一种三层结构的肌酸酐含量检测试剂的制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种三层结构的肌酸酐含量检测试剂的制备方法，包括肌酸酐酶、肌酸酶、肌氨酸氧化酶和辣根过氧化物酶，荧光染料5（6）-羧基-2,7-二氯二氢荧光素二特戊酸酯，包括染料底层、蛋白酶固定层、顶层保护层。本发明所使用的方法具有高度的选择性，作为蛋白质酶，其对反应物具有高度的特异性，肌酸酐酶只能催化肌酸酐的水解反应，对其他的反应底物都没有催化活性，由于检测过程中涉及到三种高度特异性的酶，本方法的选择性更是呈指数增加，试剂盒最后给出的响应是荧光响应，相与某些检测颜色变化的方法相比，荧光响应的固有特性赋予本发明更高的灵敏度以及抗干扰的能力。
【专利说明】—种三层结构的肌酸酐含量检测试剂的制备方法
[0001]本申请是一种肌酸酐含量检测试剂和试剂盒，及试剂盒的制作和使用方法的分案申请，原申请申请日2011年9月20日，原申请号:2011102799693，发明创造名称:一种肌酸酐含量检测试剂和试剂盒，及试剂盒的制作和使用方法。
【技术领域】
[0002]本发明属于肌酸酐检测领域，尤其是一种肌酸酐含量检测试剂和试剂盒，及试剂盒的制作和使用方法。
【背景技术】
[0003]肌酸酐是磷酸肌酸代谢的产物，其化学结构是肌酸通过脱水缩合形成的内酰胺。肌酸酐一般存在于血液中，通过血液循环到达肾脏并被过滤掉。对于肾功能正常的人群来说，血液中的肌酸酐浓度因人因地而异。一般而言，在无大体力负担的情况下，女性的血液中的肌酸酐浓度在45-60 μ M ;男性的血液肌酸酐浓度在60-110 μ M的范围内浮动。当肾功能出现问题时，肾脏过滤清除肌酸酐的能力就会降低，导致血液中肌酸酐的浓度异常升高而尿液中肌酸酐浓度降低，因此通过测量血液和尿液中肌酸酐的浓度，就可以测量肌酸酐清除率甚至肾小球率过滤，这两个参数对于衡量肾功能具有重要的意义，因此，可以快捷的测量血液和尿液中的肌酸酐浓度，对于临床和科研，都具有十分重大的应用前景。
[0004]肌酸酐的测量比较困难。目前常用的方法是质谱法(同位素稀释质谱法)、高效液相色谱法、液相色谱-质谱连用法以及抗体检测(ELISA)，这些方法一般都需要昂贵的仪器，如质谱仪、液相色谱仪或酶标仪等，以及受过系统训练的分析化学操作人员的操作，极大地提高肌酸酐测量的经济成本和时间成本，以及肌酸酐测量在边远地区的应用。
[0005]质谱法通过在样品中人为加入含有某种同位素(如0-18)的肌酸酐并对此样品进行质谱分析。比对质谱结果中0-18的丰度和0-18在自然界中的丰度即可计算出肌酸酐的浓度。人为加入的肌酸酐可以严格控制，作为一种内标准(internal calibration),这种方法可以有效的降低误差。根据最新研究，用质谱法得到的肌酸酐浓度偏低，这将在临床上引起一系列问题，美国FDA也开始考虑新的肌酸酐检测手段。
[0006]液相色谱法是在质谱的基础上使用高效液相色谱对样品进行纯化并用质谱进行检测。质谱法和液相色谱法无法自动化、操作复杂，并且需要分析团队对仪器进行操作和维护，而ELISA法需要使用价格昂贵的酶标仪，虽然其灵敏度极高，但是选择性较差，经常会高估肌酸酐的浓度，导致临床用药的过量或不足。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种选择性高、灵敏度高和使用方便的肌酸酐含量检测试剂和试剂盒，及试剂盒的制作和使用方法。
[0008]本发明的目的是通过以下技术方案实现的:
[0009]一种肌酸酐含量检测试剂，包括肌酸酐酶、肌酸酶、肌氨酸氧化酶和辣根过氧化物酶，荧光染料5 (6)-羧基-2，7- 二氯二氢荧光素二特戊酸酯，肌酸酐在肌酸酐酶的催化下被水解成为肌酸，肌酸在肌酸酶的催化下被水解成肌氨酸，肌氨酸随之在肌氨酸氧化酶的催化下生成甘氨酸以及少量的过氧化氢，在辣根氧化物酶的催化下，过氧化氢催化氧化了 5
