脂联素含量检测试剂盒及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种脂联素含量检测试剂盒及其制备方法。本发明试剂盒由彼此独立的试剂Ⅰ和试剂Ⅱ组成；其中，试剂Ⅰ的组分包括：生物缓冲剂、表面活性剂、促凝剂、防腐剂、保护剂、螯合剂和水；试剂Ⅱ的组分包括：包被脂联素抗体的胶乳颗粒、生物缓冲剂、螯合剂、表面活性剂、防腐剂、助悬剂、封闭剂、稳定剂、保护剂和水。本发明检测试剂盒的包被脂联素抗体的胶乳颗粒粒径为80-200nm，在此粒径范围内，检测的灵敏度及线性范围要明显优于其它粒径的胶乳颗粒。本发明采用化学交联法制备致敏胶乳颗粒，脂联素抗体与胶乳颗粒结合紧密，不易从胶乳颗粒上脱落，提高了抗体结合的稳定性，最终有效提高了试剂盒的稳定性。
【专利说明】脂联轰含量检测试剂盒及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及脂联素含量检测试剂盒，尤其涉及一种人体内脂联素含量的检测试剂 盒及其制备方法，本发明进一步涉及该检测试剂盒在检测人体内脂联素含量的使用方法， 属于脂联素含量的检测领域。
【背景技术】
[0002] 脂肪组织（adipose tissue)主要由大量聚集成团的脂肪细胞构成，脂联素 (Adiponectin)是脂肪细胞分泌的一种内源性生物活性多肤或蛋白质。正常人血清中脂联 素的浓度范围在3?30 y g/mU占血浆蛋白总量的0. Ol %，不随饮食或昼夜节律而改变，女 性血清中的脂联素含量大于男性。随着对脂联素研究的不断深入，已发现，脂联素在服胖症 患者和II型糖尿病患者血清中的浓度明显低于非服胖者，其浓度的降低导致了膜岛素抵 抗和高膜岛素血症，而脂联素有防止动脉粥样硬化斑块形成的作用，因此，脂联素与服胖症 患者II型糖尿病及冠也病的发生发展密切相关，即脂联素的明显降低预示着II型糖尿病 及冠也病的发生明显增加。测定血中脂联素水平，对该些疾病的诊断和预后有重要意义。
[0003] 目前，脂联素常用的检测方法有；放射免疫法巧IA)、酶联免疫法巧LISA)、胶乳颗 粒增强免疫透射比浊等方法。放射免疫法由于要用到放射性的原料，因此存在严重的环境 污染问题，且操作过程中工作人员必须采用严格的保护措施；酶联免疫法检测的准确度较 高，但是检测过程繁琐，耗时较长，且样本需要批量检测，不适用于及时检测；胶乳免疫比浊 法也是测定人血浆或尿液中脂联素浓度的常用方法，它是基于普通的免疫比浊法，但是它 克服了普通免疫比浊法灵敏度不高的缺陷，同时还克服了 RIA和化ISA方法的缺陷，具有操 作简单、检测时间短、灵敏度高、线性范围宽、无污染、应用范围广等优点。但是现有的脂联 素胶乳免疫比浊法试剂盒存在着线性范围窄、抗干扰能力差、试剂盒稳定性差等方面的问 题，有待改进。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的之一是提供一种脂联素含量的检测试剂盒及其制备方法；
[0005] 本发明的目的之二是提供一种上述脂联素含量的检测试剂盒的制备方法。
[0006] 本发明的上述目的是通过W下技术方案来实现的：
[0007] -种脂联素含量检测试剂盒，由彼此独立的试剂I和试剂II组成；所述的试剂 I的组分包括；生物缓冲剂、表面活性剂、促凝剂、防腐剂、保护剂、馨合剂和水；所述试剂 II的组分包括；包被脂联素抗体的胶乳颗粒、生物缓冲剂、馨合剂、表面活性剂、防腐剂、 助息剂、封闭剂、稳定剂、保护剂和水；其中，所述的包被脂联素抗体的胶乳颗粒的粒径为 80-200nm，优选为 130-170nm，最优选为 140nm。
