专利名称：检测口蹄疫病毒非结构蛋白抗体的单克隆抗体阻断elisa试剂盒及方法
技术领域：
本发明涉及检测口蹄疫病毒非结构蛋白抗体的单克隆抗体阻断ELISA(FMDVNSPB-ELISA)试剂盒及方法，属于生物技术领域。
背景技术：
口蹄疫(foot-and-mouth disease, FMD)是由口蹄疫病毒(foot-andnouthdisease virus, FMDV)感染引起的偶蹄动物共患的一种烈性传染病。由于其发病率极高，严重影响畜牧业生产和国际贸易，因而受到各国的高度重视。口蹄疫防控主要采取疫苗免疫和屠宰感染和可疑畜的综合性防控措施，而疫苗免疫动物与感染动物都会产生结构蛋白抗体，因此检测结构蛋白抗体的诊断方法很难区分疫苗免疫动物与感染动物。目前畜牧业生产中使用的口蹄疫疫苗主要是灭活疫苗，灭活疫苗在纯化的过程中除去了大部分非结构蛋白，免疫动物不产生非结构蛋白抗体。自然感染动物体内有病毒复制，既产生非结构蛋白抗体又产生结构蛋白抗体，因此学者们认为检测非结构蛋白抗体对于区别免疫动物与感染动物具有重要意义。在FMDV几种非结构蛋白中，3D是最早用于诊断的非结构蛋白，但后来从疫苗免疫动物的体内也检测到3D抗体，说明3D蛋白不能区分感染动物和疫苗免疫动物。Mezencio等[1]证明感染牛和猪体内的非结构蛋白2C抗体减少速度快于3ABC抗体减少速度，而疫苗免疫牛体内有时也能检测到2C的抗体。Macka/2]等人发现所有试验感染的有临床症状的动物，I个月能检测到3ABC抗体，I年后3ABC抗体仍为阳性，而亚临床感染动物，2个月后仅有80%动物能检测到血清阳性，从而得出3ABC抗体水平与临床症状之间正相关的结果。Bergmann等M比较了 3A、3B、2C、3D和3ABC作为诊断抗原，应用间接ELISA试验检测感染牛的敏感性和准确性，结果3ABC效果最好。现在各国学者以达成共识，检测非结构蛋白3ABC或者3AB抗体是确认动物是否感染FMD的最佳方法。在口蹄疫的诊断过程中，人们逐渐认识到ELISA与其他免疫学检测技术相比具有灵敏、特异、廉价、快速、稳定且易于实现自动化操作等优点，因此不仅适用于大量临床标本的检测，也适合血清流行病学调查。ELISA方法分不同的类型，通过间接法包被抗原发展的阻断ELISA或竞争ELISA又较一般的间接ELISA更为敏感与特异；本专利所描述的方法即是采用间接包被抗原的单克隆抗体阻断ELISA方法，属于ELISA方法中较为先进的反应模式。其特点在于，一是采用间接捕获法包被抗原，可以采用单克隆抗体或者单特异性多抗包被，消除了直接包被抗原所产生的非特异性反应，而且可以更好的展示抗原结构，有利于抗原与抗体的特异性结合；二是利用单克隆抗体(McAb)具有高度均质性和高度特异性的特点，以特异性单克隆抗体作为检测抗体，则使得该方法更加特异与敏感，而且可以用于检测牛、羊、猪以及野生反刍类动物等多种易感动物的血清，不同于间接ELISA方法，每种动物血清都要配备相应的酶标抗体。因此，本专利相对间接ELISA方法而言具有在方法学上的 优越性。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种检测口蹄疫病毒非结构蛋白抗体的单克隆抗体阻断ELISA(FMDV NSP B-ELISA)试剂盒及方法。检测口蹄疫病毒非结构蛋白抗体的单克隆抗体阻断ELISA试剂盒，包括酶标反应板、血清稀释液、25倍浓缩洗涤液、底物溶液、100X浓缩酶标检测抗体、终止液、阳性对照血清和阴性对照血清；所述酶标反应板为两块96孔高亲合力酶标板，先包被了 6X组氨酸单克隆抗体或非结构蛋白2C多克隆抗体，并通过单抗或多抗将原核表达的带6X组氨酸标签的口蹄疫病毒3ABC或2C3AB非结构蛋白捕获；所述血清稀释液含10 %马血清，0.25%酪蛋白，I %海藻糖，0.01%硫柳汞的0. OlM磷酸盐(PBS)溶液；所述25倍浓缩洗涤液500mL超纯水中加NaCl 200g、KCl 5g、Na2HPO4 12H2072. 5g、KH2P045g 和 12. 5mL 吐温 20，补超纯水定容至 IOOOmL, pH 为 7. 4，高压
