专利名称：适于转化细胞的载体、重组细胞及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及适于转化细胞的载体、重组细胞及其用途。更具体地，本发明提供了一组适于转化细胞的载体、两种适于转化细胞的载体、一种重组细胞及其制备方法、一种检测样本中二恶英的方法、一种用于检测样本中二恶英化合物的试剂盒、一种用于检测样本中二恶英化合物的系统以及一种筛选具有降解二恶英化合物活性的制剂的方法。
背景技术：
二恶英类物质，是包括多氯代二苯并二恶英(polychlorinateddibenzo-dioxins, PCDDs)、多氯代二苯并呋喃(polychlorinated dibenzo-furans, PCDFs)和共平面多氯联苯(co-planar polychlorinated biphenyls, Co-PCBs)等一大类化合物的总称(Larsen et al，2000)，且这三类化合物分别有75种、135种、209种异构体。二恶英类 污染物主要来源于有机物焚烧过程和农药、化工生产过程的副产物。因其毒性极强，自然条件下极难降解，生物蓄积性高，并对人体内分泌、生殖和发育、神经和免疫系统等都有重要影响，因此1997年被世界卫生组织国际癌症研究机构认定为人类一级致癌物。二恶英类物质是一类全球性持久性有机污染物，普遍存在于大气、水体、沉积物和土壤等环境介质中。环境介质中二恶英类物质的含量极低，其分析属于超痕量、多组分分析，一直被视为现代有机分析的难点。目前，对二恶英化合物进行检测的方法主要有化学检测方法和生物检测法。其中化学检测法HRGC/HRMS，虽然能够精确地将二恶英的所有成分浓度分析出来，但是整个分析测试过程费用高耗时长(检测周期>7天/样，检测成本/I. 5万元)，不利于日常检测和毒性急性的快速筛查。生物检测法，包括酶联免疫法((enzyme immunoassay, EIA)、突光免疫分析法(dissociation-enhancement lanthanide fluoro immunoassay, DELFIA)、酶活力诱导法(EROD)和突光素酶报告基因法(chemical-activated luciferase geneexpression, CALUX)等。前三者由于实验操作复杂、技术成熟度不高而难以推广应用。而CALUX法由于其准确度好、精密度高、操作简便易行而被用于欧盟、美国和日本等29个国家的水环境、土壤、食品、饲料中二恶英的检测分析和筛查。但是该法仍然有较高的假阳性，且对低浓度二恶英物质感应不灵敏，检测成本高，耗时长。因此，目前对二恶英类化合物进行检测的方法仍有待改进。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，基于二恶英类化合物的毒性机制，本发明提供了适于转化细胞的载体、重组细胞及其用途，以便改进现有的CALUX 法。根据本发明的一个方面，本发明提供了一组适于转化细胞的载体。根据本发明的实施例，该组载体包括第一载体和第二载体。其中，第一载体包含第一核酸序列，该第一核酸序列包括编码报告蛋白的序列，该报告蛋白具有可检测的活性；以及二恶英响应区域，该二恶英响应区域包含二恶英应答元件，并且二恶英响应区域与第一核酸序列可操作地连接。第二载体包含第二核酸序列，该第二核酸序列包含编码芳香烃受体的序列。利用本发明的一组适于转化细胞的载体，能够有效地将编码报告蛋白的序列、二恶英应答元件以及编码芳香烃受体的序列引入宿主细胞中，从而能够有效地构建重组细胞，进而，在二恶英的诱导下，重组细胞能够启动报告基因的转录和表达，由此，利用该重组细胞能够通过所表达报告蛋白的活性的检测，有效地实现对二恶英类化合物的检测。根据本发明的另一方面，本发明提供了一种适于转化细胞的载体。根据本发明的实施例，该载体包括第一核酸序列，该第一核酸序列包括编码报告蛋白的序列，该报告蛋白具有可检测的活性；以及二恶英响应区域，该二恶英响应区域包含二恶英应答元件，并且二恶英响应区域与第一核酸序列可操作地连接。利用该载体，能够有效地将编码报告蛋白的序列和二恶英应答元件引入宿主细胞中，其中报告基因的转录和表达以及表达量是检测 二恶英类化合物的指示，而二恶英应答元件是诱导报告基因表达的必要条件，因此，该载体适于转化细胞，能够用于构建检测二恶英类化合物的重组细胞。根据本发明的又一方面，本发明提供了另一种适于转化细胞的载体。根据本发明的实施例，该载体包含第二核酸序列，该第二核酸序列包含编码芳香烃受体的序列。利用该载体，能够有效地将编码芳香烃受体的序列引入宿主细胞中，其中编码芳香烃受体的序列所表达的芳香烃受体能够有效地结合二恶英类化合物，并能够诱导其下游基因的转录和表达，因此，该载体适于转化细胞，能够用于构建检测二恶英类化合物的重组细胞。根据本发明的再一方面，本发明提供了一种重组细胞。根据本发明的实施例，该重组细胞的基因组中包含第一核酸序列，该第一核酸序列包括编码报告蛋白的序列，该报告蛋白具有可检测的活性；以及二恶英响应区域，该二恶英响应区域包含二恶英应答元件，并且二恶英响应区域与第一核酸序列可操作地连接。在二恶英类化合物存在的情况下，该重组细胞中的第一核酸序列的转录能够被启动，从而表达报告蛋白，进而可以通过检测报告蛋白的活性，获得样本中二恶英类化合物的信息，从而实现对样本中二恶英类化合物的检测。根据本发明的另一方面，本发明提供了一种制备根据本发明实施例的重组细胞的方法。根据本发明的实施例，该方法包括使用根据本发明实施例的一组适于转化细胞的载体转化细胞。利用根据本发明实施例的制备重组细胞的方法，能够有效地制备重组细胞，并且效率高，所得重组细胞能够有效地应用于对样本中二恶英类化合物的检测。根据本发明的又一方面，本发明提供了一种检测样本中二恶英化合物的方法。根据本发明的实施例，该方法包括下列步骤将样本与根据本发明实施例的重组细胞接触，优选该重组细胞处于适于报告蛋白表达的培养基中，更优选重组细胞处于适于报告蛋白表达的液体培养基中；将重组细胞在适于报告蛋白表达的条件下进行培养；以及检测报告蛋白的活性，优选对报告蛋白的活性进行定量检测。