[0008] 本发明通过大量的试验发现，包被脂联素抗体的胶乳颗粒的粒径的大小对于检测 的灵敏性、准确性及线性范围等有着非常显著的影响，本发明通过大量的试验最终确定，当 包被脂联素抗体的胶乳颗粒的粒径为80-200nm时，相比于其它的粒径的胶乳颗粒，其检测 的灵敏度及线性范围等特性有非常显著的改善。由此，本发明试剂盒中的包被脂联素抗体 的胶乳颗粒的粒径优选为80-200nm，采用此粒径的胶乳颗粒制备的检测试剂盒其灵敏度及 线性范围等特性明显优于其它粒径的包被脂联素抗体的胶乳颗粒。其中，当包被脂联素抗 体的胶乳颗粒的粒径为130-170nm时，检测的灵敏度及线性范围有更好的效果，当包被脂 联素抗体的胶乳颗粒的粒径为HOnm时，检测的灵敏度及线性范围能达到最好的效果。
[0009] 制备包被脂联素抗体的胶乳颗粒可W有多种制备方法，诸如化学交联法、物理吸 附法等；本发明通过实验发现，采用化学交联法制备的致敏胶乳颗，脂联素抗体与胶乳颗粒 结合紧密，不容易从胶乳颗粒上脱落，提高了抗体结合的稳定性，可显著提高检测试剂盒的 稳定性。其中，采用下述方法制备的包被脂联素抗体的胶乳颗粒，试剂盒的稳定性为最好：
[0010] (1)洗涂胶乳；将活化缓冲液和表面活性剂依次加入到粒径为80-200nm的胶乳溶 液中混合均匀，离也弃上清，保留沉淀；
[0011] (2)活化胶乳；将步骤（1)所得的胶乳沉淀用活化缓冲液复溶，超声震荡后加入溶 有1-己基-3- (3-二甲基氨基丙基）碳化二亚胺（邸C)及N-轻基硫代玻巧醜亚胺(硫代 N服）的活化缓冲液，混合均匀，置于恒温摇床上反应；
[0012] (3)浑灭反应；向步骤（2)的反应产物中加入2-琉基己醇浑灭未反应的邸C，混合 均匀，继续置于恒温摇床上反应；
[0013] (4)致敏胶乳；向步骤（3)的反应产物中加入脂联素抗体溶液，震荡混合均匀，置 于摇床上反应；
[0014] (5)封闭胶乳；向步骤（4)的反应产物中加入己醇胺和甘氨酸溶液，置于摇床上反 应后，再加入BSA溶液，置于摇床上反应；
[0015] (6)洗涂胶乳；将步骤（5)的反应产物离也，弃上清，用水重复洗涂沉淀多次，即 得。
[0016] 其中步骤（1)或（2)中所述的活化缓冲液优选为PBS缓冲液；步骤（1)中所述的表 面活性剂优选是吐温-20。
[0017] 步骤（4)中所述的脂联素抗体优选为脂联素单克隆抗体和/或多克隆抗体。
[0018] 为了达到更好的检测效果，每1升试剂I中各组分的用量为；生物缓冲剂5-50g， 馨合剂0. 〇5-4g，防腐剂0. 1-lOg，稳定剂5-60g，表面活性剂l-20mU促凝剂2-30g，余量为 水；
[0019] 每1升试剂II中各组分的用量为；包被脂联素抗体的胶乳颗粒0. l-5g，生物缓 冲剂l-40g，馨合剂0. 5-lOg，防腐剂0. 5-5g，稳定剂30-100g，表面活性剂0. 5-6mU封闭剂 5-30g，助息剂5-50mU保护剂8-70g，余量为水。
[0020] 进一步优选的，每1升试剂I中各组分的用量为；生物缓冲剂10-30g，馨合剂 0. 5-3g，防腐剂0. 5-3g，稳定剂10-30g，表面活性剂3-lOmL，促凝剂5-15g，余量为水；