灭菌，室温存放备用；所述底物溶液为单组份3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)底物；所述100X浓缩酶标检测抗体为辣根过氧化物酶标记的口蹄疫病毒3B非结构蛋白单克隆抗体，该单克隆抗体针对3B蛋白中24gpyagpmer32位表位，是3B蛋白中的自然优势抗原表位，不同血清型病毒之间相对保守；通过将HRP标记的3B单克隆抗体稀释于抗体保存液中制备；所述终止液0. 3M H2SO4溶液，利用超纯水稀释分析纯浓硫酸配制而成；所述阳性对照血清采自口蹄疫病毒感染后I 3个月的牛、羊或猪，经检测，非结构蛋白抗体与结构蛋白抗体均为阳性，经无菌处理后加保存剂制备；所述阴性对照血清采自非免疫健康牛、羊和猪，经检测口蹄疫病毒结构蛋白与非结构蛋白抗体均为阴性，经无菌处理后加保存剂保存。检测口蹄疫非结构蛋白抗体的单克隆抗体阻断ELISA方法，包括以下步骤Al、于血清稀释板中，将待测血清按I : 5比例稀释于血清稀释液中，吸取稀释好的样品液加入包被好抗原的酶标板中，每孔加入IOOii L，室温过夜振荡作用18-24h ；A2、次日，用I XPBST洗涤液洗板，反复洗5次，最后一次拍干；A3、将100X浓缩的酶标检测抗体I : 100稀释至血清稀释液中，加入酶标板，每孔加入100iiL，37°C作用I小时；A4、同上洗涤，最后一次拍干，每孔加入IOOii L的底物溶液，37°C作用10_15分钟，再底物作用过程中，要注意掌握显色程度，加终止液之前可以通过测定650nm吸光值来确定显色程度，于OD65tl值接近0. 7时终止反应，检测效果最佳；A5、加终止液，每孔IOOii L，轻振混匀，于10分钟内用酶标仪读450nm吸光值(OD45O)；A6、阻断率计算阻断率(PI) = I-样品OD450/阴性对照OD450 ； A7、试验成立的条件阴性对照OD45tl值-阳性对照OD■值彡0. 8，且阳性对照阻断率应彡60% ；
AS、判定标准牛、羊与猪血清阻断率大于或等于0. 46判为非结构蛋白抗体阳性，血清阻断率小于0. 46判为非结构蛋白抗体阴性。使用组氨酸单克隆抗体或非结构蛋白2C多抗作为捕获抗体，口蹄疫病毒非结构蛋白3B单克隆抗体作为检测抗体，原核表达的口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC或2C3AB作为抗原，建立了一种检测口蹄疫非结构蛋白3ABC或2C3AB抗体的阻断ELISA。使用该方法检测了大量牛、羊及猪的血清，并用公式(I-样品OD值/阴性对照OD值)来计算血清阻断率，最终确定牛、羊与猪血清阻断率大于或者等于0. 46判为阳性，血清阻断率小于0. 46判为阴性。根据此标准检测健康动物血清的特异性> 99. 2%，对感染后3 230天牛血清检测敏感性为90. 4%。本方法与其他同类试剂盒相比有较高的符合率，而且本方法有更高的阳性血清检出率。
