用于检测pcv2的抗体的elisa检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种ELISA检测PCV2（猪圆环病毒2型）的抗体的方法，即利用链霉亲和素-生物素结合ELISA的ABC-ELISA方法检测。本发明还提供一种用于检测PCV2的抗体的ELISA检测试剂盒，包括包被PCV2抗原的检测板、样品稀释液、洗涤液、PCV2阴阳性对照血清、生物素化抗猪IgG、链霉亲和素交联辣根过氧化物酶结合物、显色液和终止液。本发明还提供该试剂盒的使用方法。本发明提供的检测方法是一种特异性强、亲和力大、灵敏度高、检出率提高、结果准确稳定，且可在两小时内完成一次检测的简便方法，适用于大规模推广使用和生产。
【专利说明】用于检测PCV2的抗体的ELISA检测试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及ELISA (酶联免疫吸附)检测试剂盒，具体涉及一种用于检测猪圆环病毒2型(PCV2)的抗体的ELISA检测试剂盒。
【背景技术】
[0002]PCV2病毒属于圆环病毒科，圆环病毒属。该病毒基因组由一个无囊膜环状共价闭合的单股DNA组成。PCVl和PCV2含三个主要阅读框(ORFs)，即0RF1，0RF2和0RF3。ORFl编码与病毒复制相关蛋白，两个病毒的ORFl基因同源性约为86% ；0RF2编码病毒的主要结构蛋白，即病毒衣壳蛋白Cap，两个病毒的0RF2基因同源性约为69%，0RF2是病毒保护性抗原的主要成分，具有很好的免疫原性，且PCVl和PCV2之间不发生血清学交叉反应，因此0RF2是检测PCV2病毒特异性抗体的理想靶抗原；0RF3编码与细胞凋亡相关蛋白，其与病毒在体内的致病性有关。
[0003]目前用于PCV2的检测技术很多，主要有病毒分离培养、免疫组化、间接免疫荧光(IFA)、聚合酶链式反应(PCR)、免疫酶单层试验(IPMA)、原位核酸杂交(ISH)及酶联免疫吸附试验(ELISA)等。其中ELISA以其灵敏性高、易标准化、操作简便、对操作人员和实验条件要求不高等特点，在兽医临床和基层研究以及大规模养殖场都得到广泛使用，适用于PCV2的大规模检测。
[0004]Allan等(1998)利用单抗建立了抗原捕获性ELISA方法来检测PCV2特异性抗体。Nawagitgul等(2000)用昆虫细胞表达了 PCV2 0RF2编码的蛋白并建立了两种改良的间接ELISA方法来检测PCV2抗体。Blanchard等(2003)利用两种针对PCV2的单克隆抗体建立了液相阻断ELISA检测方法。张晓勇等(2006)利用巴斯德毕赤酵母高效表达的PCV20RF2基因编码的蛋白建立了 ELISA方法。林彦星等(2007)应用原核表达的PCV2Cap蛋白建立了检测PCV2抗体的间接ELISA方法。
[0005]上述这些传统的ELISA试验中，反应物与固相的结合常常是有限和不够充分的。在实验过程中由于多次冲洗、长时间温育、温度高时会出现解吸附；由于解吸附作用，使得这类免疫测定法的灵敏度、精密度和准确度均受到影响。
[0006]另外，CN102183650A提供了一种猪圆环病毒2型ELISA抗体检测试剂盒，其中，根据PCV2的基因序列设计Cap特异性引物，以PCR从PCV2基因组中扩增出0RF2基因全系列，将其克隆至杆状病毒穿梭载体PFastBac-Dual中，构建重组质粒，将该重组质粒转化入大肠杆菌DHlOBac，获得重组bacmid，将重组bacmid转染sf9细胞，获得重组杆状病毒。将该重组杆状病毒感染sf9细胞，即可表达Cap蛋白，收集Cap蛋白，通过超速离心和CsCl密度梯度离心，获得纯化的形成病毒样颗粒的Cap蛋白。但该试剂盒相应的酶标板包被抗原蛋白的获得是重组杆状病毒转染sf9细胞，细胞培养成本较高，蛋白表达量也低；另外，其操作步骤中需要两次37°C孵育lh，反应时间长，反应条件要求高。