发明人惊奇地发现，利用该方法能够方便有效地检测样本中的二恶英类化合物，并且需时少，成本低，灵敏度高，检测结果准确，可重复性好。根据本发明的再一方面，本发明提供了一种用于检测样本中二恶英化合物的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒包括根据本发明实施例的重组细胞；以及适于报告蛋白表达的培养基，其中，任选地重组细胞呈选自干粉、固定在载体上或者悬浮液至少一种的状态。发明人发现，利用该试剂盒能够方便快速实现对样本中二恶英化合物的检测，并且成本低，需时少，灵敏度高，可重复性好，检测结果准确、有效。根据本发明的又一方面，本发明提供了一种用于检测样本中二恶英化合物的系统。根据本发明的实施例，该系统包括 反应模块，该反应模块内设置有根据本发明实施例的重组细胞，以便与待检测的样本接触，并启动重组细胞表达报告蛋白，优选重组细胞处于适于报告蛋白表达的培养基中，更优选重组细胞处于适于报告蛋白表达的液体培养基中；以及报告蛋白活性检测模块，用于对重组细胞所表达的报告蛋白的活性进行检测，优选对报告蛋白的活性进行定量检测，其中，优选二恶英化合物为选自2，3，7，8-T⑶D和PCB的至少一种，优选进一步包括数据处理模块，该数据处理模块内预存有二恶英化合物浓度标准曲线，并且数据处理模块与报告蛋白活性检测模块相连，该数据处理模块根据报告蛋白活性的检测结果得到量化的二恶英化合物检测结果；以及任选地显示模块，该显示模块与数据处理模块相连，用于显示二恶英化合物检测结果。根据本发明的实施例，利用该系统能够方便地对样本中的二恶英化合物进行检测，并且可重复性好，需时少、成本低，灵敏度高，结果准确、有效。根据本发明的另一方面，本发明提供了一种筛选具有降解二恶英化合物活性的制剂的方法。根据本发明的实施例，该方法包括下列步骤将含有二恶英化合物的样本与怀疑具有降解二恶英化合物活性的制剂以及根据本发明实施例的重组细胞接触，并测定重组细胞的报告蛋白活性，得到第一活性；将含有二恶英化合物的样本在不存在该制剂时与重组细胞接触，并测定重组细胞的报告蛋白活性，得到第二活性；其中，第一活性低于第二活性是该制剂具有降解二恶英化合物活性的指示，优选二恶英化合物为选自2，3，7，8-Τ⑶D和PCB的至少一种；优选将含有二恶英化合物的样本与怀疑具有降解二恶英化合物活性的制剂以及重组细胞在适于报告蛋白表达的培养基中进行混合，并实时检测二恶英化合物含量的变化。发明人发现，利用根据本发明实施例的筛选具有降解二恶英化合物活性的制剂的方法，能够通过实时检测二恶英化合物含量的变化，来反映制剂是否具有降解二恶英化合物的活性，从而能够有效地筛选具有降解二恶英化合物活性的制剂，并且筛选的灵敏度非常闻。本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中图I是根据二恶英毒性作用机制构建重组细胞的原理示意图；图2是根据本发明一个实施例的制备重组细胞的方法的原理示意图；图3是根据本发明一个实施例的两种第一载体的载体图谱；图4是根据本发明一个实施例的第二载体的载体图谱；图5是根据根据本发明一个实施例的小鼠肝癌重组细胞株H印al_6DEGFP、Hepal-6ADEGFP在同等浓度二恶英标准样品2，3，7，8-T⑶D诱导下的荧光照片；
图6是根据根据本发明一个实施例的小鼠肝癌转化细胞株H印al_6DLUC经O. 01pg/mL-10000pg/mL 的二恶英标准样品 2，3，7，8-TCDD 和 lpg/mL-Ι μ g/ml 的 PCBs 标准品处理24小时的发光强度结果；以及图7是根据本发明一个实施例的小鼠肝癌转化细胞株!fepal-6ADLUC经O. Olpg/mL-10000pg/mL 的二恶英标准样品 2，3，7，8-TCDD 和 lpg/mL-Ι μ g/ml 的 PCBs 标准品处理24小时的发光强度结果。
具体实施例方式下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。需要说明的是，在本发明的描述中，除非另有明确的规定和限定，术语“相连”、“连 接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，一体地连接，也可以是可拆卸连接；可以是机械连接或电连接，也可以是两个元件内部的连通；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语的具体含义。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。术语“第一”、“第二”等仅用于方便描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。图I显示了二恶英类化学物质的毒性机制研究得最广泛的AHR传递途径二恶英进入细胞后，与芳香烃受体AhR结合，受体-配体复合物进入细胞核与核内AhR转运蛋白ARNT结合形成异二聚体，随后AhR/ARNT复合物与特异基因上游部位的增强子即二恶英反应元件(dioxin responsive element, DRE)结合，专一地诱导如细胞色素P450基因(CYPIAI, CYPIA2)的转录，CYPIAl, CYPIA2的表达产物芳烃羟化酶，可将前致癌物转化为致癌物，从而促进机体癌症的发生。其中二恶英反应元件的核心序列为5' -T/GNGCGTGA/CG/CA-3'，在辨识二恶英类物质的过程中发挥着重要作用。发明人发现，二恶英与芳香烃受体结合的量与其诱导基因表达的能力在一定范畴内呈正比，而AhR在细胞中的含量较低。因而，如图2所示，发明人首次提出了利用高敏型重组细胞株，即AhR含量相对较高的小鼠肝癌细胞系，或者通过增加强启动子的方法增加了 AhR的表达量，从而提高了检测二恶英类物质的灵敏度。适于转化细胞的载体根据本发明的一个方面，本发明提供了一组适于转化细胞的载体。根据本发明的实施例，该组载体包括第一载体和第二载体。其中，参考图3，第一载体包含第一核酸序列，该第一核酸序列包括编码报告蛋白的序列，该报告蛋白具有可检测的活性；以及二恶英响应区域，该二恶英响应区域包含二恶英应答元件，并且二恶英响应区域与第一核酸序列可操作地连接。参考图4，第二载体包含第二核酸序列，该第二核酸序列包含编码芳香烃受体的序列。利用本发明的一组适于转化细胞的载体，能够有效地将编码报告蛋白的序列、二恶英应答元件以及编码芳香烃受体的序列引入宿主细胞中，从而能够有效地构建重组细胞，进而，在二恶英的诱导下，重组细胞能够启动报告基因的转录和表达，由此，利用该重组细胞能够通过所表达报告蛋白的活性的检测，有效地实现对二恶英类化合物的检测。