图I.不同血清稀释度对应阳性标准血清阻断率对比分析2.不同温度与作用时间下对应阳性血清阻断率对比分析3.牛血清样品阻断率统计4.羊血清样品阻断率统计5.猪血清样品阻断率统计6.三种方法检测两只羊抗体持续时间结果对比图.I 24号与25 48号血清分别对应于40号与54号羊在攻击感染后第3、9、16 418天之间间隔7 30天时间，连续采血24次的检测结果。图7.三种方法检测4头牛抗体持续时间结果对比图.A、B、C与D分别对应于4009、738,4007与4017号牛在攻击感染后第3、7、22、52、88、123、158、175、229天时抗体检测结果。
具体实施例方式以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。I材料与方法I. I 材料碳酸盐缓冲液(Na2C03/NaHC03)及明胶购自SIGMA公司。组氨酸单克隆抗体为购买的商品化试剂(Abmart或Genscript产品)。BCA蛋白浓度测定试剂盒购自Beyotime公司。EZ-Link Plus Activated Peroxidase 试剂盒购自 Thermo 公司。pTriEx_3ABC 重组表达质粒(含组氨酸标签)参考以下文献构建曹轶梅，刘在新，卢曾军，等.口蹄疫病毒非结构蛋白基因3ABC在大肠杆菌中的表达[J],畜牧兽医学报，2004，35(1) :115_118。pET_2C3AB 表达载体参考以下文献构建张小丽，田美娜，卢曾军，等.FMDV非结构蛋白2C主要表位区与3AB基因的组合表达与活性分析.生物工程学报，2009,25(1) :10_15[J]。表达3B单克隆抗体的杂交瘤细胞由本实验室采用常规方法研制并保存。标准对照血清和其他相关试剂均由国家口蹄疫参考实验室购买。Ceditest NS ELISA试剂盒为Prionics公司产品(Schlieren-Zurich, Switzerland),是一种国外研制的阻断 ELISA 试剂盒，3ABC-ELISA 试剂盒为本实验室研制的产品，已经获得新兽药证书并上市销售。I. 2血清样本
来自临床健康的动物血清包括135份牛血清样品，130份羊血清样品，208份猪血清样品，经检测0、A、Asia I型结构蛋白抗体均为阴性。感染动物血清样品包括0型或AsiaI型FMDV攻击感染后3 230天的牛血清样品共94份(其中36份血清来自4头牛于感染后间隔一定时间采样9次)，0型攻击感染后12天至I年的羊血清样本51份(其中48份血清来自2只羊感染后间隔一定时间持续采集的血样)，0型与Asia I型攻击后11天至6个月猪血清样本48份(其中16份血清来自I只感染发病猪间隔一定时间持续采血约6个月)。田间血清样本包括193份田间牛血清样本，来自曾发生疫情地区的临床健康牛群。I. 3非结构蛋白3ABC或2C3AB融合蛋白的表达、纯化及复性；参考以下文献曹轶梅，刘在新，卢曾军，等.口蹄疫病毒非结构蛋白基因3ABC在大肠杆菌中的表达[J].畜牧兽医学报，2004，35 (I) :115-118。曹轶梅，卢曾军，刘在新，等.大肠埃希氏菌表达FMDV 3ABC非结构蛋白的纯化复 性与活性检测[J].中国兽医科技，2003，33 (8) :22-25。I. 4.非结构蛋白3B单克隆抗体的制备、纯化及鉴定；参考以下文献李永亮，田美娜，卢曾军，等.口蹄疫病毒非结构蛋白3B单克隆抗体的制备和鉴定[J].江苏农业学报，2009，25 (2) :296-300。I. 5试剂的处理I. 5. I相关试剂的绝对定量使用BCA蛋白浓度测定试剂盒对3B单克隆抗体及口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC或2C3AB进行蛋白质含量的测定。I. 5. 2单克隆抗体的标记使用EZ-Link Plus Activated Peroxidase试剂盒对口蹄疫病毒非结构蛋白3B单克隆抗体进行辣根过氧化物酶标记，并用ELISA法对比标记前、后单克隆抗体的效价。