(6)-羧基-2，7- 二氯二氢荧光素二特戊酸酯并生成具有荧光响应的产物，通过监测荧光增强的速率以及标准曲线，获得肌酸酐浓度，其中所述肌酸酐酶:肌酸酶:肌氨酸氧化酶:辣根过氧化物酶:荧光染料的重量比为:1:50:60:5。
[0010]而且，包括如下三层结构:
[0011]⑴染料底层:将荧光染料修饰过的纤维素和D4水凝胶混合并搅拌，在一张干净的塑料薄膜上用刮刀涂膜机涂上一层D4水凝胶的薄膜并使之自然风干；
[0012]⑵蛋白酶固定层:在PVA-Sbq (聚丙烯醇-苯基吡啶乙烯络合物)的水溶液中加入10%的牛血清蛋白以及反应所需的肌酸酐酶、肌酸酶、肌氨酸氧化酶和辣根过氧化物酶，搅拌25-40分钟以上，用刮刀涂膜机涂上一层酶的PVA-Sbq溶液，将紫外灯置于膜层的上方30分钟，使苯基吡啶乙烯交联并使膜层变干；
[0013]⑶顶层保护层:最后在上面用刮刀涂膜机涂上一层含有10%炭黑的D6水凝胶，并使膜层自然风干。
[0014]而且，三层结构的具体制备步骤如下:
[0015]⑴将176mg纤维素固定的5 (6)-羧基_2，7_ 二氯二氢突光素二特戍酸酯和2.6g的4%D4水凝胶溶液混合并搅拌均匀，使纤维素粉末在溶液中均匀分散；
[0016]⑵将步骤⑴中所制备的溶液均匀在塑料薄膜上使之形成一层厚度为IOOuM的薄月旲并晚干；
[0017]⑶将30mg肌酸酶、35mg辣根过氧化物酶、0.63mg肌酸酐酶、2.6mg肌氨酸氧化酶、340mg水和1.33g浓度为10%并含有10%牛血清蛋白的PVA-Sbq溶液混合，并在冰上搅拌均匀；
[0018]⑷在步骤⑵中制备的薄膜上涂上步骤⑶中所制备的PVA-Sbq/酶溶液，膜层的厚度为100 μ m,将薄膜置于紫外灯下30分钟；
[0019](5)在步骤⑷中所制备的薄膜上涂上一层含有6%炭黑和1.8%D6的溶液并自然风干。
[0020]一种肌酸酐含量检测试剂盒，包括上述的检测试剂。
[0021]一种肌酸酐含量检测试剂盒的制备方法，其特征在于:步骤如下:
[0022]⑴将176mg纤维素固定的5 (6)-羧基_2，7_ 二氯二氢突光素二特戍酸酯和2.6g的4%D4水凝胶溶液混合并搅拌均匀，使纤维素粉末在溶液中均匀分散；
[0023]⑵将步骤⑴中所制备的溶液均匀在塑料薄膜上使之形成一层厚度为IOOuM的薄月旲并晚干；
[0024]⑶将30mg肌酸酶、35mg辣根过氧化物酶、0.63mg肌酸酐酶、2.6mg肌氨酸氧化酶、340mg水和1.33g浓度为10%并含有10%牛血清蛋白的PVA-Sbq溶液混合，并在冰上搅拌均匀；
[0025]⑷在步骤⑵中制备的薄膜上涂上步骤⑶中所制备的PVA-Sbq/酶溶液，膜层的厚度为100 μ m,将薄膜置于紫外灯下30分钟；
[0026](5)在步骤⑷中所制备的薄膜上涂上一层含有6%炭黑和1.8%D6的溶液并自然风干。
[0027]一种试剂盒的使用方法，其特征在于:在含有IOOmM HEPES, 150mM氯化钠，5mM氯化钾，1.3mM氯化钙的缓冲液中，pH7.3，加入不同浓度肌酸酐，用毛细管两驱150 μ L的样品溶液并安插在试剂盒上并用荧光仪开始测量。
[0028]本发明的优点和有益效果为:
[0029]1、本发明所使用的方法具有高度的选择性，作为蛋白质酶，其对反应物具有高度的特异性，肌酸酐酶只能催化肌酸酐的水解反应，对其他的反应底物都没有催化活性，由于检测过程中涉及到三种高度特异性的酶，本方法的选择性更是呈指数增加，试剂盒最后给出的响应是荧光响应，相与某些检测颜色变化的方法相比，荧光响应的固有特性赋予本发明更高的灵敏度以及抗干扰的能力。