在本发明中所使用的术语“细胞”应做广义理解，其是任何能够与载体发生同源重组，并且能够在外加二恶英类化合物的调控下表达活性报告蛋白的细胞或者亚细胞组分，可以是天然细胞，也可以是人工构建的细胞。根据本发明的实施例，细胞的种类并不受特别限制，根据本发明的具体示例，细胞可以为小鼠肝癌细胞。根据本发明的一个具体示例，细胞为小鼠肝癌细胞!fepal-6，该细胞扩增快，培养容易，并且容易通过常规方法进行遗传操作得到重组细胞，从而能够进一步提高重组细胞检测二恶英类化合物的效率。在本发明中所使用的术语“载体”是指这样的一种遗传载体，其包含特定核酸序列，并且能够将目的核酸序列转入宿主细胞中与宿主细胞的基因组发生同源重组以获得重组细胞。根据本发明的实施例，载体的形式不受特别限制，根据本发明的具体示例，其可以为质粒、噬菌体、人工染色体、粘粒(Cosmid)、病毒的至少一种。根据本发明的具体示例，载体呈质粒的形式。质粒作为遗 传载体，具有操作简单，可以携带较大片段的性质，便于操作和处理。质粒的形式也不受特别限制，既可以是环形质粒，也可以是线性质粒，即可以是单链的，也可以是双链的。本领域技术人员可以根据需要进行选择。在本发明中所使用的术语“核酸”可以是任何包含脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于经过修饰的或者未经修饰的DNA、RNA，其长度不受任何特别限制。对于用于构建重组细胞的载体，优选核酸为DNA，因为DNA相对于RNA而言，其更稳定，并且易于操作。在本发明中所使用的术语“报告蛋白”是指这样的一种蛋白质，其在表达后，能够产生可以直接或者间接检测的信号，进而能够反映二恶英类化合物是否启动了相应的调节机制。根据本发明的实施例，在本发明的该组适于转化细胞的载体中，报告蛋白的类型不受特别限制，只要其具有可检测的活性即可。根据本发明的一些实施例，报告蛋白可以为选自发光蛋白、荧光蛋白、酶的至少一种。具体地，根据本发明的实施例，报告蛋白可以是一种能够产生光学信号的蛋白质例如发光蛋白或者荧光蛋白例如绿色荧光蛋白等，或者报告蛋白可以是一种能够与底物相互作用以产生可检测信号的酶。由此，可以根据常规的方法，对报告蛋白进行监测。例如可以采用比色法、荧光法、生物发光法、化学发光法、酶联免疫法(ELISA)及原位染色法对报告蛋白进行检测。根据本发明的一些具体示例，优选地，报告蛋白可以为绿色荧光蛋白(gfp)、增强型绿色荧光蛋白(Egfp)以及荧光素酶的至少一种。根据本发明的一个具体示例，优选报告蛋白为增强型绿色荧光蛋白，由此，报告蛋白产生的荧光信号能够更容易地被检测到，从而使信号检测更加灵敏，且其检测在细胞原位状态即可完成，简单方便，并且能够实现对二恶英类化合物的连续、实时检测。在本文中所使用的术语“二恶英响应区域”的含义是这样的一段序列，其能够在存在二恶英时发挥其功能，即可以是发挥功能直接改变报告基因的表达，也可以是间接地改变报告基因的表达。根据本发明的实施例，二恶英响应区域可以由二恶英应答元件构建。构成二恶英响应区域的应答元件的数目并不受特别限制。根据本发明的一些实施例，在本发明的该组适于转化细胞的载体中，二恶英响应区域包含多个串联的二恶英应答元件。根据本发明的具体示例，二恶英应答元件具有如SEQ ID NO :1-7至少一项所示的核苷酸序列。根据本发明的一些实施例，二恶英响应区域可以进一步包含第一启动子，该第一启动子分别与二恶英应答元件和第一核酸序列可操作地相连。在本发明中所使用的术语“启动子”指的是这样一种核酸序列，其能够指导与其可操纵地连接的核酸分子的转录。在本发明中所使用的术语“可操纵地”指的是核酸表达控制序列例如启动子、信号序列、增强子等与目标核酸序列之间的功能连接，其中当合适的分子例如转录活化分子与表达控制序列结合时，表达控制序列影响着对应于目标核酸序列的核酸的转录和/或翻译。由此，根据本发明的实施例，可以直接通过载体在宿主细胞中引入特定的第一启动子，并且该第一启动子可以用于启动第一核酸序列的转录和表达，由此，可以提高所获得的重组细胞对芳香族化合物的应答效率，并且扩大了宿主细胞的选择范围。根据本发明的具体示例，第一启动子可以为CMV启动子或其功能等同体，其中“其功能等同体”是指能够发挥与CMV启动子相同或相似功能的启动子，例如MMTV启动子和SV40启动子。根据本发明的一个具体示例，第一启动子具有如SEQ ID N0:8所示的核苷酸序列。发明人惊奇地发现，当采用SEQ ID N0:8所示的核苷酸序列作为第一启动子时，利用该组载体构建的重组细胞具有显著突出的检测灵敏度和精确度。根据本发明的实施例，在本发明的该组适于转化细胞的载体中，第一载体可以进一步包含编码第一筛选标记基因的核酸序列。在本发明中所使用的术语“筛选标记基因”指的是这样的一种基因，其编码的产物能够赋予连同载体接受该基因的细胞一种特殊的性 质，该特殊的性质使得接受该基因的细胞与未接受该基因的细胞很容易被区分开。由此，便于筛选重组细胞。根据本发明实施例，第一筛选标记基因的种类不受特别限制，根据本发明的具体示例，第一筛选标记基因可以为选自编码发光蛋白的基因和药物抗性基因的至少一种。根据本发明的实施例，第一筛选标记基因为药物抗性基因，由此，能够容易地通过重组细胞的抗药性来进行筛选，例如在培养基中添加杀菌剂例如青霉素、卡那霉素等，则相应连同载体接受并表达杀菌剂抗性基因的细胞将能够在培养基上存活下来。