专利名称：血管紧张素Ⅰ化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法
技术领域：
本发明涉及免疫分析医学领域，具体的涉及血管紧张素I (Ang I )化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法。
背景技术：
高血压(Hypertension)是一种世界性的常见疾病，世界各地的患病率高达109^20%，并可导致脑血管、心脏、肾脏的病变，是危害人类健康的主要疾病。据卫生部最新数据，我国现有高血压患者2亿多人，随着经济发展，人民生活水平的提高，高血压已日益成为一个重要的公共卫生问题。
血管紧张素I (Angiotensin I ,Ang I )由肾素作用于血管紧张素原形成。肾素能催化血管紧张素原亮氨酸(Leu)与缬氨酸(Val)间的肽键水解产生十肽血管紧张素I。血管紧张素I在正常血浆浓度下没有生物学活性，而是作为血管紧张素II的前体存在。血管紧张素I能刺激肾上腺髓质分泌肾上腺素，它直接收缩血管的作用不明显；血管紧张素II能使全身小动脉收缩而升高血压，此外，还可促进肾上腺皮质分泌醛固酮，醛固酮作用于肾小管，起保钠、保水、排钾作用，从而引起血量增多，血压升高。正常情况下，由于肾素分泌很少，血中血管紧张素也少，对血压调节不起明显作用。但当大失血时，由于动脉血压显著下降使肾血流量减少，血管紧张素生成增多，对防止血压过度下降而使血压回升却起重要作用。肾血管长期痉挛或狭窄的患者，因肾血流量减少，血管紧张素生成增多可导致肾性高血压。此外，血管紧张素可引起血管强烈收缩，但在正常情况下不参与血压调节。当机体处于失血等情况而使循环血量减少时，该激素在血中浓度将显著升高，对保持循环血量和维持动脉血压起一定作用.目前对血管紧张素I目前临床上常用的测定血管紧张素I的方法是放射免疫分析技术(RIA)和酶联免疫分析法(ELISA)，但是这两种方法存在诸多不足，例如RIA存在放射性污染、标记物半衰期短、对操作者具有放射性损伤，且操作繁琐，时间长等缺点；而ELISA灵敏度低，检测范围窄；随着标记免疫技术的迅速发展，各种新的检测方法层出不穷，例如ELISA方法、时间分辨免疫分析法、免疫荧光法、化学发光发等。其中，化学发光免疫分析(CLIA)是将化学发光和酶免疫分析结合在此技术上发展起来的，起步于80年代初，在90年代得到了快速发展和应用，是当今最为敏感的微量免疫测定法，具有灵敏度高(检测极限10_17-10-19)、可测定物质浓度范围宽、试剂有效期长、操作简单快速、稳定性好、安全无环境污染等优点，目前以广泛应用到基础和临床医学的各个领域，成为取代RIA和ELISA的首选技术。
发明内容
本发明要解决的问题是提供血管紧张素I的化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法，解决了灵敏度低，检测范围窄的缺陷。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是一种血管紧张素I化学发光免疫定量检测试剂盒包括Ang I抗体包被板、辣根过氧化物酶标记的Ang I、Ang I校准品、Ang I质控品、发光液A液和B液、20倍浓缩洗液。所述的血管紧张素I抗体包被板的固相载体为96孔或48孔的白色微孔板。所述的血管紧张素I化学发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于，所述的辣根过氧化物酶纯度要求RZ彡3. 0,活性彡250U/mL。所述的发光液A包含0. 7g/L鲁米诺和0. 165g/L对碘酚；发光液B包含0.675g/L过氧化脲。所述的20倍浓缩洗液包括75. 5g/L Tris, 120g/LNaCl,5mL/L Tween-20,lg/LProclin300。一种制备上述试剂盒的方法，其特征在于包括以下步骤DAng I抗体包被板制备将Ang I抗体用pH9. 