[0021] 每1升试剂II中各组分的用量为；包被脂联素抗体的胶乳颗粒0. 5-4g，生物缓冲 剂5-20g，馨合剂l-4g，防腐剂0. 5-2g，稳定剂40-80g，表面活性剂0. 8-4mL，封闭剂8-15g， 助息剂7-15血，保护剂10-30g，余量为水。
[0022] 最优选的，每1升试剂I中各组分的用量为；生物缓冲剂12g，馨合剂Ig,防腐剂 Ig,稳定剂19g，表面活性剂5. 5mU促凝剂8g，余量为水；
[0023] 每1升试剂II中各组分的用量为；包被脂联素抗体的胶乳颗粒1. 5g，生物缓冲剂 10. 5g，馨合剂2g，防腐剂Ig，稳定剂59g，表面活性剂I. 5mL，封闭剂lOg，助息剂20mL，保护 剂15g，余量为水。
[0024] 试剂I和试剂II中的生物缓冲剂是为了维持反应体系抑值的稳定性，凡是有一 定缓冲能力的物质，均可作为本试剂盒的生物缓冲剂，在本检测试剂盒中为了达到更好的 检测效果，试剂I中的生物缓冲剂选自H轻甲基氨基甲焼（Tris),试剂II中的生物缓冲剂 选自3- (N-吗晰）丙賴酸（MOP巧。
[00巧]试剂I和试剂II中的馨合剂能够络合检测样本中的金属离子，W减少金属离子 对检测结果的影响；因此，能够络合金属离子的各种馨合剂均能够适用，例如：己二胺四己 酸二轴，氨基H己酸、二亚己基H胺五己酸及其盐等，本发明为了达到更好的检测效果试剂 I和试剂II的馨合剂选用己二胺四己酸二轴（邸TA-2化）。
[0026] 试剂I和试剂II中的防腐剂，是为了防止微生物的繁殖对产品品质及检测结果 带来不良影响，因此，凡是能抑制微生物生长的物质都可W作为本发明试剂I和试剂II的 防腐剂，本发明为了检测试剂盒各项性能更优越选用叠氮化轴作为防腐剂。
[0027] 试剂I和试剂II中的稳定剂主要作用是保护抗体的活性及防止胶乳颗粒的凝 集、下沉，同时还可W增加试剂盒中各组分的稳定性，延长产品的货架期及开瓶后使用时 间。本发明的试剂I和试剂II中的稳定剂选自藏糖与氯化轴两种物质。
[002引试剂I和试剂II中的表面活性剂，主要是促进试剂体系中各组分W及检测样本 中各物质的均匀分散及提高检测的精密度，同时减少样本浊度对测定结果的影响；因此，现 有的具有增溶性质的表面活性剂都可作为试剂I或试剂II中所述的表面活性剂，例如，吐 温20、吐温40、曲拉通X-100、己基苯基聚己二醇等。本发明试剂盒为了达到更好的检测效 果，试剂I中的表面活性剂选自曲拉通100 (TX-IOO)和化esit，试剂II中的表面活性剂选 自曲拉通100和吐温20。
[0029] 试剂I中的促凝剂可W促进抗原抗体反应，有利于胶乳颗粒交联物的形成和增 大，提高检测灵敏度和线性范围。本发明检测试剂盒中的促凝剂优选为PEG-6000。
[0030] 试剂II中的封闭剂是为了与胶乳颗粒中游离的-COOH位点结合，避免游离的駿基 位点对检测结果造成不良影响，凡是能和游离駿基位点结合的物质都能作为本发明试剂盒 中的封闭剂，本发明试剂II中优选牛血清白蛋白作为封闭剂。
[0031] 试剂II中的助息剂是能维持体系中各物质有一个良好的分散状态，防止各组分 凝集下沉导致的检测试剂盒的品质及开瓶稳定性变差等问题出现，常用的助息剂有己二 醇、丙H醇、海藻酸轴、乳糖和麦芽糖等，为了达到很好的分散效果并且不对产品的品质造 成影响，本发明试剂II中的助息剂选自己二醇。
