专利名称：Ca19-9定量检测试剂盒及其制备方法
技术领域：
本发明涉及生物物质检测分析领域，特别涉及一种CA19-9定量检测试剂盒及其制备方法。
背景技术：
在过去二三十年以来，恶性肿瘤发病率一直呈上升的趋势，每年以3 %至5 %的速度增加，成为人类死亡的重要原因。以2002年为例，当年全世界新发肿瘤是1100万例，死亡病例达到700万，治愈和带瘤生存达2500万。肿瘤的早期诊断和治疗对提高治愈率、改善生活质量和延长生存期至关重要。肿瘤标志物的血清含量水平一般与恶性肿瘤的发生、发展、消退、复发等有良好的相关性，检测这些肿瘤标志物的血清水平，对相关恶性肿瘤的早期诊断、治疗效果和预后转归判断等有重要参考价值，目前已在临床广泛应用。肿瘤标志物是指在肿瘤发生和增殖过程中，由肿瘤细胞本身合成、释放或者由机体对肿瘤细胞反应而产生的 一类物质。1978年由Herberman在美国召开的人类免疫与肿瘤免疫诊断会上提出，次年在英国第7届肿瘤发生生物学和医学会议被确认并开始引用。糖类抗原CA19-9是一种重要的肿瘤标志物之一。CA19-9是一种粘蛋白型的糖类蛋白肿瘤标志物，为细胞膜上的糖脂质，因由鼠单克隆抗体116NS19-9识别而命名。CA19-9是迄今报道的对胰腺癌敏感性最高的标志物。在血清中它以唾液粘蛋白形式存在，分布于正常胎儿胰腺、胆囊、肝、肠和正常成年人胰腺、胆管上皮等处，是存在于血液循环的胃肠道肿瘤相关抗原。大部分胰腺癌患者血清CA19-9水平明显增高。如果以正常参考范围上限(37U/mL)为诊断标准，敏感性和特异性均可达90%以上。CA19-9水平与肿瘤的阶段有关，血清中含量的高低提示手术的难易程度。术前CA19-9水平对预后有一定提示作用，低者预后较好，术后CA19-9水平降至正常者生存期长于未下降者。肿瘤复发时，CA19-9可再度升高，并且发生于影像学诊断之前。因此，CA19-9水平还可用作监测肿瘤的复发。目前发现的用于肿瘤筛查诊断的标志物大都在患者体内含量很低，一般的检测方法不够敏感，难于精确定量测定。因此，敏感、准确、简便、快速的肿瘤标志物检测方法具有十分重要的临床应用价值。
发明内容
本发明实施例提供一种CA19-9定量检测试剂盒及其制备方法，用于解决现有技术中无法实现定量测定微量标志物的技术问题。本发明提供的一种CA19-9定量检测试剂盒，包括:多个浓度不同的CA19-9校准品，CA19-9抗体包被的微孔板，CA19-9抗体的酶标记物，发光底物液和浓缩洗涤液。其中，多个CA19-9 校准品为 6 个，浓度为 0U/mL、5U/mL、30U/mL、100U/mL、200U/mL和400U/mL。包被微孔板的包被浓度为5 μ g/mL。CA19-9抗体的酶标记物为采用戊二醛二步法标记的辣根过氧化物酶标记CA19-9抗体，稀释倍数为1: 2000。发光底物液为鲁米诺发光底物液，鲁米诺发光底物液包括底物A液和底物B液，其中底物A液包括1.8g/L的鲁米诺和0.2g/L的对碘苯酚，底物B液包括0.5g/L的过氧化脲。本发明还提供一种CA19-9定量检测试剂盒的制备方法，包括:制备多个浓度不同的CA19-9校准品；制备CA19-9抗体包被的微孔板；制备CA19-9抗体的酶标记物；制备化学发光底物液；以及制备浓缩洗涤液。其中，制备多个浓度不同的CA19-9校准品包括:通过稀释配制6个校准品，浓度为0U/mL、5U/mL、30U/mL、100U/mL、200U/mL 和 400U/mL。制备CA19-9抗体包被的微孔板包括:将浓度为5 μ g/mLCA19_9抗体加入微孔板，置于4°C冰箱24小时；去除微孔板中的包被液后加入封闭液,置于4°C冰箱封闭24小时；去除微孔板中的封闭液后，置于37°C孵育箱8小时烘干。制备CA19-9抗体的酶标记物包括:通过戊二醛二步法制得辣根过氧化物酶标记的辣根过氧化物酶标记CA19-9抗体，稀释倍数为1: 2000。化学发光底物液为鲁米诺化学发光底物液，鲁米诺化学发光底物液包括底物A液和底物B液；底物A液用0.05M pH8.6的Tris-HCl缓冲液溶解鲁米诺和对碘苯酚制得，其中鲁米诺浓度为1.8g/L，对碘苯酚浓度为0.2g/L ;底物B液用0.05M pH8.6的Tris-HCl缓冲液稀释过氧化脲制得，其中过氧化脲的浓度为0.5g/L。本发明通过采用多个校准品和增强型发光体系，具有灵敏度高，线性范围宽，光信号持续时间长，分析简便快速，结果稳定，误差小，安全性好，使用期长的有益效果。