1.6FMDV非结构蛋白阻断ELISA(FMDV NSP B-ELISA)最佳反应条件的确定I. 6. I方阵滴定法测定3ABC或2C3AB抗原的工作浓度以不同浓度3ABC或2C3AB蛋白抗原(纵向梯度)包被酶标板4°C过夜，加I : 21稀释的标准阴阳性血清与之反应Ih后，加不同倍数稀释的(横向梯度)酶标二抗反应lh，加底物显色，终止，酶标仪读数，确定抗原的最适工作浓度。I. 6. 2方阵滴定法测定单克隆抗体的工作浓度以不同浓度的组氨酸单克隆抗体或2C多抗(纵向梯度)包被酶标板4°C过夜，力口工作浓度的3ABC或2C3AB蛋白反应lh，再加不同浓度的酶标3B单克隆抗体(横向梯度)与之反应lh，加底物显色，终止，酶标仪读板，方阵滴定法确定组氨酸单克隆抗体及3B单克隆抗体的工作浓度。I. 6. 3最佳血清稀释度的确定3ABC或2C3AB抗原、组氨酸单抗及3B单抗的最适工作浓度确定之后，将牛、羊及猪标准阴、阳性血清做I : 5，1 10,1 20,1 40四个稀释度，进行阻断ELISA检测。根据每个稀释度标准阴、阳性血清OD值计算出阳性标准血清阻断率(阻断率=I-样品或标准阳性血清OD值/阴性标准血清OD值)。对获得的阻断率进行比较，取阻断率最大的稀释度作为最佳血清稀释度。I. 6. 4加入血清后反应时间及反应温度的优化
在本试验中发现，加入血清后，不同的反应时间及反应温度的组合对反应最终的阻断率影响很大，因此设定了以下几个反应条件①37°C反应I小时 级37°C反应2小时；③37°C反应3小时；④室温反应12小时；⑤室温反应18小时；⑥室温反应24小时。对各反应条件下的标准阳性血清阻断率进行对比分析，取阻断率达最大时的最短作用时间为最佳反应条件。I. 7判定标准的确定 根据背景清楚的临床健康的非免疫动物血清与感染动物血清样本阻断率的检测结果，来确定本方法的判定标准；基于检测非免疫健康牛阴性血清135份，感染牛血清94份；健康羊阴性血清123份，感染羊血清59份；健康猪阴性血清203份，感染猪血清48份的结果，统计阴、阳性血清阻断率分布区间，确定本阻断ELISA的判定标准。I. 8本方法的特异性和敏感性检测根据确定的判定标准，对来自非免疫健康动物的阴性血清样本与感染动物血清样本的检测结果进行分析，确定本方法对阴性样本检测的特异性和对感染动物血清样本检测的敏感性。I. 9同类试剂盒的符合率对比试验分别用Ceditest NS ELISA试剂盒、FMDV 3ABC-ELISA试剂盒及本方法检测135份健康牛血清，193份田间牛血清样本，94份感染牛血清；130健康羊血清，51份感染羊血清；208份健康猪血清、36份感染猪血清，确定本方法与另外两种方法检测结果之间的符合性。2试验结果2. I非结构蛋白3ABC与2C3AB蛋白鉴定结果3ABC与2C3AB融合蛋白通过包涵体纯化、亲合层析等纯化过程后，经过SDS-PAGE电泳分析，目的蛋白的纯度达到了 90%以上，电泳显示3ABC融合蛋白分子量大小为59ku的蛋白带，2C3AB融合蛋白分子量大小为47. 6ku，与预期大小一致。2. 23B单克隆抗体的鉴定腹水纯化后经过SDS-PAGE电泳分析，有两条大小分别45ku及25ku的蛋白带。经过间接ELISA鉴定，与3B及3ABC蛋白反应，而与2C及3D蛋白不反应，可知其是3B单克隆抗体。2. 3. IBCA蛋白浓度测定试剂盒测得3B单克隆抗体的浓度为0. 932mg/mL, 3ABC融合蛋白的浓度为0. 0507mg/mL。2. 3. 2辣根过氧化物酶标记前的3B单克隆抗体经间接ELISA测定其效价为I 400000，标记后3B单克隆抗体的效价为I 200000。2. 