[0032] 试剂II中的保护剂是为了保护抗体的活性，避免抗体失活对试剂盒的品质带来 的不良影响，凡是能保护抗体活性的物质都可W作为本发明的保护剂，本发明试剂II中的 保护剂优选自海藻糖。
[0033] 本发明检测试剂盒中所用到的每种成分或原料均能通过商业途径从生物试剂公 司或医药公司购买得到。
[0034] 本发明的另外一个目的是提供一种制备所述检测脂联素试剂盒的方法，包括： [00巧](1)制备试剂I :将各组分溶解于蒸觸水或双蒸水中，混合均匀，定容；
[0036] (2)制备试剂II ;将各组分溶解于蒸觸水或双蒸水中，混合均匀，定容；
[0037] (3)将试剂I和试剂II单独分装，密封，即得。
[0038] 本发明的又一目的是提供所述脂联素检测试剂盒检测样品中脂联素含量的检测 方法，该方法为两点终点法，包括W下步骤：
[0039] 向3UL待检测样本(校准管W校准品做样品，空白W蒸觸水为样品）中加入 100 U L的试剂I充分混匀，于37C恒温5分钟，再向混合体系中加入25 U L试剂II，混匀， 37C恒温1分钟后，空白管调零，波长570nm，测定各管吸光度Al, 4分钟后测定各管吸光度 A2。计算AA = A2-A1。根据多点校准品浓度和对应吸光度变化值AA，采用多点非线性校 准模式确定工作曲线，样本吸光度变化在工作曲线上相对应的浓度值即为测定浓度。
[0040] 本发明检测试剂盒采用胶乳免疫比浊技术，克服了现有的脂联素检测方法所存在 的缺陷，为脂联素检测提供了一种安全、快捷、简单、准确、无污染的检测手段。本发明检测 试剂盒，其稳定性、灵敏度W及特异性等方面具有优良的品质，且检测操作简便，有利于大 规模推广和应用。
【专利附图】
【附图说明】
[0041] 图1本发明实施例1制备的试剂盒和对比实施例1-2制备的试剂盒的标准曲线。
[0042] 图2本发明实施例3制备的试剂盒和对比实施例5和8制备的试剂盒的标准曲线。
[0043] 图3本发明实施例5制备的试剂盒和对比实施例3-4制备的试剂盒的标准曲线。
[0044] 图4本发明实施例1-5制备的试剂盒的标准曲线。
[0045] 图5本发明试剂盒37°C热稳定性试验结果。
[0046] 图6对比试剂盒37C热稳定性试验结果。
[0047] 图7本发明检测试剂盒与酶联免疫检测试剂盒测试结果的相关性试验结果。
【具体实施方式】
[0048] 预备实施例1包被脂联素抗体的胶乳颗粒的制备
[0049] (1)洗涂胶乳：取1血浓度为10%粒径为80皿的胶乳溶液(购自化IyMicrospheres 公司）于50血离也管中，再向离也管中加入9mL pH7. 4的PBS缓冲液，震荡混合均匀，后再 向离也管中加入5 y L吐温-20,震荡混合均匀，将离也管置于离也机中于25000转/min,离 也30min，弃上清；
[0050] (2)活化胶乳：将（1)步的胶乳沉淀用9mL pH7. 4的PBS缓冲液复溶，超声震荡60 砂，使胶乳颗粒均匀分散。准确称取50mgl-己基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺（邸C) 和SOmgN-轻基硫代玻巧醜亚胺(硫代NHS)，用1血pH7. 4的PBS缓冲液溶解，并将此溶液加入 复溶的胶乳溶液中，震荡混合均匀，并置于恒温摇床上，37度，200转/min,反应比；
