专利名称：一种纳米磁微粒与抗体偶联的方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种纳米磁微粒与抗体偶联的方法。
背景技术：
磁性分离技术是以纳米或微粒级的磁性微粒为载体，利用结合于磁性微粒表面的蛋白质所提供的特异的亲和特性，在加磁场的定向控制下，通过亲和吸附、清洗、解吸操作，可以进一步从复杂的生物体系中分离到目标物分子，具有磁性分离简单方便、亲和吸附高特异性及高敏感性等众多优点。应用于磁性分离技术的磁性载体应具备以下特点:①粒径比较小，比表面积较大，具有较大的吸附容量物理和化学性能稳定，有较高机械强度，使用寿命长；③含有可活化的反应基团，以用于亲和配基的固定化；④粒径均一，能形成单分散体系；⑤悬浮性好，便于反应的有效进行。纳米技术的出现，促进了磁性微粒的应用。纳米磁微粒粒径小，加至反应液中呈悬浮状态，加磁场后可迅速分离。纳米磁微粒还可通过免疫反应与标记有荧光素、化学发光物质、酶等物质连接，建立各种免疫分析方法。纳米磁微粒化学发光免疫诊断试剂综合采用了目前国际上的两大主流免疫分析尖端技术——悬浮纳米磁微粒载体技术、化学发光检测技术，能够准确定量的检测人类血清中的免疫抗原或抗体，可用于过敏、自身免疫、甲状腺功能、肿瘤、性激素、传染病等相关标志物的检测。然而，不同的纳米磁微粒和抗体的偶联方法，会导致偶联上抗体活性的不同，影响试剂的灵敏度。现有技术中，纳米磁微粒和抗体偶联过程中偶联剂和抗体易接触导致抗体活性下降，试剂的灵敏度较低。因此，开发一种纳米磁微粒和抗体的偶联方法，保证抗体偶联到纳米磁微粒上后保持较高的活性，确保试剂的灵敏度，是该平台发展的核心技术之一 O
发明内容
有鉴于此，本发明的目的是提供一种纳米磁微粒与抗体偶联的方法，以解决纳米磁微粒包被抗体后活性下降，试剂灵敏度低的问题，提高纳米磁微粒化学发光免疫诊断试剂的灵敏度。为了达到上述目的，本发明提供一种纳米磁微粒与抗体偶联的方法，其特征在于，具体步骤为:(I)取含有磁微粒的悬浮液，磁分离去上清，用2-吗啉乙磺酸(MES)缓冲液重悬；(2)加入新鲜配制的碳二亚胺(EDC)水溶液，室温混悬；(3)磁分离去上清，加入2-吗啉乙磺酸缓冲液重悬；(4)加入抗体，室温混悬；(5)磁分离，去上清，用磁微粒保存液重悬。较佳地，所述步骤(I)和(2)中，所述的2-吗啉乙磺酸缓冲液为2-吗啉乙磺酸的摩尔含量为0.05mol/L, pH4 6的2-吗啉乙磺酸缓冲液。较佳地，本发明提供一种纳米磁微粒与抗体偶联的方法的具体步骤为:
(I)取含有IOOmg磁微粒的悬浮液，磁分离去上清，用0.05mol/L，pH4 62_吗啉乙磺酸缓冲液IOml重悬；(2)加入0.5 2ml新鲜配制的10mg/ml的碳二亚胺水溶液,室温混悬；(3)磁分离去上清，加入0.05mol/L, pH4 62_吗啉乙磺酸缓冲液IOml重悬；(4)加入4mg的抗体，室温混悬；(5)磁分离,去上清,用磁微粒保存液重悬到lmg/ml。较佳地,所述的磁微粒为表面带有羧基的纳米磁微粒,直径200纳米至3微米。较佳地，所述的抗体为多克隆抗体或者单克隆抗体，纯度为90wt%以上。 较佳地，所述步骤(2 )和(3 )中，室温温悬的时间为I 5h。相较于现有技术，本发明提供的纳米磁微粒与抗体偶联的方法，以两步清洗偶联法将纳米磁微粒与抗体偶联，避免了偶联过程中偶联剂EDC和抗体接触导致抗体活性下降的缺陷，本发明的方法简单，成本低，可用于纳米磁微粒和多种抗体的偶联，解决了纳米磁微粒偶联抗体后，抗体活性下降导致试剂灵敏度低的问题。
图1为本发明实施例一中AFP试剂的灵敏度评价拟合曲线。图2为本发明实施例二中AFP试剂的灵敏度评价拟合曲线。图3为本发明实施例三中AFP试剂的灵敏度评价拟合曲线。