4FMDV NSP B-ELISA最佳反应条件的确定结果2. 4. 13ABC抗原、组氨酸单抗及3B单抗的最适工作浓度通过方阵滴定法确定的3ABC抗原的最适工作浓度为0. 128 U g/mL,组氨酸单抗的最适工作浓度为I U g/mL, 3B单抗的最适工作浓度为0. 117ii g/mL。2. 4. 2血清稀释度的优化结果对各稀释度阳性标准血清阻断率进行对比分析(见图I)，血清I : 5稀释进行检测，获得的阴、阳性血清的阻断率差异最大，能够满足对检测敏感性的要求，而且按此比例稀释血清，血清用量也可以接受，因而确定血清最佳稀释度为I : 5。
2. 4. 3加入血清后反应时间及反应温度的优化结果对不同反应温度与作用时间的阻断率进行对比(见图2)，37°C较室温作用达到最大阻断率的时间缩短，但室温过夜反应18 24小时的敏感性最好，减少作用时间将会降低检测的敏感性。因而，确定最佳反应条件是，室温(20 25°C )作用18 24h。2. 4. 4经过以上反应条件最终制定了 FMDV NSP B-ELISA的操作流程①包被用包被缓冲液(O. 05mol/L pH 9. 6碳酸盐缓冲液)稀释组氨酸单抗或2C多抗至工作浓度，加入酶标板，每孔加100μ L，4°C过夜。将此酶标板用PBST洗涤5遍，拍干。②封闭每孔加封闭液(含I %明胶的PBS溶液)100 μ L，37°C封闭lh，用PBST洗漆3遍,拍干。 ③用组氨酸单克隆抗体捕获3ABC蛋白或用2C多抗捕获2C3AB蛋白用血清稀释液将3ABC或2C3AB蛋白稀释至工作浓度，每孔100 μ L加入酶标板，37°C反应lh，PBST洗涤5遍,拍干。④加待测血清用血清稀释液将阳性、阴性对照血清及待测血清样品I : 5稀释，每孔100 μ L加入酶标板，反应24小时，PBST洗涤5遍，拍干。⑤加酶标3Β单抗用血清稀释液将酶标3Β单抗稀释至最适工作浓度，每孔100 μ L加入酶标板，37°C反应lh, PBST洗涤5遍，拍干。⑥加底物显色姆孔100 μ L加入TMB底物溶液，37°C避光反应10 15min。⑦终止每孔加入O. 3mol/L H2SO4使反应终止。⑧测定OD值用酶标仪测定450nm波长OD值。⑨计算血清样品抗体阻断率。2. 5阳性及阴性判定标准(临界值)的确定根据阴性血清与阳性血清的检测结果(图3、4、5)，确定牛、羊与猪血清非结构蛋白抗体阴、阳性判定标准为阻断率大于或等于O. 46判为阳性，如阻断率小于O. 46判为阴性。非结构蛋白抗体为阳性，说明该动物或者该动物的来源群体曾经感染或存在FMDV感染的情況，应该采取相应的防控措施。2. 6特异性及敏感性判定结果检测非免疫健康动物血清及感染动物血清后，以检测阴性血清数量与总健康血清数的比值计算特异性，以检测阳性血清数与感染动物血清总数的比值计算敏感性。从结果(表I)可以看出本方法的对94份来自感染后3 230天牛检测敏感性为90. 4%，对感染后12天至I年的51份羊血清的检测敏感性达96. 1%，对48份感染后10天 6个月的猪血清的检测敏感性达85. 4%。对来自健康牛、羊与猪血清的特异性在99. 2%以上。表I. FMDVNSP B-ELISA特异性及敏感性判定结果
动物健康动物检测阴性感染动物检测阳性敏感性
特异性(％)
来源血清数血清数血清数血清数(％)
牛 13513499.3%948590.4%
权利要求