根据本发明的实施例，药物抗性基因的类型不受特别限制，根据本发明的一些具体示例，药物抗性基因优选为选自新霉素磷酸转移酶和潮霉素B抗性基因的至少一种，由此，能够进一步提高筛选重组细胞的效率。根据本发明的实施例，在本发明的该组适于转化细胞的载体中，第二核酸序列具有如SEQ ID NO :9所示的核苷酸序列。根据本发明的一些实施例，第二载体可以进一步包括第二启动子，该第二启动子与第二核酸序列可操作地连接。根据本发明的实施例，第二启动子的类型不受特别限制，根据本发明的一些具体示例，第二启动子可以为真核细胞启动子。根据本发明的具体示例，真核细胞启动子可以为选自CAG启动子和PGK启动子的至少一种。根据本发明的一些实施例，在本发明的该组适于转化细胞的载体中，第二载体可以进一步包含增强子序列，该增强子序列与第二核酸序列可操作地连接。根据本发明的具体示例，第二载体可以进一步包含内含子序列，该内含子序列与第二核酸序列可操作地连接。根据本发明的实施例，第二筛选标记基因的类型不受特别限制，根据本发明的具体示例，第二载体可以进一步包括编码第二筛选标记基因的核酸序列。根据本发明的一些实施例，第二筛选标记基因可以为选自编码发光蛋白的基因和药物抗性基因的至少一种。根据本发明的实施例，第一筛选标记基因与第二筛选标记基因不同。根据本发明的另一方面，本发明提供了一种适于转化细胞的载体。根据本发明的实施例，该载体包括第一核酸序列，该第一核酸序列包括编码报告蛋白的序列，该报告蛋白具有可检测的活性；以及二恶英响应区域，该二恶英响应区域包含二恶英应答元件，并且二恶英响应区域与第一核酸序列可操作地连接。利用该载体，能够有效地将编码报告蛋白的序列和二恶英应答元件引入宿主细胞中，其中报告基因的转录和表达以及表达量是检测二恶英类化合物的指示，而二恶英应答元件是诱导报告基因表达的必要条件，因此，该载体适于转化细胞，能够用于构建检测二恶英类化合物的重组细胞。根据本发明的具体示例，在上述载体中，细胞可以为小鼠肝癌细胞。根据本发明的一个具体示例，细胞为小鼠肝癌细胞Hepal-6。根据本发明的一些实施例，报告蛋白可以为选自发光蛋白、荧光蛋白、酶的至少一种。根据本发明的一些具体示例，优选地，报告蛋白可以为绿色荧光蛋白(gfp)、增强型绿色荧光蛋白(Egfp)以及荧光素酶的至少一种。根据本发明的一个具体示例，优选报告蛋白为增强型绿色荧光蛋白。根据本发明的一些实施例，在该载体中，二恶英响应区域包含多个串联的二恶英应答元件。根据本发明的具体示例，二恶英应答元件具有如SEQ ID NO :1-7至少一项所示的核苷酸序列。根据本发明的一些实施例，二恶英响应区域可以进一步包含第一启动子，该第一启动子分别与二恶英应答元件和第一核酸序列可操作地相连。根据本发明的具体示例，第一启动子可以为CMV启动子或其功能等同体，其中“其功能等同体”是指能够发挥与CMV启动子相同或相似功能的启动子，例如MMTV启动子和SV40启动子。根据本发明的一个具体示例，第一启动子具有如SEQ ID NO:8 所示的核苷酸序列。根据本发明的实施例，该载体可以进一步包含编码第一筛选标记基因的核酸序列。根据本发明的具体示例，第一筛选标记基因基可以为选自编码发光蛋白的基因和药物抗性基因的至少一种。根据本发明的一些具体示例，药物抗性基因优选为选自新霉素磷酸转移酶和潮霉素B抗性基因的至少一种。根据本发明的又一方面，本发明提供了另一种适于转化细胞的载体。根据本发明的实施例，该载体包含第二核酸序列，该第二核酸序列包含编码芳香烃受体的序列。利用该载体，能够有效地将编码芳香烃受体的序列引入宿主细胞中，其中编码芳香烃受体的序列所表达的芳香烃受体能够有效地结合二恶英类化合物，并能够诱导其下游基因的转录和表达，因此，该载体适于转化细胞，能够用于构建检测二恶英类化合物的重组细胞。根据本发明的具体示例，在上述载体中，细胞可以为小鼠肝癌细胞。根据本发明的一个具体示例，细胞为小鼠肝癌细胞Hepal-6。根据本发明的实施例，在该载体中，第二核酸核酸序列具有如SEQ ID NO :9所示的核苷酸序列。根据本发明的一些实施例，第二载体可以进一步包括第二启动子，该第二启动子与第二核酸序列可操作地连接。根据本发明的实施例，第二启动子的类型不受特别限制，根据本发明的一些具体示例，第二启动子可以为真核细胞启动子。根据本发明的具体示例，真核细胞启动子可以为选自CAG启动子和PGK启动子的至少一种。根据本发明的一些实施例，在本发明的该组适于转化细胞的载体中，第二载体可以进一步包含增强子序列，该增强子序列与第二核酸序列可操作地连接。根据本发明的具体示例，第二载体可以进一步包含内含子序列，该内含子序列与第二核酸序列可操作地连接。根据本发明的实施例，第二筛选标记基因的类型不受特别限制，根据本发明的具体示例，第二载体可以进一步包括编码第二筛选标记基因的核酸序列。根据本发明的一些实施例，第二筛选标记基因可以为选自编码发光蛋白的基因和药物抗性基因的至少一种。根据本发明的实施例，第一筛选标记基因与第二筛选标记基因不同。重组细胞及其制备方法根据本发明的再一方面，本发明提供了一种重组细胞。根据本发明的实施例，该重组细胞的基因组中包含第一核酸序列，该第一核酸序列包括编码报告蛋白的序列，该报告蛋白具有可检测的活性；以及二恶英响应区域，该二恶英响应区域包含二恶英应答元件，并且二恶英响应区域与第一核酸序列可操作地连接。在二恶英类化合物存在的情况下，该重组细胞中的第一核酸序列的转录能够被启动，从而表达报告蛋白，进而可以通过检测报告蛋白的活性，获得样本中二恶英类化合物的信息，从而实现对样本中二恶英类化合物的检测。根据本发明的具体示例，本发明的重组细胞可以为小鼠肝癌细胞。根据本发明的一个具体示例，本发明的重组细胞为小鼠肝癌细胞H印al-6。根据本发明的一些实施例，报告蛋白可以为选自发光蛋白、荧光蛋白、酶的至少一种。根据本发明的一些具体示例，优选地，报告蛋白可以为绿色荧光蛋白(gfp)、增强型绿色荧光蛋白(Egfp)以及荧光素酶的至少一种。根据本发明的一个具体示例，优选报告蛋白为增强型绿色荧光蛋白。根据本发明的一些实施例，在本发明的重组细胞中，二恶英响应区域包含多个串联的二恶英应答元件。