剂，其包含确定量的蛋白水解活性凝固因子， .第二试剂，其包含至少一种与所述蛋白水解活性凝固因子的活性位点结合但不被后者在肽键处切割的配体；iii.第三试剂，其包含信号产生系统的第一成分，所述成分可与第一试剂中的蛋白水解活性凝固因子结合；和iv.第四试剂，其包含信号产生系统的第二成分，所述成分可与第二试剂中的配体结合；其中所述信号产生系统的所述第一和第二成分以这样的方式共同作用，即当所述信号产生系统的所述第一和第二成分变得彼此极为接近时产生可检测的信号。
18.—种实施根据权利要求1至16中任一项的方法的检测试剂盒，所述检测试剂盒包含以下单独的成分i.第一试剂，其包含确定量的蛋白水解活性凝固因子，其中所述蛋白水解活性凝固因子与信号产生系统的第一成分结合； .第二试剂，其包含至少一种与所述蛋白水解活性凝固因子的活性位点结合但不被后者在肽键处切割的配体；和iii.第三试剂，其包含所述信号产生系统的第二成分，所述第二成分可与所述第二试剂中的所述配体结合；其中所述信号产生系统的所述第一和第二成分以这样的方式共同作用，即当所述信号产生系统的所述第一和第二成分变得彼此极为接近时产生可检测的信号。
19.一种实施根据权利要求1至16中任一项的方法的检测试剂盒，所述检测试剂盒包含以下单独的成分i.第一试剂，其包含确定量的蛋白水解活性凝固因子， .第二试剂，其包含信号产生系统的第一成分，所述第一成分可与所述第一试剂中的所述蛋白水解活性凝固因子结合；和iii.第三试剂，其包含至少一种与所述蛋白水解活性凝固因子的活性位点结合但不被后者在肽键处切割的配体，且其中所述配体与所述信号产生系统的第二成分结合；其中所述信号产生系统的所述第一和第二成分以这样的方式共同作用，即当所述信号产生系统的所述第一和第二成分变得彼此极为接近时产生可检测的信号。
20. 一种实施根据权利要求1至16中任一项的方法的检测试剂盒，所述检测试剂盒包含以下单独的成分i.第一试剂，其包含确定量的蛋白水解活性凝固因子，其中所述蛋白水解活性凝固因子与信号产生系统的第一成分结合； .第二试剂，其包含至少一种与所述蛋白水解活性凝固因子的活性位点结合但不被后者在肽键处切割的配体，且其中所述配体与所述信号产生系统的第二成分结合；其中所述信号产生系统的所述第一和第二成分以这样的方式共同作用，即当所述信号产生系统的所述第一和第二成分变得彼此极为接近时产生可检测的信号。
全文摘要
本发明属于凝固诊断学领域，并涉及在样品中测定蛋白水解活性凝固因子的抑制剂(抗凝剂)，特别是直接的凝血酶和因子Xa抑制剂的均相法，并也涉及在这样的方法中使用的检测试剂盒。使用与蛋白水解活性凝固因子结合但不被后者切割且与待测抗凝剂竞争的配体。
文档编号G01N33/50GK102590490SQ20111045428
公开日2012年7月18日 申请日期2011年12月30日 优先权日2010年12月30日
发明者A.卡佩尔, A.雷希纳, S.斯蒂芬, T.维塞尔 申请人:西门子医疗诊断产品有限责任公司