【发明内容】
[0007]ABC-ELISA (亲和素一生物素复合ELISA)是通过链霉亲和素-生物素捕获系统将抗体、抗原或免疫复合物间接地固定于固相之上的测定方法。链霉亲和素是一种大分子量寡聚蛋白，每个分子含有4个相同的亚基，每个亚基均有一个生物素结合点。链霉亲和素复合物结合常数比经典的抗原-抗体复合物的结合常数高100万倍以上。生物素也叫维生素H，为一小分子物质，能与各种大分子结合，结合后它的其他生物学活性或与其他分子的特异相互作用不发生改变。由于这两种分子间的亲和力，使得它们形成的复合物在强烈的清洗条件下、PH值变化或其他化学变化中都不会发生解离。目前并没有ABC-ELISA用于PCV2检测的相关文献报道，更没有开发出相关检测试剂盒。
[0008]本发明提供一种ELISA检测PCV2的抗体的方法，即利用链霉亲和素_生物素结合ELISA的ABC-ELISA方法检测。
[0009]本发明还提供一种用于检测PCV2的抗体的ELISA检测试剂盒，包括包被PCV2抗原的检测板、样品稀释液、洗涤液、PCV2阴阳性对照血清、生物素化抗猪IgG、链霉亲和素交联辣根过氧化物酶结合物、显色液和终止液。
[0010]其中，所述样品稀释液用于稀释待测样品血清；所述洗涤液优选为浓缩洗涤液，更优选的是10倍浓缩洗涤液；所述生物素化抗猪IgG例如为生物素化羊抗猪IgG或生物素化鼠抗猪IgG,优选为生物素化羊抗猪IgG。
[0011 ] 在本发明的检测试剂盒中，所述样品稀释液和洗涤液可以通用，例如均为一定pH值的磷酸盐缓冲液；但更优选的是，二者的成分并不相同；例如，在本发明中，优选样品稀释液为0.01mol/L、pH值为9.6的磷酸盐缓冲液，洗涤液为PBST洗涤液(含0.05%吐温-20及0.01mol/L、pH7.2的磷酸盐缓冲液);在本发明中，优选显色液为ABTS液(2，2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐)，终止液为1%的NaF溶液。
[0012]在本发明的检测试剂盒中，优选其中还包括一份使用说明书。
[0013]在本发明所述的检 测试剂盒中，优选所述检测板为密封包装的、带有棕色覆盖板以覆盖反应板的检测板。该棕色覆盖板用于孵育过程中覆盖和避光用，避免试剂盒的使用过程中因操作者自行准备的材料的不标准化，易于挥发或污染试剂，进而影响实验结果。
[0014]优选本发明中所述包被检测板中的PCV2抗原为稀释1000倍的抗原，所述PCV2阴阳性对照血清为稀释100倍的血清，所述生物素化抗猪IgG为稀释1000倍的IgG，所述链霉亲和素交联辣根过氧化物酶结合物为稀释2000倍的结合物。
[0015]在本发明的一个【具体实施方式】中，所述试剂盒包括检测板5块，样品稀释液一瓶250ml, 10倍浓缩洗涤液一瓶250ml，PCV2阴阳性对照血清各一瓶15ml，生物素化羊抗猪IgG为50ml，链霉亲和素交联辣根过氧化物酶结合物为50ml，显色液一瓶100ml，终止液一瓶100mlo
[0016]本发明中，上述检测试剂盒的使用方法为:取出检测板后，加待测样品血清和阴阳性对照血清，其中待测样品血清由样品稀释液稀释，均在25~4(TC反应0.2^2h后用洗涤液洗涤I~10次，每次0.2~IOmin ;加生物素化抗猪IgG，25~40°C反应0.2~2h，洗涤；加链霉亲和素交联辣根过氧化物酶结合物，25~4(TC反应0.2~2h，洗洚;加显色液显色f 30min，以终止液终止反应；吸光度法测定P/N值。优选的是，取出检测板后，加待测样品血清和阴阳性对照血清，其中待测样品血清由样品稀释液稀释100倍，均在37°C反应30min后用洗涤液洗涤3次，每次Imin ;加生物素化抗猪IgG，37°C反应30min，同上洗涤；加链霉亲和素交联辣根过氧化物酶结合物，37°C反应30min，同上洗涤；加显色液显色5min，以终止液终止反应；于405nm处测定其吸光度，根据P/N值与2.1的大小来判断阴、阳性结果。