根据本发明的具体示例，二恶英应答元件具有如SEQ ID NO :1-7至少一项所示的核苷酸序列。根据本发明的一些实施例，二恶英响应区域可以进一步包含第一启动子，该第一启动子 分别与二恶英应答元件和第一核酸序列可操作地相连。根据本发明的一个具体示例，第一 启动子具有如SEQ ID N0:8所示的核苷酸序列。根据本发明的实施例，本发明的重组细胞过表达芳香烃受体。根据本发明的一些实施例，重组细胞的基因组中包含第二核酸序列，该第二核酸序列包含编码芳香烃受体的序列核酸序列。根据本发明的一些实施例，重组细胞的基因组中包含第二启动子，该第二启动子与第二核酸序列可操作地连接。根据本发明的实施例，第二启动子的类型不受特别限制，根据本发明的一些具体示例，第二启动子可以为真核细胞启动子。根据本发明的具体示例，真核细胞启动子可以为选自CAG启动子和PGK启动子的至少一种。根据本发明的一些实施例，本发明的重组细胞中可以进一步包含增强子序列，该增强子序列与第二核酸序列可操作地连接。根据本发明的具体示例，组细胞中可以进一步包含内含子序列，该内含子序列与第二核酸序列可操作地连接。此外，根据本发明实施例的重组细胞为选自按照保藏号CCTCC C 2011112、CCTCCC2011113、CCTCC C 2011114和CCTCC C 2011115保藏于中国典型培养物保藏中心的重组细胞的至少一种。根据本发明的另一方面，本发明提供了一种制备根据本发明实施例的重组细胞的方法。根据本发明的实施例，该方法包括使用根据本发明实施例的一组适于转化细胞的载体转化细胞。利用根据本发明实施例的制备重组细胞的方法，能够有效地制备重组细胞，并且效率高，所得重组细胞能够有效地应用于对样本中二恶英类化合物的检测。检测样本中二恶英的方法根据本发明的又一方面，本发明提供了一种检测样本中二恶英化合物的方法。根据本发明的实施例，该方法包括下列步骤将样本与根据本发明实施例的重组细胞接触，优选该重组细胞处于适于报告蛋白表达的培养基中，更优选重组细胞处于适于报告蛋白表达的液体培养基中；将重组细胞在适于报告蛋白表达的条件下进行培养；以及检测报告蛋白的活性，优选对报告蛋白的活性进行定量检测。发明人惊奇地发现，利用该方法能够方便有效地检测样本中的二恶英类化合物。根据本发明的实施例，可以利用本发明的方法检测的二恶英化合物的类型并不受特别限制。根据本发明的具体示例，样本中的二恶英化合物可以为选自2，3，7，8-TCDD和PCB的至少一种。根据本发明的实施例，在该方法中，将重组细胞与样本接触16-48小时，优选16-24小时。根据本发明的实施例，该方法可以进一步包括将报告蛋白的活性与预定的二恶英化合物浓度标准曲线进行比较，以确定样本中二恶英化合物的含量。试剂盒根据本发明的再一方面，本发明提供了一种用于检测样本中二恶英化合物的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒包括根据本发明实施例的重组细胞；以及适于报告蛋白表达的培养基，其中，任选地重组细胞呈选自干粉、固定在载体上和固定在悬浮液中至少一种的状态。发明人发现，利用该试剂盒能够方便快速实现对样本中二恶英化合物的检测，并且成本低，需时少，检测结果准确、有效。用于检测样本中二恶英化合物的系统根据本发明的又一方面，本发明提供了一种用于检测样本中二恶英化合物的系 统。根据本发明的实施例，该系统包括反应模块和报告蛋白活性检测模块。根据本发明的一些实施例，反应模块内设置有根据本发明实施例的重组细胞，以便与待检测的样本接触，并启动重组细胞表达报告蛋白，优选重组细胞处于适于报告蛋白表达的培养基中，更优选重组细胞处于适于报告蛋白表达的液体培养基中。根据本发明的实施例，报告蛋白活性检测模块用于对重组细胞所表达的报告蛋白的活性进行检测，优选对报告蛋白的活性进行定量检测。根据本发明的一些实施例，优选二恶英化合物为选自2，3，7，8-T⑶D和PCB的至少一种。根据本发明的实施例，优选该系统可以进一步包括数据处理模块和任选的显示模块。根据本发明的一些实施例，数据处理模块内预存有二恶英化合物浓度标准曲线，并且数据处理模块与报告蛋白活性检测模块相连，该数据处理模块根据报告蛋白活性的检测结果得到量化的二恶英化合物检测结果。根据本发明的一些实施例，其中该显示模块与数据处理模块相连，用于显示二恶英化合物检测结果。根据本发明的实施例，利用该系统能够方便地对样本中的二恶英化合物进行检测，并且可重复性好，需时少、成本低，灵敏度高，结果准确、有效。筛选具有降解二恶英化合物活性的制剂的方法根据本发明的另一方面，本发明提供了一种筛选具有降解二恶英化合物活性的制剂的方法。根据本发明的实施例，该方法包括下列步骤首先，将含有二恶英化合物的样本与怀疑具有降解二恶英化合物活性的制剂以及根据本发明实施例的重组细胞接触，并测定重组细胞的报告蛋白活性，得到第一活性。其次，将含有二恶英化合物的样本在不存在该制剂时与重组细胞接触，并测定重组细胞的报告蛋白活性，得到第二活性。其中，根据本发明的实施例，第一活性低于第二活性是该制剂具有降解二恶英化合物活性的指示。根据本发明的一些实施例，优选二恶英化合物为选自2，3，7，8-T⑶D和PCB的至少一种。根据本发明的具体示例，优选将含有二恶英化合物的样本与怀疑具有降解二恶英化合物活性的制剂以及重组细胞在适于报告蛋白表达的培养基中进行混合，并实时检测二恶英化合物含量的变化。
发明人发现，利用根据本发明实施例的筛选具有降解二恶英化合物活性的制剂的方法，能够通过实时检测二恶英化合物含量的变化，来反映制剂是否具有降解二恶英化合物的活性，从而能够有效地筛选具有降解二恶英化合物活性的制剂，并且筛选的灵敏度非常闻。需要说明的是，根据本发明实施例的适于转化细胞的载体、重组细胞及其用途，是本申请的发明人经过艰苦的创造性劳动和优化工作而完成的。下面根据具体的实施例对本发明进行说明。需要说明的是，这些实施例仅仅是为了说明本发明，而不能以任何方式解释为对本发明的限制。另外，除非特别说明，在下面的实施例中所涉及的方法为常规方法，所涉及的材料和制剂也为市售可得的。