6碳酸盐缓冲液稀释至l_10ug/mL，在每个微孔板的孔中加IOOuL,于4°C冰箱中放置过夜，用洗涤液洗涤五次之后，用牛血清蛋白溶液对微孔板进行封闭，弃去孔内液体后，将酶标板干燥，密封，即得经Ang I抗体包被的微孔板； 2)辣根过氧化物酶标记Ang I，得Ang I酶结合物；利用高碘酸钠氧化法，将Ang I与辣根过氧化物酶连接在一起，形成经辣根过氧化物酶标记的Ang I ；3) Ang I 校准品；将Ang I抗原用校准品稀释液稀释成系列浓度(浓度分别为0，0. 2，0. 5，2，5，12ng/mL)，于2 8°C保存备用。4)Ang I质控品的配制在正常人血清中加入适量的Ang I纯品，配制低值质控品(QcL)和高值质控品(QcH)，其浓度的平均值分别为0. 46ng/mL和10. 35ng/mL。5)配制发光液A液和B液；A液是含有0. 7g/L鲁米诺和0. 165g/L对碘酚的pH8. 6的5mmol/LTris *HC1缓冲液为液是浓度为0. 675g/L的过氧化脲，用工艺用水配制。6)配制20倍浓缩洗液；20 倍浓缩洗液的配方如下75. 5g/L Tris, 120g/L NaCl，5mL/L Tween-20, lg/LProclin300o7)组装将上述试剂组装成盒，储存于2 8°C ;其中包括发光液A、发光液B、20倍浓缩洗液、Ang I酶结合物各I瓶，Ang I包被板I块，Ang I校准品6瓶、Ang I质控品2瓶。8)对采用该方法制得的试剂盒进行物理检查，并对准确度、剂量-反应曲线的线性、精密度、特异性、灵敏度、质控品的测定值和稳定性进行测定。进一步所述的包被板为包被有Ang I抗体的96孔或48孔白色微孔板。本发明方法制备的试剂盒采用如下具体形式，其包括血管紧张素I抗体包被的96孔或48孔的白色微孔板、辣根过氧化物酶标记的Ang I抗原、不同浓度的Ang I校准品、发光液A液为鲁米诺和对碘酚、发光液B液为过氧化脲、20倍浓缩洗液为配方为75. 5g/LTris,120g/L NaCl,5mL/LTween-20,lg/LProclin300。ProClin300以其广谱活性、优越的兼容性和稳定性及其在使用浓度下的低毒性，ProClin300成为用于诊断试剂的理想高效防腐剂。Proclin300防腐剂可在更长的时间内根除细菌、真菌及酵母，从而延长产品的储存时间。其水溶性确保其可轻易溶入所需试剂中。特别是，ProClin300防腐对大多数的酶或抗体交联反应的功能无影响，所以不会干扰检验指示剂。本专利发明的血管紧张素I定量检测试剂盒，采用目前最为敏感的免疫测定方法——化学发光免疫分析技术，具有以下有点(I)本试剂盒利用化学发光免疫技术测定血浆样本。操作简便，适用于临床常规检测；(2)灵敏度高，分析灵敏度不高于0. 05ng/mL；(3)本产品的特异性良好，与血管紧张素II及血管紧张素1-7的交叉特异性均小于1%;(4)精密度良好，批内精密度不高于15%，批间精密度不高于20% ；(5)稳定性良好，本产品在37°C可存放7天以上，在疒8°C可存放I年；(6)特异性强，反应快速，可在65分钟内判断检测结果，操作简便，安全无环境污染。此外，本发明还具有检测样品的浓度范围宽、试剂有效期长、稳定性好等优点。性能优于国内同类产品，达到了国际先进水平，成本较国外的产品低。
图I是本发明的博奥赛斯化学发光试剂盒测定Ang I与放免试剂盒测定Ang I的测定结果比较图，其中纵坐标为博奥赛斯测得的Ang I值，横坐标为放免试剂盒测定Ang I 值，两种方法相关系数(r) =0. 9477，直线方程y=0. 9772x+0. 041。