1.检测口蹄疫病毒非结构蛋白抗体的单克隆抗体阻断ELISA试剂盒，其特征在于，包括酶标反应板、血清稀释液、25倍浓缩洗涤液、底物溶液、IOOX浓缩酶标检测抗体、终止液、阳性对照血清和阴性对照血清；所述酶标反应板为两块96孔高亲合力酶标板，先包被了 6X组氨酸单克隆抗体或非结构蛋白2C多克隆抗体，并通过单抗或多抗将原核表达的带6 X组氨酸标签的口蹄疫病毒3ABC或2C3AB非结构蛋白捕获； 所述血清稀释液含10%马血清，0.25%酪蛋白，1%海藻糖，0.01%硫柳汞的O. OIM磷酸盐(PBS)溶液； 所述 25 倍浓缩洗涤液500mL 超纯水中加 NaCl 200g、KC15g、Na2HPO4 · 12Η2072· 5g、KH2P045g和12. 5mL吐温20，补超纯水定容至lOOOmL，pH为7. 4，高压灭菌，室温存放备用；所述底物溶液为单组份3，3’，5，5’ -四甲基联苯胺(TMB)底物； 所述100X浓缩酶标检测抗体为辣根过氧化物酶标记的口蹄疫病毒3B非结构蛋白单克隆抗体，该单克隆抗体针对3B蛋白中24gpyagpmer32位表位，是3B蛋白中的自然优势抗原表位，不同血清型病毒之间相对保守；通过将HRP标记的3B单克隆抗体稀释于抗体保存液中制备； 所述终止液0. 3M H2SO4溶液，利用超纯水稀释分析纯浓硫酸配制而成； 所述阳性对照血清采自口蹄疫病毒感染后I 3个月的牛、羊或猪，经检测，非结构蛋白抗体与结构蛋白抗体均为阳性，经无菌处理后加保存剂制备； 所述阴性对照血清采自非免疫健康牛、羊和猪，经检测口蹄疫病毒结构蛋白与非结构蛋白抗体均为阴性，经无菌处理后加保存剂保存。
2.检测口蹄疫非结构蛋白抗体的单克隆抗体阻断ELISA方法，其特征在于，包括以下步骤 Al、于血清稀释板中，将待测血清按I : 5比例稀释于血清稀释液中，吸取稀释好的样品液加入包被好抗原的酶标板中，每孔加入100 μ L，室温过夜振荡作用18-24h ； A2、次日，用I XPBST洗涤液洗板，反复洗5次，最后一次拍干； A3、将100X浓缩的酶标检测抗体I : 100稀释至血清稀释液中，加入酶标板，每孔加入100μ L，37°C作用I小时； A4、同上洗涤，最后一次拍干，每孔加入100 μ L的底物溶液，37°C作用10-15分钟，再底物作用过程中，要注意掌握显色程度，加终止液之前可以通过测定650nm吸光值来确定显色程度，于OD65tl值接近0. 7时终止反应，检测效果最佳； A5、加终止液，每孔100 μ L，轻振混匀，于10分钟内用酶标仪读450nm吸光值(OD45tl)； A6、阻断率计算阻断率(PI) = I-样品OD45tl/阴性对照OD45tl ； A7、试验成立的条件阴性对照OD45tl值-阳性对照OD45tl值彡0. 8，且阳性对照阻断率应≥ 60% ； AS、判定标准牛、羊与猪血清阻断率大于或等于0. 46判为非结构蛋白抗体阳性，血清阻断率小于0. 46判为非结构蛋白抗体阴性。
全文摘要
本发明公开了检测口蹄疫病毒(FMDV)非结构蛋白(NSP)抗体的单克隆抗体阻断ELISA试剂盒及方法(FMD NSP B-ELISA)，包括酶标反应板、血清稀释液、25倍浓缩洗涤液、底物溶液、100×浓缩酶标检测抗体、终止液、阳性对照血清和阴性对照血清；所述酶标反应板为两块96孔高亲合力酶标板，先包被了6×组氨酸单克隆抗体或非结构蛋白2C多克隆抗体，并通过单抗或多抗将原核表达的带6×组氨酸标签的口蹄疫病毒3ABC或2C3AB非结构蛋白捕获；本方法与其他同类试剂盒相比有较高的符合率，而且本方法有更高的阳性血清检出率，适于检测牛、羊与猪等多种易感动物血清。
文档编号G01N33/68GK102662062SQ20121012136
公开日2012年9月12日 申请日期2012年4月17日 优先权日2012年4月17日
发明者付元芳, 刘在新, 包慧芳, 卢曾军, 厍大亮, 孙普, 曹轶梅, 李冬, 李平花, 白兴文, 谢宝霞, 陈应理 申请人:中国农业科学院兰州兽医研究所