下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，可以参照《分子克隆实验指南》第三版或者相关产品进行，所采用的试剂和产品也均为可商业获得的。实验材料I、二恶英(2，3，7，8-T⑶D)溶液(深圳疾病预防控制中心)，原始浓度为10 μ g/ml,在实验前用二甲亚砜(DMSO)稀释成不同浓度备用；2、PCBs标准品溶液(深圳疾病预防控制中心)，原始浓度为10 μ g/ml，实验前用二甲亚砜(DMSO)稀释成不同浓度备用；3、细胞培养用培养基杜贝可氏改良的依格氏培养基(DMEM)购自Invitrogen、胎牛血清(FBS)均购自 Thermo Fisher Scientific,细菌培养用培养基LB培养基所使用的酵母粉、蛋白胨均购自0X0ID，氯化钠、琼脂均购自生工生物工程(上海)有限公司；4、培养及筛选用抗生素氨苄青霉素、卡那霉素均购自生工生物工程(上海)有限公司，G418、潮霉素均购自Invitrogen;5、限制性内切酶均购自NEB ；6、突光素酶检测试剂盒Luciferase Assay System购自Promega公司；7、转染试剂盒FuGENEk HD Transfection Reagent 购自 Roche 公司；8、载体pEGFP-Nl载体购自Promega公司，含有增强型绿色荧光蛋白基因(Egfp)及多克隆位点，作为绿色荧光蛋白基因的来源；pGL3_basic载体购自Promega公司，含有氨节青霉素抗性基因(Amplr)'突光素酶报告基因(Iuc+)及多克隆位点，作为荧光素酶报告基因的来源；pcDNA3. I载体购自Promega公司，含有氨节青霉素抗性基因(Amplr)'新霉素抗性基因(NecZ)、多克隆位点，作为重组报告基因载体的基本骨架；pCAG-intron含有氨苄青霉素抗性基因(Amp")、新霉素抗性基因(Neo")、CAG启动子、内含子intron及多克隆位点，作为ahr过表达载体的基本骨架；以及附着子载体pCEP4购自Invitrogen公司，含有氨节青霉素抗性基因(Amp1·)、潮霉素抗性基因(HygD。
细胞株与培养条件用于转染的宿主细胞是小鼠肝癌细胞H印al-6，购自北京协和细胞中心，其培养及传代方式如下将细胞混合以添加有10%胎牛血清(FBS)的DMEM，并将所形成的细胞悬浮液加到培养皿中，于37°C，5%C02的培养箱中培养。当培养皿底部80%-90%被培养的细胞覆盖时，移除培养液并用3-5ml的无菌PBS缓冲液(pH7. 4)洗涤细胞，进一步加入Iml胰蛋白酶使细胞自培养皿底部脱离。之后加入新鲜的培养液并用移液管反复轻轻吹吸培养液使细胞分散开，然后将形成的细胞悬浮液分到培养皿(直径IOcm)中，于37°C，5%C02的培养箱中进行培养。实施例I含有二恶英反应元件DRE和报告基因的重组细胞株H印al_6DEGFP、H印al-6DLUC的构建I、含有二恶英反应元件DRE和报告基因的重组载体pDRE-CMVmin-EGFP、pDRE-CMVmin-luc+ 的构建研究表明小鼠细胞色素P450基因CYPlAl上游有标号为A-F共6个二恶英反应元件，可以结合二恶英-芳香烃受体复合物，启动CYPlAl的表达，其中B、D、E、F的结合及启动效率较高(Amy Lusska et al. Protein-DNA Interactions at a Dioxin-responsiveEnhancer. 1993. The Journal of Biological Chemistry.)。通过基因合成的方法(Invitrogen公司)合成3段串联的DRE序列和巨细胞病毒早期启动子的基本元件CMVmin(为方便描述，在本文中记作3DRE+CMVmin)，为了后续操作方便，分别在片段的5’和3’端添力口 Bgl II和Hind III限制性内切酶酶切位点。通过Bgl 11和出11(1111酶切，将301 +01^1^11片段(195bp)插入到以Bgl II和Hind III酶切处理的载体P⑶NA3. I (5. 4kb)内，获得重组载体pDRE-CMVmin (4. 7kb)，从而将p⑶NA3. I中的组成型启动子置换为可受二恶英诱导的启动子3DRE+CMVmin。接下来，将pDRE-CMVmin转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，涂布含有氨苄西林的LB固体平板，得到单克隆扩大培养后，使用离心柱型质粒小提试剂盒(TIANGEN)提取重组质粒，并以载体P⑶ΝΑ3. I为对照进行琼脂糖凝胶电泳验证，确认3DRE+CMVmin插入到了 pCDNA3. I 中。其中，3DRE+CMVmin序列如下AGATCT (TACCTGTGTGCGTGCCAAGG) ( T C T T C T C A C G C A A C T C C GA G)(CGCCGGGTTTGCGTGCGATGA)TAGGCGTGTACGGTGGGAGGCCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCAAGCTT。其中，3个括号中所示的序列分别为3个DRE的序列，下划线所示的序列则为CMVmin的序列。进一步通过BamHI和NotI双酶切pEGFP_Nl获得启动子缺失的增强型绿色荧光蛋白基因egfp(700bp),将egfp插入到以BamH I和Not I切开的重组载体pDRE-CMVmin内，获得含有二恶英反应元件DRE和增强型绿色荧光蛋白基因的重组载体pDRE-CMVmin-EGFP(5. 4kb)，其中增强型绿色荧光蛋白基因的表达受上游的二恶英反应元件和CMVmin调控，将连接产物转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，涂布含有氨苄西林的LB固体平板，得到单克隆扩大培养后，使用离心柱型质粒小提试剂盒(TIANGEN)提取重组质粒，并以载体pDRE-CMVmin为对照进行琼脂糖凝胶电泳验证，确认增强型绿色荧光蛋白基因egfp插入到pDRE-CMVmin 中。