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明的限定。在附图中:图1为本发明实施例一的CA19-9定量检测试剂盒的制备方法的流程图。图2为本发明的试剂盒与进口试剂盒所测CA19-9浓度的相关性分析图。
具体实施例方式为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合附图对本发明实施例作进一步详细说明。在此，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，但并不作为对本发明的限定。实施例一本实施例提供一种CA19-9定量检测试剂盒，包括:多个浓度不同的CA19-9校准品，CA19-9抗体包被的包被微孔板，CA19-9抗体的酶标记物，发光底物液和浓缩洗涤液。其中，优选CA 19-9 校准品为 6 个，浓度为 0U/mL、5U/mL、30U/mL、100U/mL、200U/mL和400U/mL。包被微孔板的浓度为5 μ g/mL。CA19-9抗体的酶标记物为采用戊二醛二步法标记的辣根过氧化物酶标记CA19-9抗体，稀释倍数为1: 2000。发光底物液为鲁米诺发光底物液，鲁米诺发光底物液包括底物A液和底物B液，其中底物A液包括1.8g/L的鲁米诺和0.2g/L的对碘苯酚，底物B液包括0.5g/L的过氧化脲。浓缩洗涤液为30倍浓缩洗涤液，具体为加入浓度为1.5g/L的吐温-20和浓度为0.05% PC300防腐剂的0.3M ρΗ7.4的磷酸盐缓冲液。该CA19-9定量检测试剂盒的使用步骤包括:
(I)用蒸馏水将30倍浓缩洗涤液稀释30倍，混匀后使用；(2)在包被微孔板上设多个校准品孔和样品孔，优选为6个校准品孔；(3)校准品孔加入校准品，样品孔加入待测样品，每孔加入25UL，然后加入CA 19-9抗体的酶标记物溶液75 μ L，37°C温育60分钟。(4)用洗涤液洗涤微孔板5次，拍干。(5)每孔加入发光底物A液和B液各50 μ I，混匀，室温避光放置5 10分钟。(6)用化学发光分析仪测量各孔的相对发光值(RLU)。(7)以校准品测定结果绘制剂量-反应曲线。(8)从剂量-反应曲线上求出对应样本RLU的CA19-9含量，即为该样品的CA19-9浓度。实施例二如图1所示，图1是本发明实施例提供的一种CA19-9定量测定试剂盒的制备方法流程图，包括:步骤SllO:制备多个浓度不同的CA19-9校准品；步骤S120:制备CA19-9抗体包被的包被微孔板；步骤S130:制备CA 19-9抗体的酶标记物；步骤S140:制备化学发光底物液；步骤S150:制备浓缩洗涤液。对于上述方法，详细说明如下:(一)CA 19-9校准品的配制方法用稀释液配制6管(A、B、C、D、E、F)校准品，稀释液含0.05M pH7.4的PBS，50%小牛血清，2%甘油和0.1 % PC300防腐剂。校准品中CA19-9的浓度分别为A管OU/mL、B管5U/mL、C 管 30U/mL、D 管 100U/mL、E 管 200U/mL 及 F 管 400U/mL。其中 PC300 为防腐剂，其活性成分主要是2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮(MCI)和5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉_3_酮(CMCI)。这两种成分可以抑制细胞的生长，有效地控制体外诊断试剂中微生物的生长，是一种理想的可替代硫汞撒、叠氮化钠和庆大霉素等的生物防腐剂。本实施例通过采用多个校准品，使得检测结果更准确，更可靠。