[0051] (3)浑灭反应；步骤（2)反应完成后，向反应体系中加入Iy L2-琉基己醇，震荡混 合均匀，并置于摇床上，室温，200转/min,反应IOmin ;
[0052] (4)致敏胶乳：向上述反应体系中加入1. 5mLlmg/mL脂联素多克隆抗体(购自武汉 华美生物工程有限公司），震荡混合均匀，置于水平摇床上，室温，200转/min,反应化；
[0053] (5)封闭胶乳；步骤（4)反应完成后，向体系中加入IOOy LlM己醇胺溶液（P服.0) 和IOOy LlM甘氨酸溶液（P服.0)，震荡混合均匀，并于室温下静置反应lOmin，再向反应体 系中加入100 U L10%浓度的BSA溶液，混合均匀，并于室温下静置反应30min ;
[0054] (6)洗涂胶乳；向上述反应完成的体系中加入水，将体积补充至30血，并置于离也 机中，20000转/min,离也30min，弃上清，并将沉淀用水重复洗涂H次，即得包被脂联素抗 体的胶乳颗粒。
[0055] 预备实施例2包被脂联素抗体的胶乳颗粒的制备
[005引（1)洗涂胶乳：取1血浓度为10%粒径为200nm的胶乳溶液(购自 PolyMicrospheres公司）于50血离也管中，再向离也管中加入9血抑6. 5的PBS缓冲液， 震荡混合均匀，后再向离也管中加入8 y L吐温-20,震荡混合均匀，将离也管置于离也机中 于25000转/min,离也30min,弃上清；
[0057] (2)活化胶乳：将（1)步的胶乳沉淀用9血抑6. 5的PBS缓冲液复溶，超声震荡60 砂，使胶乳颗粒均匀分散。准确称取40m班DC和40mgN服，用ImL P册.5的PBS缓冲液溶解， 并将此溶液加入复溶的胶乳溶液中，震荡混合均匀，并置于恒温摇床上，37度，200转/min, 反应Ih ;
[0058] (3)浑灭反应；步骤（2)反应完成后，向反应体系中加入1 U L2-琉基己醇，震荡混 合均匀，并置于摇床上，室温，200转/min,反应IOmin ;
[0059] (4)致敏胶乳：向上述反应体系中加入1. 5mLlmg/mL脂联素多克隆抗体(购自武汉 华美生物工程有限公司），震荡混合均匀，置于水平摇床上，室温，200转/min,反应化；
[0060] (5)封闭胶乳；步骤（4)反应完成后，向体系中加入IOOy LlM己醇胺溶液（P服.0) 和IOOy LlM甘氨酸溶液（P服.0)，震荡混合均匀，并于室温下静置反应lOmin，再向反应体 系中加入100 U L10%浓度的BSA溶液，混合均匀，并于室温下静置反应30min ;
[0061] (6)洗涂胶乳；向上述反应完成的体系中加入一定量的水，将体积补充至3〇111以并 置于离也机中，20000转/min,离也30min，弃上清，并将沉淀用水重复洗涂H次，即得包被 脂联素抗体的胶乳颗粒。
[0062] 预备实施例3包被脂联素抗体的胶乳颗粒的制备
[0063] (1)洗涂胶乳：取1血浓度为10%粒径为130nm的胶乳溶液(购自 PolyMicrospheres公司）于50血离也管中，再向离也管中加入9血pH7. O的PBS缓冲液， 震荡混合均匀，后再向离也管中加入4y L吐温-20,震荡混合均匀，将离也管置于离也机中 于25000转/min,离也30min,弃上清；
[0064] (2)活化胶乳；将步骤（1)所制备的胶乳沉淀用9mL pH7. O的PBS缓冲液复溶，超 声震荡60砂，使胶乳颗粒均匀分散。准确称取55m班DC和55mgNHS，用ImL pH7. O的PBS 缓冲液溶解，并将此溶液加入复溶的胶乳溶液中，震荡混合均匀，并置于恒温摇床上，37度， 200转/min,反应比；