利用与前述相同的方法，简言之，通过BamH I和Hind III双酶切pGL3_Basic获得启动子缺失的荧光素酶基因Iuc+ (I. 7kb)，并将将Iuc+插入到以BamH I和Hind III切开的重组载体pDRE-CMVmin内，获得含有二恶英反应元件DRE和荧光素酶报告基因的重组载体pDRE-CMVmin-luc+ (6. 4kb)，其中荧光素酶报告基因的表达受上游的二恶英反应元件和CMVmin调控。接下来，将pDRE-CMVmin-luc+转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，涂布含有氨苄西林的LB固体平板，得到单克隆扩大培养后，使用离心柱型质粒小提试剂盒(TIANGEN)提取重组质粒，并以载体pDRE-CMVmin为对照进行琼脂糖凝胶电泳验证，确认荧光素酶报告基因Iuc+插入到pDRE-CMVmin中。使用无内毒素质粒提取试剂盒(TIANGEN)提取重组载体pDRE-CMVmin-EGFP和pDRE-CMVmin-luc+，储存于 _20°C备用。2、利用重组载体pDRE-CMVmin-EGFP和pDRE-CMVmin-luc+分别转染小鼠肝癌细胞株 Hepal-6
小鼠肝癌细胞株H印a 1-6的培养按照前面所述的方法进行。采用脂质体法进行转染，使用Roche公司的FuGENE* HDTransfection Reagent,操作步骤及各试剂加量参照试剂盒说明书进行。将小鼠肝癌细胞H印al-6以一定密度接种于24孔板，待细胞汇合度在80%_90%时，移除培养液并更换新鲜的含10%FBS的DMEM培养液。使用FuGHNE''HD Transfection Reagent 转染试剂与 pDRE-CMVmin-EGFP 混合，制备转染混合液。转染混合液组成如下
权利要求
1.一组适于转化细胞的载体，其特征在于，包括 第一载体，所述第一载体包含 第一核酸序列，所述第一核酸序列包括编码报告蛋白的序列，所述报告蛋白具有可检测的活性；以及 二恶英响应区域，所述二恶英响应区域包含二恶英应答元件，并且所述二恶英响应区域与所述第一核酸序列可操作地连接， 第二载体，所述第二载体包含 第二核酸序列，所述第二核酸序列包含编码芳香烃受体的序列，任选地，所述细胞为小鼠肝癌细胞， 任选地，所述细胞为小鼠肝癌细胞Hepal-6。
2.根据权利要求I所述的一组适于转化细胞的载体，其特征在于，所述报告蛋白为选自发光蛋白、荧光蛋白、酶的至少一种， 任选地，所述报告蛋白为绿色荧光蛋白、增强型绿色荧光蛋白以及荧光素酶的至少一种， 任选地，所述报告蛋白为增强型绿色荧光蛋白， 任选地，所述二恶英响应区域包含多个串联的二恶英应答元件， 任选地，所述二恶英应答元件具有如SEQ ID NO :1-7至少一项所示的核苷酸序列，任选地，所述二恶英响应区域进一步包含第一启动子，所述第一启动子分别与所述二恶英应答元件和所述第一核酸序列可操作地相连， 任选地，所述第一启动子为CMV启动子或其功能等同体， 任选地,所述第一启动子具有如SEQ ID N0:8所示的核苷酸序列， 任选地，所述第一载体进一步包含编码第一筛选标记基因的核酸序列， 任选地，所述第一筛选标记基因为选自编码发光蛋白的基因和药物抗性基因的至少一种， 优选地，所述药物抗性基因为选自新霉素磷酸转移酶和潮霉素B抗性基因的至少一种， 任选地，所述第二核酸序列具有如SEQ ID NO :9所示的核苷酸序列， 任选地，所述第二载体进一步包括第二启动子，所述第二启动子与所述第二核酸序列可操作地连接， 任选地,所述第二启动子为真核细胞启动子， 任选地，所述真核细胞启动子为选自CAG启动子和PGK启动子的至少一种， 任选地，所述第二载体进一步包含增强子序列，所述增强子序列与所述第二核酸序列可操作地连接， 任选地，所述第二载体进一步包含内含子序列，所述内含子序列与所述第二核酸序列可操作地连接， 任选地，所述第二载体进一步包括编码第二筛选标记基因的核酸序列， 任选地，所述第二筛选标记基因为选自编码发光蛋白的基因和药物抗性基因的至少一种， 任选地，所述第一筛选标记基因与所述第二筛选标记基因不同。
3.—种适于转化细胞的载体，其特征在于，包括 第一核酸序列，所述第一核酸序列包括编码报告蛋白的序列，所述报告蛋白具有可检测的活性；以及 二恶英响应区域，所述二恶英响应区域包含二恶英应答元件，并且所述二恶英响应区域与所述第一核酸序列可操作地连接， 任选地，所述细胞为小鼠肝癌细胞， 任选地，所述细胞为小鼠肝癌细胞H印al-6, 任选地，所述报告蛋白为选自发光蛋白、荧光蛋白、酶的至少一种， 任选地，所述报告蛋白为绿色荧光蛋白、增强型绿色荧光蛋白以及荧光素酶的至少一 种， 任选地，所述报告蛋白为增强型绿色荧光蛋白， 任选地，所述二恶英响应区域包含多个串联的二恶英应答元件， 任选地，所述二恶英应答元件具有如SEQ ID NO :1-7至少一项所示的核苷酸序列，任选地，所述二恶英响应区域进一步包含第一启动子，所述第一启动子分别与所述二恶英应答元件和所述第一核酸序列可操作地相连， 任选地，所述第一启动子为CMV启动子或其功能等同体， 任选地,所述第一启动子具有如SEQ ID N0:8所示的核苷酸序列， 任选地，所述第一载体进一步包含编码第一筛选标记基因的核酸序列， 任选地，所述第一筛选标记基因为选自编码发光蛋白的基因和药物抗性基因的至少一种， 任选地，所述药物抗性基因优选为选自新霉素磷酸转移酶和潮霉素B抗性基因的至少一种。
4.一种适于转化细胞的载体，其特征在于，包含第二核酸序列，所述第二核酸序列包含编码芳香烃受体的序列， 任选地，所述细胞为小鼠肝癌细胞， 任选地，所述细胞为小鼠肝癌细胞H印al-6, 任选地，所述第二核酸核酸序列具有如SEQ IDNO 9所示的核苷酸序列， 任选地，所述第二载体进一步包括第二启动子，所述第二启动子与所述第二核酸序列可操作地连接， 任选地,所述第二启动子为真核细胞启动子， 任选地，所述真核细胞启动子为选自CAG启动子和PGK启动子的至少一种， 任选地，所述第二载体进一步包含增强子序列，所述增强子序列与所述第二核酸序列可操作地连接， 任选地，所述第二载体进一步包含内含子序列，所述内含子序列与所述第二核酸序列可操作地连接， 任选地，所述第二载体进一步包括编码第二筛选标记基因的核酸序列， 任选地，所述第二筛选标记基因为选自编码发光蛋白的基因和药物抗性基因的至少一种。