(二)CA 19-9抗体包被微孔板的制备微孔板为96孔的不透明聚苯乙烯微孔板。配制0.05M pH9.6碳酸盐的缓冲液，配制方法是称取2.2克的Na2CO3和1.0克NaHCO3溶于IOOml蒸馏水中，混匀备用。配制0.05M pH7.4PBS封闭液，配置方法是称取0.3克NaH2PO4.2Η20、1.85克KH2PO4.3Η20和1.8克氯化钠溶于200ml蒸馏水中，混匀后加入0.2克牛血清白蛋白和200 μ I PC300，混匀备用。包被步骤具体包括:(I)用缓冲液将CA19-9单抗稀释成包被浓度为5 μ g/mL的包被液，以每孔100 μ I方式将包被液加入微孔板，然后置于4°C冰箱24小时。(2)除去微孔板中的包被液，以每孔150 μ I加入0.05Μ pH7.4PBS封闭液，置于4°C冰箱封闭24小时。
(3)除去封闭液后，置于37°C孵育箱8小时烘干。本申请制备的包被微孔板的产品性能稳定，重复性好。(三)酶标记CA19-9抗体的制备标记用酶是辣根过氧化物酶，CA19-9抗体可以是单克隆抗体或者多克隆抗体。以戊二醛二步法进行辣根过氧化物酶标记为例说明本发明的酶标记CA19-9抗体。标记方法具体包括:(I)称取辣根过氧化物酶25mg溶于0.5毫升1.25%戊二醛溶液中(用
0.1ΜρΗ6.8PBS配制)，于室温静置过夜。(2)次日，将酶与戊二醛反应后的溶液用0.0lM Ph7.4PBS充分透析。(3)将待标记的CA19-9抗体IOmg用生理盐水稀释至5ml，搅拌下逐滴加入以上透析好的酶溶液中。(4)用IM PH9.5碳酸缓冲液0.25ml，继续搅拌3小时。(5)加0.2M赖氨酸0.25ml，混匀后，置室温2小时。(6)在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4°C I小时。(7)离心半小时(3000转/分钟)，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于0.5mL的0.15M PH7.4的PBS中。(8)将上述溶液装入透析袋中，用0.15M PH7.4的PB缓冲盐水透析去除铵离子后，离心30分钟(10，000转/分钟)去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保存。酶标记抗体的最佳使用稀释倍数是用洗涤液作1: 2000稀释。其中，然后加热搅拌溶解后,室温静置过夜后,上清液即为饱和硫酸铵。取该上清液400毫升加20毫升IM的盐酸，再补加380毫升蒸馏水，混匀后即为半饱和硫酸铵。(四)化学发光底物液的制备首先配制0.05M pH8.6的Tris-HCl缓冲液。配置方法是:称取0.61克三羟甲基氨基甲烷溶于100毫升蒸馏水中，并加入105微升浓盐酸，混匀后加入50 μ 1PC300防腐剂，混匀备用。底物液包括底物A液和底物B液。底物A液的配制方法是含1.8g/L鲁米诺和0.2g/L对碘苯酚，用以上配制的0.05M ρΗ8.6的Tris-HCl缓冲液溶解。底物B液:含0.5g/L的过氧化脲，用以上配制的0.05M pH8.6的Tris-HCl缓冲液做稀释液。使用时A液和B液等量混合后使用，每孔加100 μ I。如果发光底物的含量不在合适的范围之内，则发出的光粒子的量不能维持在恒定平台期，会影响前后检测时间差的重复性，即造成批间和批内实验的误差扩大。本发明提供的底物发光的平台期长，灵敏度高、宽的线性动力学范围、光信号持续时间长、分析方法简便快速、结果稳定、误差小、安全性好及使用期长等特点，产品临床性能优异。(五)浓缩洗涤液的配制以IOOml 浓缩洗液为例，称取 0.89 克 NaH2PO4.2Η20 和 5.56 克 KH2PO4.3Η20,加到IOOml水中，加入150 μ I吐温-20和50 μ I PC300，搅匀。使用时，用蒸馏水作30倍稀释。通过精密度测定、稳定性试验和临床试验显示本发明提供的CA19-9定量检测试剂盒在精密度高、稳定性强和临床检测效果优异。(一 )精密度测定