具体实施例方式实施例I :制备血管紧张素I化学发光免疫定量检测试剂盒血管紧张素I化学发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括Ang I抗体包被板、辣根过氧化物酶标记的Ang I、Ang I校准品、Ang I质控品、发光液A液和B液、20倍浓缩洗液。通过下述方法制备血管紧张素I化学发光免疫定量检测试剂盒(I)包被JfAng I抗体加到碳酸盐缓冲液(pH=9. 6)中混匀，在每个微孔板的孔中加IOOuL,于4°C冰箱中放置过夜，用洗涤液洗涤五次之后，用牛血清蛋白溶液对微孔板进行封闭，弃去孔内液体后，将酶标板干燥，密封，即得经Ang I抗体包被的微孔板。(2)利用高碘酸钠氧化法，将Ang I与辣根过氧化物酶连接在一起，形成经辣根过氧化物酶标记的Ang I。高碘酸钠氧化法的具体步骤如下a将HRP溶于蒸馏水中，加入等体积的新配制的0. 06M NaI04水溶液，混匀后于冰箱中放置30min，然后与HRP等体积的0. 16M乙二醇，于室温下放置30min。b加入与HRP等量的Ang I，混匀后装入透析袋，对0. 05M pH9. 5的碳酸缓冲液在4°C下透析过夜,然后加入5mg/mL的NaBH4,于冰箱中放置2h。c将上述混合液加入等体积的饱和硫酸铵溶液，于冰箱中放置30min后离心。d得到的沉淀物溶于少许0. 02M pH7. 4磷酸缓冲液中，透析过夜后，加入等体积的甘油于-20°C下贮存备用。3) Ang I 校准品；将Ang I抗原用校准品稀释液稀释成系列浓度(浓度分别为0，0. 2，0. 5，2，5，12ng/mL)，于2 8°C保存备用。4)Ang I质控品的配制在正常人血清中加入适量的Ang I纯品，配制低值质控品(QcL)和高值质控品(QcH)，其浓度的平均值分别为0. 46ng/mL和10. 35ng/mL。 5 )配制发光液A液和B液；A液是含有0. 7g/L鲁米诺和0. 165g/L对碘酚的pH8. 6的5mmol/LTris *HC1缓冲液为液是浓度为0. 675g/L的过氧化脲，用工艺用水配制。6)配制20倍浓缩洗液；20倍浓缩洗液的配制方法如下75. 5g/L Tris, 120g/L NaCl，5mL/LTween_20，lg/LProclin300o7)组装将上述试剂组装成盒，储存于2 8°C ;其中包括发光液A、发光液B、20倍浓缩洗液、Ang I酶结合物各I瓶，Ang I包被板I块，Ang I校准品6瓶、Ang I质控品 2瓶。8)对采用该方法制得的试剂盒进行物理检查，并对准确度、剂量-反应曲线的线性、精密度、特异性、灵敏度、质控品的测定值和稳定性进行测定。说明指标检测准确性试剂盒校准品与企业标准品系列同时进行分析测定，用Log (X) -Logit (Y)数学模型拟合，要求两条剂量-反应曲线不明显偏离平行(t检验，111〈2. 447);以Ang I企业标准品为对照品，用Log(X)-Logit(Y)数学模型拟合，试剂盒校准品的实测值与标示值比值的平均值应在0. 9(Tl. 10范围内。企业标准品的配制将高纯度的Ang I用稀释液(含牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液)稀释为系列梯度，经WHO标准品(NIBSC编号86/536)标定，其浓度分别为0. 2,0. 5、2、5、12ng/mL，并以不含Ang I的稀释液作为零值对照。剂量-反应曲线的线性用Log(X)-Logit(Y)数学模型拟合，剂量_反应曲线在(Tl2ng/mL浓度范围内相关系数r绝对值不低于0. 9900。分析灵敏度分析灵敏度不高于0. 05ng/mL。精密度批内不精密度(CV%)应不高于15.0%;批间不精密度(CV%)应不高于20. 0%。质控品测定值平行测定10孔高值和低值的质控品，用Log(X)-Logit(Y)数学模型拟合，质控品测值应在允许范围内，QcL和QcH的允许范围分别为0. 37 0. 55ng/mL和8.28 12. 42ng/mL。特异性交叉反应应符合下表要求。
权利要求
1.血管紧张素I化学发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括:AngI抗体包被板、辣根过氧化物酶标记的Ang I、Ang I校准品、Ang I质控品、发光液A液和B液、20倍浓缩洗液。