[0065] (3)浑灭反应；步骤（2)反应完成后，向反应体系中加入2 y L2-琉基己醇，震荡混 合均匀，并置于摇床上，室温，200转/min,反应IOmin ;
[0066] (4 )致敏胶乳：向上述反应体系中加入0. 75血Img/血脂联素多克隆抗体和 0. 75血Img/血脂联素单克隆抗体(购自武汉华美生物工程有限公司），震荡混合均匀，置于 水平摇床上，室温，200转/min,反应化；
[0067] (5)封闭胶乳；步骤（4)反应完成后，向体系中加入IOOy LlM己醇胺溶液（P服.0) 和IOOy LlM甘氨酸溶液（P服.0)，震荡混合均匀，并于室温下静置反应lOmin，再向反应体 系中加入100 U L10%浓度的BSA溶液，混合均匀，并于室温下静置反应30min ;
[0068] (6)洗涂胶乳；向上述反应完成的体系中加入一定量的水，将体积补充至3〇111以并 置于离也机中，20000转/min,离也30min，弃上清，并将沉淀用水重复洗涂H次，即得包被 脂联素抗体的胶乳颗粒。
[0069] 预备实施例4包被脂联素抗体的胶乳颗粒的制备
[0070] (1)洗涂胶乳：取1血浓度为10%粒径为170nm的胶乳溶液(购自 PolyMicrospheres公司）于50血离也管中，再向离也管中加入9血pH7. 0的PBS缓冲液， 震荡混合均匀，后再向离也管中加入5y L吐温-20,震荡混合均匀，将离也管置于离也机中 于25000转/min,离也30min,弃上清；
[0071] (2)活化胶乳；将步骤（1)所制备的胶乳沉淀用9mL pH7. 0的PBS缓冲液复溶，超 声震荡60砂，使胶乳颗粒均匀分散。准确称取50m班DC和SOmgNHS,用ImL pH7. 0的PBS 缓冲液溶解，并将此溶液加入复溶的胶乳溶液中，震荡混合均匀，并置于恒温摇床上，37度， 200转/min,反应比；
[0072] (3)浑灭反应；步骤（2)反应完成后，向反应体系中加入Iy L2-琉基己醇，震荡混 合均匀，并置于摇床上，室温，200转/min,反应IOmin ;
[0073] (4)致敏胶乳：向上述反应体系中加入1. 5mLlmg/mL脂联素单克隆抗体(购自武汉 华美生物工程有限公司），震荡混合均匀，置于水平摇床上，室温，200转/min,反应化；
[0074] (5)封闭胶乳；步骤（4)反应完成后，向体系中加入IOOy LlM己醇胺溶液（P服.0) 和IOOy LlM甘氨酸溶液（P服.0)，震荡混合均匀，并于室温下静置反应lOmin，再向反应体 系中加入100 U L10%浓度的BSA溶液，混合均匀，并于室温下静置反应30min ;
[00巧](6)洗涂胶乳；向上述反应完成的体系中加入一定量的水，将体积补充至3〇111以并 置于离也机中，20000转/min,离也30min，弃上清，并将沉淀用水重复洗涂H次，即得包被 脂联素抗体的胶乳颗粒。
[0076] 预备实施例5包被脂联素抗体的胶乳颗粒的制备
[0077] (1)洗涂胶乳：取ImL浓度为10%粒径为140nm的胶乳溶液(购自 PolyMicrospheres公司）于50血离也管中，再向离也管中加入9血pH7. O的PBS缓冲液， 震荡混合均匀，后再向离也管中加入5y L吐温-20,震荡混合均匀，将离也管置于离也机中 于25000转/min,离也30min,弃上清；