具体实施例方式以甲胎蛋白(AFP)单克隆抗体偶联的纳米磁微粒化学发光测试试剂为例，将AFP单抗和纳米磁微粒采用以下方法偶联。使用市售的Maglia60化学发光免疫分析仪测定AFP试剂的灵敏度。其中，所述的甲胎蛋白单克隆抗体偶联的纳米磁微粒化学发光测试试剂(APF试齐[J)包括:含有荧光素(FITC)标记的AFP抗体的溶液(简称第一试剂)和包被有荧光素抗体的磁微粒的悬浮液(简称磁分离试剂)，以及碱性磷酸酶(ALP)标记的AFP抗体的溶液(简称第二试剂)。所述的AFP试剂通过以下方法制备得到:第一试剂的制备(I)材料与仪器:以磷酸盐缓冲液保存的AFP抗体(纯度超过95wt%，浓度为Img/ml);异硫氰酸荧光素(FITC)，碳酸氢钠等试剂应达到化学纯；G-25凝胶纯化柱采购自GE公司。(2)制备步骤:①用0.2mol/L pH9.0的碳酸盐缓冲液配制0.5mg/ml的FITC溶液；②按照AFP抗体与FITC分子比为1:20的比例在抗体溶液中加入步骤①所配FITC溶液，混合均匀，室温静置12h小时，反应生成AFP抗体-FITC连接物；③将经过步骤②的反应液通过G-25凝胶柱进行分离，除去未反应的FITC，得到含有AFP抗体-FITC连接物(即FITC标记的AFP抗体)的溶液；④将步骤③所得含有AFP抗体-FITC连接物的溶液用含0.5%牛血清白蛋白(BSA)ρΗ8.0的0.lmol/L的Tris缓冲液稀释到AFP抗体-FITC连接物浓度为I μ g/ml, pH为8，即为第一试剂。第二试剂的制备(I)材料与仪器:以磷酸盐缓冲液保存的AFP单克隆抗体(纯度超过95wt%，浓度为lmg/ml，下称AFP抗体溶液)；以磷酸缓冲液保存的碱性磷酸酶(ALP溶液，ALP纯度为约99%，比活性为约1500U/mg，浓度为10mg/ml) ;5mg/ml SMCC (4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯)溶液、10mg/ml2-1T(2-亚氨基硫烷盐酸盐)溶液(SMCC和2-1T固体粉末，用DMF (二甲基甲酰胺)作为溶剂配成上述溶液使用；SMCC和2-1T购自THERMO公司);Tris等化学试剂应达到化学纯；G-25凝胶纯化柱、AKTA-purifierlOO蛋白纯化仪和Supperdex200凝胶纯化柱均为GE公司产品。(2)制备步骤:①取Img AFP抗体溶液，加入10mg/ml的2IT溶液2 4 μ 1，室温静置20min，加入0.lmol/L的甘氨酸溶液10 μ 1，室温静置5min。用G-25凝胶柱除盐，收集活化的抗体，2-8°C
保存备用；②取1.5mg ALP溶液，加入5mg/ml的SMCC溶液20 μ 1，室温静置30min，用G-25凝胶柱除盐，收集活化的ALP抗体，2-8°C保存备用；③将上述活化的AFP抗体与活化的ALP抗体混合，2_8°C条件下静置15h,通过Supperdex200凝胶纯化柱进行纯化，获得含有抗体AFP-ALP连接物(ALP标记的AFP抗体)的溶液，2-8 °C保存备用；④将抗体AFP-ALP连接物的溶液用含0.5%牛血清白蛋白(BSA)pH8.0的0.1mol/L的TRIS缓冲液稀释到I μ g/ml, pH8，即为第二试剂。磁分离试剂的制备分别通过下面实施例一至实施例三的具体工艺进行偶联制备。其中，纳米磁微粒与AFP单克隆抗体分别通过实施例一至实施例三的具体工艺进行偶联。实施例一以甲胎蛋白(AFP)单抗偶联的纳米磁微粒化学发光试剂为例，将AFP单抗和纳米磁微粒用下面的工艺进行偶联。使用Maglia60型发光仪，测定AFP试剂的灵敏度。1、材料与仪器:纳米磁微粒:表面带有羧基的纳米磁微粒,直径200纳米。抗体:AFP单克隆抗体，纯度为98wt%以上。2-吗啉乙磺酸(MES)、碳二亚胺(EDC)和其他试剂应达到化学纯。2、制备步骤:(I)取IOOmg磁微粒的悬浮液，磁分离去上清，用0.05mol/L, pH4MES缓冲液IOml