[0017]本发明中利用ABC-ELISA建立猪圆环病毒2型抗体的检测方法，是一种特异性强、亲和力大、灵敏度高、检出率提高、结果准确稳定，且可在两小时内完成一次检测的简便方法，适用于大规模推广使用和生产。
【具体实施方式】
[0018]重组蛋白抗原的制备:
[0019]根据Genbank中PCV2的全基因序列，设计引物，扩增PCV2-SH株(保藏号CGMCCN0.2389)的 0RF2 基因序列，上游引物:5'-CGCGGATCCATGACGTATCCAAGGAGGC-3' ;下游引物:5' -CCGCTCGAGGGGTTTAAGTGGGGGGTCT-3。利用设计的引物PCR扩增0RF2基因片段，琼脂糖凝胶电泳回收PCV2的0RF2基因片段。对回收的目的片段和pBacPAK8质粒进行T4连接酶连接，转化DH5 a大肠杆菌，筛选阳性克隆，提取质粒，阳性质粒即含PCV2Cap蛋白重组转移载体。将重组转移载体转染BmN细胞，获得重组杆状病毒BmNP-Cap。
[0020]将该杆状病毒感染家蚕幼虫，收集感染家蚕的血淋巴液，即可得重组的PCV2Cap蛋白。
[0021]将收集的家蚕幼虫经组织匀浆机匀浆，过滤，离心，收集上清。将清蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，鉴定重组蛋白的可溶性表达。对可溶性的重组蛋白进行Hi S-蛋白质镍亲和层析。离心后的上清经镍柱吸附后，用梯度稀释的咪唑溶液进行洗脱。对纯化后的重组蛋白抗原进行Western blot鉴定，同时进行蛋白定量。
[0022]实施例1:猪圆环2型ABC-ELISA试剂盒的制备方法
[0023]1.检测板的制备:用0.01mol/L的磷酸盐缓冲液(pH9.6)稀释上述纯化的重组蛋白抗原，100 ill每孔包被96孔ELISA反应板，置4°C过夜；拍干孔内包被液；用PBST洗涤液洗板3次，拍干；加封闭液(3%的牛血清白蛋白)200 ill每孔，37°C封闭lh。将包被好的反应板覆盖上棕色覆盖板，密封包装，4 °C保存。
[0024]2.检测板中抗原包被浓度和PCV2阴阳性对照血清最佳稀释倍数的确定:采用方阵法，横排作抗原稀释，分别为1:250，1:500，1:1000，1:2000 ;纵排作对照血清稀释，分别为1:40、1:100、1:200、1:800倍稀释，100 U I/孔，每一稀释度重复一次，取其平均值，进行PCV2抗体的ELISA测定。比较各组阴、阳性血清的OD值和P/N值，选择合适的抗原包被浓度和血清最佳稀释倍数分别为1:1000和1:100。
[0025]3.待检样品血清作用时间的选择:将包被好的检测板恢复至室温后，加入待检血清，37°C分别作用0.5h，lh, 1.5h和2h，进行ELISA测定；比较各组阴、阳性血清的OD值和P/N值，选择合适的血清作用时间为0.5h。