[0078] (2)活化胶乳；将步骤（1)所制备的胶乳沉淀用9mL pH7. O的PBS缓冲液复溶，超 声震荡60砂，使胶乳颗粒均匀分散。准确称取50m班DC和SOmgNHS,用ImL pH7. O的PBS 缓冲液溶解，并将此溶液加入复溶的胶乳溶液中，震荡混合均匀，并置于恒温摇床上，37度， 200转/min,反应比；
[0079] (3)浑灭反应；步骤（2)反应完成后，向反应体系中加入Iy L2-琉基己醇，震荡混 合均匀，并置于摇床上，室温，200转/min,反应IOmin ;
[0080] (4)致敏胶乳：向上述反应体系中加入1. SmLlmg/血脂联素单克隆抗体(购自武汉 华美生物工程有限公司），震荡混合均匀，置于水平摇床上，室温，200转/min,反应化；
[0081] (5)封闭胶乳；步骤（4)反应完成后，向体系中加入IOOy LlM己醇胺溶液（P服.0) 和IOOy LlM甘氨酸溶液（P服.0)，震荡混合均匀，并于室温下静置反应lOmin，再向反应体 系中加入100 U L10%浓度的BSA溶液，混合均匀，并于室温下静置反应30min ;
[0082] (6)洗涂胶乳；向上述反应完成的体系中加入一定量的水，将体积补充至3〇111以并 置于离也机中，20000转/min,离也30min，弃上清，并将沉淀用水重复洗涂H次，即得包被 脂联素抗体的胶乳颗粒。
[0083] 实施例1脂联素胶乳检测试剂盒的制备：
[0084] 1、试剂I的制备：
[0085] 按所述用量取各组分：
【权利要求】
1. 一种脂联素含量检测试剂盒，其特征在于：由彼此独立的试剂I和试剂II组成；所 述试剂I的组分包括：生物缓冲剂、表面活性剂、促凝剂、防腐剂、保护剂、螯合剂和水；所 述试剂II的组分包括：包被脂联素抗体的胶乳颗粒、生物缓冲剂、螯合剂、表面活性剂、防腐 齐U、助悬剂、封闭剂、稳定剂、保护剂和水。
2. 按照权利要求1所述的脂联素含量检测试剂盒，其特征在于：所述包被脂联素抗体 的胶乳颗粒的粒径为80-200nm，优选为130-170nm，最优选的粒径为140nm。
3. 按照权利要求1或2所述的脂联素含量检测试剂盒，其特征在于：所述包被脂联素 抗体的胶乳颗粒采用下述方法制备得到： (1) 洗涤胶乳：将活化缓冲液和表面活性剂依次加入到粒径为80-200nm的胶乳溶液中 混合均匀，离心弃上清，保留沉淀； (2) 活化胶乳：将步骤（1)所得的胶乳沉淀用活化缓冲液复溶，超声震荡后加入溶有 1-乙基-3- (3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺及N-羟基硫代琥珀酰亚胺的活化缓冲液，混 合均匀，置于恒温摇床上反应； (3) 淬灭反应：向步骤（2)的反应产物中加入2-巯基乙醇淬灭未反应的1-乙 基-3- (3-二甲基氨基丙基）碳化二亚胺，混合均匀，继续置于恒温摇床上反应； (4) 致敏胶乳：向步骤（3)的反应产物中加入脂联素抗体溶液，震荡混合均匀，置于摇 床上反应； (5) 封闭胶乳：向步骤（4)的反应产物中加入乙醇胺和甘氨酸溶液，置于摇床上反应 后，再加入BSA溶液，置于摇床上反应； (6) 洗涤胶乳：将步骤（5)的反应产物离心，弃上清，用水重复洗涤沉淀，即得。