2.根据权利要求I所述的血管紧张素I化学发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于，所述的血管紧张素I抗体包被板为包被有Ang I抗体的96孔或48孔白色微孔板。
3.根据权利要求I所述的血管紧张素I化学发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于，所述的辣根过氧化物酶纯度要求RZ ^ 3. 0，活性> 2 50U/mL。
4.根据权利要求I所述的所述的血管紧张素I化学发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于，所述的Ang I质控品包括低值质控品和高质质控品，其中低值质控品的浓度范围是0.37 0. 55ng/mL,高质质控品的浓度范围是8. 28 12. 42ng/mL。
5.根据权利要求I所述的血管紧张素I化学发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于，所述的发光液A包含0. 7g/L鲁米诺和0. 165g/L对碘酚；发光液B包含0. 675g/L过氧化脲。
6.根据权利要求I所述的血管紧张素I化学发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于，所述的 20 倍浓缩洗液包括 75. 5g/L Tris, 120g/L NaCl, 5mL/LTween-20, lg/LProclin300。
7.一种制备所述权利要求I的试剂盒的方法，其特征在于包括以下步骤 1)Ang I抗体包被板制备 将Ang I抗体用pH9. 6碳酸盐缓冲液稀释至I 10ug/mL，在每个微孔板的孔中加IOOuL,于4°C冰箱中放置过夜，用洗涤液洗涤五次之后，用牛血清蛋白溶液对微孔板进行封闭，弃去孔内液体后，将酶标板干燥，密封，即得经Ang I抗体包被的微孔板； 2)辣根过氧化物酶标记AngI ,得Ang I酶结合物； 利用高碘酸钠氧化法，将Ang I与辣根过氧化物酶连接在一起，形成经辣根过氧化物酶标记的Ang I ； 3)Ang I校准品； 将Ang I用校准品稀释液稀释成系列浓度，浓度分别为0，0. 2，0. 5，2，5，12ng/mL，于2、°C保存备用； 4)AngI质控品的配制在正常人血清中加入适量的Ang I纯品，配制低值质控品和高值质控品，其浓度的平均值分别为0. 46ng/mL和10. 35ng/mL ； 5)配制发光液A液和B液 A液是含有0. 7g/L鲁米诺和0. 165g/L对碘酚的pH8. 6的5mmol/LTriS HCl缓冲液；B液是浓度为0. 675g/L的过氧化脲，用工艺用水配制； 6)配制20倍浓缩洗液 20 倍浓缩洗液的配方如下75. 5g/L Tris, 120g/L NaCl，5mL/L Tween-20, lg/LProclin300 ； 7)组装 将上述试剂组装成盒，储存于2 8°C ; 8)对采用该方法制得的试剂盒进行物理检查，准确度、剂量-反应曲线的线性、精密度、特异性、灵敏度、质控品的测定值和稳定性进行测定。
8.根据权利要求7所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，所述的包被板为包被有Ang I抗体的96孔或48孔白 色微孔板。
全文摘要
本发明公开了一种血管紧张素Ⅰ化学发光免疫定量检测试剂盒，所述试剂盒包括AngⅠ抗体包被板、辣根过氧化物酶标记的AngⅠ、AngⅠ校准品、AngⅠ质控品、发光液A液和B液、20倍浓缩洗液。另外本发明还公开了一种血管紧张素Ⅰ化学发光免疫定量检测试剂盒的制备方法。本发明试剂盒与现有试剂盒相比操作简便，安全无环境污染。此外，本发明还具有检测样品的浓度范围宽、试剂有效期长、稳定性好等优点。
文档编号G01N33/68GK102749456SQ20121021401
公开日2012年10月24日 申请日期2012年6月26日 优先权日2012年6月26日
发明者刘萍, 宋启超, 张影, 范利花 申请人:博奥赛斯(天津)生物科技有限公司