[0026]4.生物素化羊抗猪IgG和链霉亲和素交联辣根过氧化物酶的工作浓度的选择:采用方阵法，待检样品血清按0.5h作用后，将生物素化羊抗猪IgG分别以1: 500，I: 1000，I: 1500和1: 2000稀释，IOOii L/孔。链霉亲和素交联辣根过氧化物酶分别以1: 500，I: 1000，I: 1500和I: 2000稀释，IOOii L/孔。其他步骤同上，进行ELISA测定；比较各组阴、阳性血清的OD值和P/N值，选择合适的酶标体(生物素化羊抗猪IgG)和链霉亲和素交联辣根过氧化物酶的工作浓度分别为1: 1000和1:2000。[0027]5.生物素化羊抗猪IgG作用时间的选择:将生物素化羊抗猪IgG按1: 1000稀释后加入检测板后，37°C分别作用0.5h，lh，l.5h和2h，以上述条件进行ELISA测定，比较各组阴、阳性血清的OD值和P/N值，选择合适的生物素化羊抗猪IgG作用时间为0.5h。[0028]6.链霉亲和素交联辣根过氧化物酶作用时间的选择:将链霉亲和素交联辣根过氧化物酶按1:2000稀释后加入检测板，37°C分别作用0.5h，lh, 1.5h和2h，按上述条件进行ELISA测定，比较各组阴、阳性血清的OD值和P/N值，选择合适的链霉亲和素交联辣根过氧化物酶作用时间为0.5h。
[0029]7.显色液最佳显色时间的选择:酶标抗体按确定好的时间作用、洗涤、加入显色液后，37°C分别作用5、10、15和20min，每孔用50 y L浓度为1%的NaF终止后读数，比较各组阴、阳性血清的OD值和P/N值，选择合适的显色液显色时间为5min。
[0030]8.特异性试验:用纯化好的PCV2重组蛋白抗原在最适包被条件下包被检测板，洗涤封闭后，分别将猪瘟病毒、猪细小病毒、伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性血清作1:100稀释，同时作PCV2阳性和阴性血清对照，100 u L/孔加入反应板，以上述反应条件进行试验，酶标仪405nm处测定其OD值进行结果判定，结果表明，猪瘟病毒、猪细小病毒、伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性血清结果均为阴性。表明该PCV2重组蛋白抗原与猪瘟病毒、猪细小病毒、伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性血清没有交叉反应，说明ELISA方法具有良好的特异性，可以用于PCV2的抗体检测。
[0031]9.ABC-ELISA方法重复性试验:以确定的最适条件进行反应，取10份不同来源(不同的猪)的抗PCV2阳性血清，每样品设置5个重复，PCV2阴性血清为对照，通过间接ELISA测定各样品的P/N值以验证所建立的间接ELISA的可重复性。结果统计分析表明10份不同来源样品的5次重复结果的变异系数均在2~10%之间，这证明了所建立的ELISA用于检测PCV2抗体具有较好的重复性。
[0032]10.临床待测样品血清的检测:用本发明建立的ABC-ELISA方法与猪圆环病毒PCV2型抗体检测试剂盒I (韩国JBT公司，批号:1071901SD13)和抗体检测试剂盒2 (西班牙INGENASA公司，批号:161210)检测洛阳地区不同猪场的血清样本300份，以初步了解目前临床上PCV2的感染情况。结果显示，现今猪群PCV2感染比较普遍，三种试剂盒对血清样本的阳性检出率分别为95%、86%和80%，其中本发明的ABC-ELISA阳性检出率高于其他两种方法；三者都与临床上PCV2感染导致猪群发病的实际情况是相符合的。
[0033]实施例2:猪圆环2型ABC-ELISA试剂盒的组成
[0034]猪圆环2型ELISA试剂盒中包括了密封包装的、带有棕色覆盖板的、包被抗原PCV2的检测板5块，样品稀释液一瓶250ml，10倍浓缩PBST洗涤液一瓶250ml，PCV2阴阳性对照血清各一瓶15ml，生物素化羊抗猪IgG为50ml，链霉亲和素交联辣根过氧化物酶结合物(Serotech, UK)为50ml，显色液(ABTS) —瓶100ml，终止液一瓶100ml，使用说明书一份。
[0035]实施例3:猪圆环2型ABC-ELISA试剂盒的操作步骤