重悬;(2)加入0.5ml新鲜配制的10mg/ml的EDC水溶液,室温混悬Ih ；(3)磁分离去上清,加入0.05mol/L, pH4MES缓冲液IOml重悬；(4)加入4mg的抗体,室温混悬15h ；(5)磁分离,去上清,用磁微粒保存液重悬到lmg/ml。
3、灵敏度评价检测“O”浓度样本，重复检测20次，计算相对发光强度(RLU)的平均值(M)和标准差(SD)，并计算M+2SD值，根据零浓度校准品和相邻校准品之间的浓度-RLU进行两点回归拟合得出一次方程，将M+2SD值带入上述方程中，求出对应的浓度值，即为最低检测限。本方法的灵敏度远高于行业标准YY/T1162-2009甲胎蛋白(AFP)定量测定试剂(盒)(化学发光免疫分析法)的0.5ng/mL。其中:A点发光值参见表I。表I
权利要求
1.一种纳米磁微粒与抗体偶联的方法，其特征在于，具体步骤为: (1)取含有磁微粒的悬浮液，磁分离，去上清，用2-吗啉乙磺酸缓冲液重悬； (2)加入新鲜配制的碳二亚胺水溶液，室温混悬； (3)再次磁分离，去上清，然后再次加入2-吗啉乙磺酸缓冲液重悬； (4)加入抗体，室温混悬； (5)最后再磁分离，去上清，用磁微粒保存液重悬。
2.根据权利要求1所述的纳米磁微粒与抗体偶联的方法，其特征在于:所述步骤(I)和(2)中，所述的2-吗啉乙磺酸缓冲液为0.05mol/L, pH 4飞的2-吗啉乙磺酸缓冲液。
3.根据权利要求1所述的纳米磁微粒与抗体偶联的方法，其特征在于:具体步骤为: (1)取含有IOOmg磁微粒的悬浮液，磁分离，去上清，用0.05mol/L, pH 4^6 2-吗啉乙磺酸缓冲液IOml重悬； (2)加入0.5 2ml新鲜配制的10mg/ml的碳二亚胺水溶液,室温混悬； (3)再次磁分离，去上清，然后再次加入0.05mol/L, pH 4^6的2-吗啉乙磺酸缓冲液IOml重悬； (4)加入4mg的抗体,室温混悬； (5)最后再磁分离，去上清，用磁微粒保存液重悬到lmg/ml。
4.根据权利要求3所述的纳米磁微粒与抗体偶联的方法，其特征在于:所述步骤(2)和(3)中，室温温悬的时间为l 5h。
5.根据权利要求1至4任意一项所述的纳米磁微粒与抗体偶联的方法，其特征在于:所述的磁微粒为表面带有羧基的纳米磁微粒，直径200纳米至3微米。
6.根据权利要求1至4任意一项所述的纳米磁微粒与抗体偶联的方法，其特征在于:所述的抗体为多克隆抗体或者单克隆抗体，纯度为90wt%以上。
全文摘要
本发明公开一种纳米磁微粒与抗体偶联的方法，具体步骤为(1)取含有磁微粒的悬浮液，磁分离，去上清，用2-吗啉乙磺酸缓冲液重悬；(2)加入新鲜配制的碳二亚胺水溶液，室温混悬；(3)再次磁分离，去上清，然后再次加入2-吗啉乙磺酸缓冲液重悬；(4)加入抗体，室温混悬；(5)最后再磁分离，去上清，用磁微粒保存液重悬。相较于现有技术，采用本发明提供的一种纳米磁微粒与抗体偶联的方法后，抗体偶联在纳米磁微粒上具有较高的活性，试剂的灵敏度有较大的提高。
文档编号G01N33/531GK103149350SQ20131002422
公开日2013年6月12日 申请日期2013年1月23日 优先权日2013年1月23日
发明者于大为, 程晓蕾 申请人:苏州浩欧博生物医药有限公司