5.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞的基因组中包含第一核酸序列，所述第一核酸序列包括编码报告蛋白的序列，所述报告蛋白具有可检测的活性；以及 二恶英响应区域，所述二恶英响应区域包含二恶英应答元件，并且所述二恶英响应区域与所述第一核酸序列可操作地连接， 任选地，所述细胞为小鼠肝癌细胞， 任选地，所述细胞为小鼠肝癌Hepal-6细胞， 任选地，所述报告蛋白为选自发光蛋白、荧光蛋白、酶的至少一种， 任选地，所述报告蛋白为绿色荧光蛋白、增强型绿色荧光蛋白以及荧光素酶的至少一种， 任选地，所述报告蛋白为增强型绿色荧光蛋白， 任选地，所述二恶英响应区域包含多个串联的二恶英应答元件， 任选地，所述二恶英应答元件具有如SEQ ID NO :1-7至少一项所示的核苷酸序列，任选地，所述二恶英响应区域进一步包含第一启动子，所述第一启动子分别与所述二恶英应答元件和所述第一核酸序列可操作地相连， 任选地,所述第一启动子具有如SEQ ID N0:8所示的核苷酸序列， 任选地，所述二恶英响应区域具有如SEQ ID NO :9所示的核苷酸序列， 任选地，所述重组细胞过表达芳香烃受体， 任选地，所述重组细胞的基因组中包含第二核酸序列，所述第二核酸序列包含编码芳香烃受体的序列， 任选地，所述重组细胞的基因组中包含第二启动子，所述第二启动子与所述第二核酸序列可操作地连接， 任选地,所述第二启动子为真核细胞启动子， 任选地，所述真核细胞启动子为选自CAG启动子和PGK启动子的至少一种， 任选地，所述重组细胞的基因组中进一步包含增强子序列，所述增强子序列与所述第二核酸序列可操作地连接， 任选地，所述重组细胞的基因组中进一步包含内含子序列，所述内含子序列与所述第二核酸序列可操作地连接， 任选地，所述重组细胞为选自按照保藏号CCTCC C 2011112,CCTCC C 2011113,CCTCCC2011114和CCTCC C 2011115保藏于中国典型培养物保藏中心的重组细胞的至少一种。
6.一种制备权利要求5所述的重组细胞的方法，其特征在于，包括 使用权利要求I或2所述的一组适于转化细胞的载体转化细胞。
7.—种检测样本中二恶英化合物的方法，其特征在于，包括下列步骤 将所述样本与根据权利要求5所述的重组细胞接触，优选所述重组细胞处于适于报告蛋白表达的培养基中，更优选所述重组细胞处于适于报告蛋白表达的液体培养基中； 将所述重组细胞在适于所述报告蛋白表达的条件下进行培养；以及 检测所述报告蛋白的活性，优选对所述报告蛋白的活性进行定量检测， 任选地，所述二恶英化合物为选自2，3，7，8-T⑶D和PCB的至少一种， 任选地，所述重组细胞与所述样本接触16-48小时,优选16-24小时， 任选地，进一步包括将所述报告蛋白的活性与预定的二恶英化合物浓度标准曲线进行比较，以确定所述样本中二恶英化合物的含量。
8.一种用于检测样本中二恶英化合物的试剂盒，其特征在于，包括 根据权利要求5所述的重组细胞；以及 适于报告蛋白表达的培养基， 其中， 任选地，所述重组细胞呈选自干粉、固定在载体上和固定在悬浮液中至少一种的状态。
9.一种用于检测样本中二恶英化合物的系统，其特征在于，包括 反应模块，所述反应模块内设置有根据权利要求5所述的重组细胞，以便与待检测的 样本接触，并启动所述重组细胞表达报告蛋白，优选所述重组细胞处于适于报告蛋白表达的培养基中，更优选所述重组细胞处于适于报告蛋白表达的液体培养基中；以及 报告蛋白活性检测模块，用于对所述重组细胞所表达的报告蛋白的活性进行检测，优选对所述报告蛋白的活性进行定量检测， 其中， 优选所述二恶英化合物为选自2，3，7，8-T⑶D和PCB的至少一种， 优选所述系统进一步包括数据处理模块，所述数据处理模块内预存有二恶英化合物浓度标准曲线，并且所述数据处理模块与所述报告蛋白活性检测模块相连，所述数据处理模块根据所述报告蛋白活性的检测结果得到量化的二恶英化合物检测结果；以及任选的显示模块，所述显示模块与所述数据处理模块相连，用于显示所述二恶英化合物检测结果。
10.一种筛选具有降解二恶英化合物活性的制剂的方法，其特征在于，包括下列步骤 将含有二恶英化合物的样本与怀疑具有降解二恶英化合物活性的制剂以及根据权利要求5所述的重组细胞接触，并测定所述重组细胞的报告蛋白活性，得到第一活性； 将含有二恶英化合物的样本在不存在所述制剂时与所述重组细胞接触，并测定所述重组细胞的报告蛋白活性，得到第二活性； 其中， 第一活性低于所述第二活性是所述制剂具有降解二恶英化合物活性的指示， 优选所述二恶英化合物为选自2，3，7，8-T⑶D和PCB的至少一种， 优选将所述含有二恶英化合物的样本与所述怀疑具有降解二恶英化合物活性的制剂以及所述重组细胞在适于所述报告蛋白表达的培养基中进行混合，并实时检测所述二恶英化合物含量的变化。
全文摘要
提供了适于转化细胞的载体、重组细胞及其用途。其中，一组适于转化细胞的载体包括第一载体和第二载体。第一载体包含第一核酸序列，该第一核酸序列包括编码报告蛋白的序列，该报告蛋白具有可检测的活性；以及二恶英响应区域，该二恶英响应区域包含二恶英应答元件，并且二恶英响应区域与第一核酸序列可操作地连接。第二载体包含第二核酸序列，该第二核酸序列包含编码芳香烃受体的序列。本发明的适于转化细胞的载体和重组细胞，可用于二恶英类化合物的检测。
文档编号G01N33/68GK102851312SQ201210058478
公开日2013年1月2日 申请日期2012年3月7日 优先权日2012年3月7日
发明者徐俊光, 李勇, 魏霞, 赵云, 战丽萍, 张立通, 王俊, 汪建 申请人:深圳华大基因研究院, 深圳华大基因科技有限公司