批内精密度测定方法是按实施例一所述使用方法，重复10孔检测I份精密度参考品，测定并计算其变异系数(CV)值。精密度(CV% ) = (SD/X)父100%，要求(^%彡15%。批内精密度测定的发光值检测结果
权利要求
1.一种CA19-9定量检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括: 多个浓度不同的CA19-9校准品，CA 19-9抗体包被的微孔板，CA 19-9抗体的酶标记物，发光底物液和浓缩洗涤液。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于: 所述多个 CA 19-9 校准品为 6 个，浓度为 0U/mL、5U/mL、30U/mL、100U/mL、200U/mL 和400U/mL。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于: 所述包被微孔板的包被浓度为5 μ g/mL。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于: 所述CA19-9抗体的酶标记物为采用戊二醛二步法标记的辣根过氧化物酶标记CA19-9抗体，稀释倍数为1: 2000。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于: 所述发光底物液为鲁米诺发光底物液，所述鲁米诺发光底物液包括底物A液和底物B液，其中所述底物A液包括1.8g/L的鲁米诺和0.2g/L的对碘苯酚，所述底物B液包括0.5g/L的过氧化脲。
6.一种CA19-9定量检测试剂盒的制备方法，其特征在于，该方法包括: 制备多个浓度不同的CA19-9校准品； 制备CA19-9抗体包被的微孔板； 制备CA 19-9抗体的酶标记物； 制备化学发光底物液；以及 制备浓缩洗涤液。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，制备多个浓度不同的CA19-9校准品包括: 通过稀释配制 6 个校准品，浓度为 0U/mL、5U/mL、30U/mL、100U/mL、200U/mL 和 400U/mL。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，制备CA19-9抗体包被的包被微孔板包括: 将浓度为5 μ g/mLCA19-9抗体加入微孔板，置于4°C冰箱24小时； 去除微孔板中的包被液后加入封闭液，置于4°C冰箱封闭24小时； 去除微孔板中的封闭液后，置于37°C孵育箱8小时烘干。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，制备CA19-9抗体的酶标记物包括: 通过戊二醛二步法制得辣根过氧化物酶标记的辣根过氧化物酶标记CA19-9抗体，稀释倍数为1: 2000。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于: 所述化学发光底物液为鲁米诺化学发光底物液，所述鲁米诺化学发光底物液包括底物A液和底物B液； 所述底物A液用0.05M pH8.6的Tris-HCl缓冲液溶解鲁米诺和对碘苯酚制得，其中鲁米诺浓度为1.8g/L，对碘苯酚浓度为0.2g/L ； 所述底物B液用0.05M pH8.6的Tris-HCl缓冲液稀释过氧化脲制得，其中过氧化脲的浓度为0.5g/L。
全文摘要
本发明提供一种CA19-9定量检测试剂盒，包括多个浓度不同的CA19-9校准品，CA19-9抗体包被的微孔板，CA19-9抗体的酶标记物，发光底物液和浓缩洗涤液。本发明的CA19-9定量检测试剂盒具有灵敏度高，线性范围宽，光信号持续时间长，分析简便快速，结果稳定，误差小，安全性好，使用期长等有益效果。
文档编号G01N33/68GK103175970SQ20131004371
公开日2013年6月26日 申请日期2013年2月5日 优先权日2013年2月5日
发明者吴玉水, 戴志文, 蔡祥霞, 谢玉玲 申请人:福建省洪诚生物药业有限公司