[0036]取出包被好的反应板，加待测样品血清和PCV2阴阳性对照血清，均在37°C反应30min后洗涤3次，每次Imin ;加生物素化羊抗猪IgG，37°C反应30min，同上洗涤；加链霉亲和素-辣根过氧化物酶结合物，37°C反应30min，同上洗涤；加显色液显色5min，终止反应。于405nm处测定其吸光度。结果判定:P/N值=(样品值OD4tl5 —空白孔OD4tl5) / (阴性对照OD405 一空白孔OD4tl5);其值≤2.1者为阳性，< 2.1者为阴性。
【权利要求】
1.一种ELISA检测PCV2的抗体的方法，其特征在于，利用链霉亲和素-生物素结合ELISA的ABC-ELISA方法检测。
2.一种用于检测PCV2的抗体的ELISA检测试剂盒，包括包被PCV2抗原的检测板、样品稀释液、洗涤液、PCV2阴阳性对照血清、生物素化抗猪IgG、链霉亲和素交联辣根过氧化物酶结合物、显色液和终止液。
3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，其中还包括一份试剂盒的使用说明书。
4.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测板为密封包装的、带有棕色覆盖板以覆盖反应板的检测板。
5.根据权利要求2?4中任意一项所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测板中的PCV2抗原为稀释1000倍的抗原，所述PCV2阴阳性对照血清为稀释100倍的血清，所述生物素化抗猪IgG为稀释1000倍的IgG，所述链霉亲和素交联辣根过氧化物酶结合物为稀释2000倍的结合物。
6.根据权利要求2?4中任意一项所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测板5块，样品稀释液一瓶250ml，10倍浓缩洗涤液一瓶250ml，PCV2阴阳性对照血清各一瓶15ml，生物素化羊抗猪IgG为50ml，链霉亲和素交联辣根过氧化物酶结合物为50ml，显色液一瓶100ml,终止液一瓶100ml。
7.根据权利要求2?4中任意一项所述的检测试剂盒，其特征在于，所述样品稀释液为0.0lmol/L.pH值为9.6的磷酸盐缓冲液，洗涤液为PBST洗涤液，显色液为ABTS液，终止液为1%的NaF溶液。
8.根据权利要求2?7中任意一项所述的检测试剂盒的使用方法，其特征在于，取出检测板后，加待测样品血清和阴阳性对照血清，其中待测样品血清由样品稀释液稀释，均在25?40°C反应0.2?2h后用洗涤液洗涤1?10次，每次0.2?IOmin ;加生物素化抗猪IgG，25?40°C反应0.2?2h，洗涤；加链霉亲和素交联辣根过氧化物酶结合物，25?40°C反应0.2?2h，洗洚;加显色液显色f 30min，以终止液终止反应；吸光度法测定P/N值。
9.根据权利要求8所述的使用方法，其特征在于，取出检测板后，加待测样品血清和阴阳性对照血清，其中待测样品血清由样品稀释液稀释100倍，均在37°C反应30min后用洗涤液洗涤3次，每次Imin ;加生物素化抗猪IgG，37°C反应30min，同上洗涤；加链霉亲和素交联辣根过氧化物酶结合物，37°C反应30min，同上洗涤；加显色液显色5min，以终止液终止反应；于405nm处测定其吸光度，根据P/N值与2.1的大小来判断阴、阳性结果。
【文档编号】G01N33/569GK103575883SQ201210251556
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2012年7月19日 优先权日:2012年7月19日
【发明者】张许科, 孙进忠, 白朝勇 申请人:普莱柯生物工程股份有限公司