[0030]2、本申请提供了一种新型的用于检测血液和尿液中肌酸酐含量的试剂盒，本试剂盒将对肌酸酐具有特异性的酶以及对过氧化物敏感的荧光染料固定在试剂盒上，并将酶催化的反应转化为荧光信号并得以检测，本试剂盒可以检测出ΙΟμΜ以上的肌酸酐，符合临床上的使用要求。
[0031]3、本发明所使用的酶共有四种:肌酸酐酶、肌酸酶、肌氨酸氧化酶和辣根过氧化物酶，样品中的肌酸酐通过前三种酶被降解为甘氨酸，同时生成少量的过氧化氢，在辣根过氧化物酶的催化下，过氧化氢可以氧化一种原本没有荧光的分子，反应产物是荧光素的衍生物，具有较强的荧光响应，通过检测荧光的增强速率，可以检测到过氧化氢的生成速率，并间接计算出肌酸酐的浓度。
[0032]4、本发明对现有的肌酸酐检测技术以及本申请所阐述的试剂盒进行了比较，作为肾功能的重要参数，肌酸酐清除率和肾小球率过滤的肌酸需要多次进行血液和尿液的肌酸酐测量，因此，本申请所提及的 肌酸酐试剂盒所具有的使用简单、价格低廉且具有高度选择性的特点将具有十分重大的意义。
[0033]表1现有肌酸酐检测方法的比较
【权利要求】
1.一种三层结构的肌酸酐含量检测试剂的制备方法，其特征在于: 检测试剂包括:肌酸酐酶、肌酸酶、肌氨酸氧化酶和辣根过氧化物酶，荧光染料5(6)-羧基-2，7- 二氯二氢荧光素二特戊酸酯，肌酸酐在肌酸酐酶的催化下被水解成为肌酸，肌酸在肌酸酶的催化下被水解成肌氨酸，肌氨酸随之在肌氨酸氧化酶的催化下生成甘氨酸以及少量的过氧化氢，在辣根氧化物酶的催化下，过氧化氢催化氧化了 5 (6)-羧基-2，7- 二氯二氢荧光素二特戊酸酯并生成具有荧光响应的产物，通过监测荧光增强的速率以及标准曲线，获得肌酸酐浓度，其中所述肌酸酐酶:肌酸酶:肌氨酸氧化酶:辣根过氧化物酶:荧光染料的重量比为:1:50:60:5 ； 三层结构为: ⑴染料底层:将荧光染料修饰过的纤维素和D4水凝胶混合并搅拌，在一张干净的塑料薄膜上用刮刀涂膜机涂上一层D4水凝胶的薄膜并使之自然风干； ⑵蛋白酶固定层:在PVA-Sbq (聚丙烯醇-苯基吡啶乙烯络合物)的水溶液中加入10%的牛血清蛋白以及反应所需的肌酸酐酶、肌酸酶、肌氨酸氧化酶和辣根过氧化物酶，搅拌25-40分钟以上，用刮刀涂膜机涂上一层酶的PVA-Sbq溶液，将紫外灯置于膜层的上方30分钟，使苯基吡啶乙烯交联并使膜层变干； ⑶顶层保护层:最后在上面用刮刀涂膜机涂上一层含有10%炭黑的D6水凝胶，并使膜层自然风干； 三层结构的具体制备步骤如下: ⑴将176mg纤维素固定的5 (6)-羧基-2，7- 二氯二氢突光素二特戍酸酯和2.6g的4%D4水凝胶溶液混合并搅拌均匀，使纤维素粉末在溶液中均匀分散； ⑵将步骤⑴中所制备的溶液均匀在塑料薄膜上使之形成一层厚度为IOOuM的薄膜并晾干； ⑶将30mg肌酸酶、35mg辣根过氧化物酶、0.63mg肌酸酐酶、2.6mg肌氨酸氧化酶、340mg水和1.33g浓度为10%并含有10%牛血清蛋白的PVA-Sbq溶液混合，并在冰上搅拌均匀；⑷在步骤⑵中制备的薄膜上涂上步骤⑶中所制备的PVA-Sbq/酶溶液，膜层的厚度为100 μ m,将薄膜置于紫外灯下30分钟； (5)在步骤⑷中所制备的薄膜上涂上一层含有6%炭黑和1.8%D6的溶液并自然风干。
2.一种肌酸酐含量检测试剂盒，其特征在于:包括权利要求1所述制备的三层结构的肌酸酐含量检测试剂。
【文档编号】G01N33/70GK103472239SQ201310363461
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2011年9月20日 优先权日:2011年9月20日
【发明者】徐维琛, 朱进清, 高玉兰, 程志敬 申请人:天津希恩思生化科技有限公司