4. 按照权利要求3所述的脂联素含量检测试剂盒，其特征在于：步骤（1)或（2)中所述 的活化缓冲液为PBS缓冲液；步骤（1)中所述的表面活性剂是吐温-20 ;步骤（4)中所述的 脂联素抗体为脂联素多克隆抗体和/或单克隆抗体。
5. 按权利要求1所述的脂联素含量检测试剂盒，其特征在于： 试剂I中所述的生物缓冲剂是三羟甲基氨基甲烷，试剂II中所述的生物缓冲剂是 3- (N-吗啉）丙磺酸； 所述的螯合剂是乙二胺四乙酸二钠，氨基三乙酸或二亚乙基三胺五乙酸； 所述的防腐剂是叠氮化钠； 所述的稳定剂是氯化钠和/或蔗糖； 试剂I中所述的表面活性剂是曲拉通100和/或Thesit，试剂II中所述的表面活性剂 是曲拉通100或/和吐温20 ; 所述促凝剂是聚乙二醇6000 ; 所述的封闭剂是牛血清白蛋白； 所述的助悬剂是乙二醇； 所述的保护剂是海藻糖。
6. 按权利要求1所述的脂联素含量检测试剂盒，其特征在于：每1升试剂I中各组分 的用量为：生物缓冲剂5-50g，螯合剂0. 05-4g，防腐剂0. l-10g，稳定剂5-60g，表面活性剂 l-20mL，促凝剂2-30g，余量为水； 每1升试剂II中各组分的用量为：包被脂联素抗体的胶乳颗粒0. l-5g，生物缓冲 剂l_40g，螯合剂0. 5-10g，防腐剂0. 5-5g，稳定剂30-100g，表面活性剂0. 5-6mL，封闭剂 5-30g，助悬剂5-50mL，保护剂8-70g，余量为水。
7. 按权利要求6所述的脂联素含量检测试剂盒，其特征在于：每1升试剂I中各组分 的用量为：生物缓冲剂10_30g，螯合剂0. 5-3g，防腐剂0. 5-3g，稳定剂10-30g，表面活性剂 3-10mL，促凝剂 5-15g ; 每1升试剂II中各组分的用量为：包被脂联素抗体的胶乳颗粒0. 5-4g，生物缓冲剂 5_20g，螯合剂l-4g，防腐剂0· 5-2g，稳定剂40-80g，表面活性剂0· 8-4mL，封闭剂8-15g，助 悬剂7-15mL，保护剂10-30g。
8. 按权利要求7所述的脂联素含量检测试剂盒，其特征在于：每1升试剂I中各组分 的用量为：生物缓冲剂12g，螯合剂lg，防腐剂lg，稳定剂19g，表面活性剂5. 5mL，促凝剂 8g ； 每1升试剂II中各组分的用量为：包被脂联素抗体的胶乳颗粒1. 5g，生物缓冲剂 10. 5g，螯合剂2g，防腐剂lg，稳定剂59g，表面活性剂1. 5mL，封闭剂10g，助悬剂20mL，保护 剂 15g。
9. 按照权利要求1-8任何一项的检测试剂盒，其特征在于：试剂I的pH值的范围为 7. 2-8. 5,试剂II的pH值的范围为6. 5-7. 5。
10. -种制备权利要求1-8任何一项所述检测试剂盒的方法，包括：（1)制备试剂I : 将各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，混合均匀，定容；（2)制备试剂II :将各组分溶解于蒸 馏水或双蒸水中，混合均匀，定容；（3)将试剂I和试剂II单独分装，密封，即得。
【文档编号】G01N33/68GK104237522SQ201210508749
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2012年12月3日 优先权日:2012年12月3日
【发明者】华权高, 许可, 沈鹤霄, 黄爱, 舒芹, 鄢宝, 伍卫姣 申请人:武汉生之源生物科技有限公司