一种基于核酸适体的生物传感器、制备方法及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于核酸适体的生物传感器、制备方法及应用，属于生物化学【技术领域】。该生物传感器在金膜上自组装有十八硫醇，十八硫醇通过分子间作用力结合有羧基功能化氧化石墨烯，羧基功能化氧化石墨烯经活化处理使羧基转化为活化酯基基团，再通过活化酯基基团与核酸适体分子上的氨基酸形成酰胺键使核酸适体固定在羧基功能化氧化石墨烯表面；具有良好的电化学活性，且能较好的固定核酸适体，可用于多种目标蛋白的检测，能用于生物医学、食品安全和环境监测等领域。该生物传感器的制备方法简单、易操作，其中采用NaOH和ClCH2COONa将氧化石墨烯上的羟基、环氧基转化为羧基，COOH功能团含量高，具有良好的电化学活性，且能较好的固定核酸适体。
【专利说明】—种基于核酸适体的生物传感器、制备方法及应用
【技术领域】
[0001]本发明具体涉及一种基于核酸适体的生物传感器，以及该生物传感器的制备方法及应用，属于生物化学【技术领域】。
【背景技术】
[0002]氧化石墨烯作为准二维层状结构，表面包含一系列氧功能基团，层间含有大量的羟基和羧基活性基团。氧化石墨烯和石墨烯有相似的优点，比如高导电率、高电子迁移率、高比表面积和高透明度等。氧化石墨烯实用性较强，能快速通过化学法进行功能化，并且有较高的生物相容性。因为氧化石墨烯片表面带有大量亲水性酸性官能团，具有良好的润湿性能和表面活性，从而使具能够在纯水中分散而形成稳定的胶状悬浮液。研究发现氧化石墨烯与单链DNA中的碱基之间通过疏水作用和J1-Ji共轭作用结合。除了共价连接外，氧化石墨烯同样可以通过非共价键的方式(通过共轭、阳离子或范德华力作用)与未被氧化的或以氢键连接的Sp2网络形成连接。研究人员报道了一种利用DNA或蛋白质与氧化石墨烯片层之间的非共价键连接制备的DNA传感器，他们证明了这种材料含有一个对DNA或蛋白质具有感应性和选择性的平台。因此，氧化石墨烯是很有潜力的传感材料。
[0003]核酸适体生物传感器可以通过多种信号的改变来进行检测，这些信号包括光学信号、电化学信号和压电信号等。
[0004]光学信号包括荧光、磷光、化学发光等多种形式。光学核酸适体传感器有灵敏度高，检测下限低等优势，又由于光学染料的获得比较容易，其应用非常广泛。以荧光检测为例，利用荧光淬灭作用，可以设计出灵敏的核酸适体传感器。比如有荧光标记的核酸适体吸附在石墨烯表面时，石墨烯的淬灭作用使荧光淬灭。当核酸适体与目标检测物结合后，脱离石墨稀表面，发出突光(Chang HX, Tang LH, Wang Y, etal.Graphene fluorescenceresonance energy transfer aptasensor for the thrombin detection[J].Anal.Chem.2010,82(6):2341_2346)。Li等用核酸适体先和一个荧光基团标记的核酸链杂交，此时，利用碱基自身的淬灭作用，使荧光淬灭，当核酸适体与目标物结合后，标记了荧光基团的核酸链被置换下来，发出突光(Li N，Ho C M.Aptamer-based optical probes withseparated molecular recognition and signal transduction modules[J].J.Am.Chem.Soc.2008, 130(8):2380_2381)。通过检测荧光的方法来检测三磷酸腺苷(ATP)和凝血酶，取得了很好的结果。但是，光学核酸适体传感器也存在荧光寿命短、容易发生光漂白和易受干扰等不足之处。
[0005]电化学信号的测量方法灵活多样，其设备具有低能耗、微型化、操作简单等多种优点。电化学核酸适体传感器可以检测阻抗、电压、电流等多种信号的变化。电极表面的核酸适体与目标检测物结合，会使电极表面的电化学性质发生改变，而且通过在生物活性分子上修饰一些特定的酶，如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酯酶、葡萄糖氧化酶等，可以催化其相应底物的反应以增强电信号。此外将酶修饰核酸适体和其他放大技术相结合，可以大幅度提高核酸适体传感器的检测灵敏度。Li等采用交流阻抗技术，结合纳米金的放大作用，高灵敏地检测了固定在金电极表面的凝血酶的含量(Li B，Wang Y，Wei H，et al.Amplifiedelectrochemical aptasensor taking AuNPs based sandwich sensing platform as amodel[J].Biosensors and Bioelectronics, 2008, 23(7):965_970)o
[0006]压电信号检测物质的质量变化，通过晶体的压电效应将其转化为电信号。压电核酸适体传感器经常用于非标记型核酸适体的检测过程，通过检测过程中的质量变化，可以定量检测目标物。这种传感器最常用的检测仪器是石英电子微天平(QCM)，其测量机理是基于石英晶体的固有频率在其表面吸附刚性物质后发生改变，频率的变化量与吸附物质的质量之间呈线性关系。其测量在液相中进行，可以在线连续检测核酸适体与目标物之间的结合过程，并对目标物进行定量检测。将电化学与QCM技术相结合的电化学石英电子微天平(EQCM)，则可以实现电极表面纳克级质量变化的检测，同时获得更加丰富的信息，如溶液的密度和粘度等(Neuburger G G.Detection of ambient hydrogen chloride witha zinc-coated piezoelectric crystal resonator operating in a frequency-tunediferential model[J].Anal.Chem.1989, 61 (14):1559_1563)。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是提供一种基于核酸适体的生物传感器。
[0008]同时，本发明还提供一种基于核酸适体的生物传感器的制备方法。
[0009]最后，本发明提供一种基于核酸适体的生物传感器在检测凝血酶方面的应用。
[0010]为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是:
[0011]一种基于核酸适体的生物传感器，在金膜上自组装有十八硫醇，十八硫醇通过分子间作用力结合有羧基功能化氧化石墨烯，羧基功能化氧化石墨烯经活化处理使羧基转化为活化酯基基团，再通过活化酯基基团与核酸适体分子上的氨基形成酰胺键使核酸适体固定在羧基功能化氧化石墨烯表面。
[0012]所述的羧基功能化氧化石墨烯的制备方法为:将NaOH和ClCH2COONa加入到氧化石墨烯悬浮液中，NaOH、ClCH2COONa与氧化石墨烯的质量比为(30?70): (30?70): (0.5?5)，分散；分散后将悬浮液的pH值调节至中性，用水反复离心洗涤3?5次；将洗涤后的悬浮液用水透析36?60h，烘干，研磨即得。
[0013]所述的分散为水浴超声2h。
[0014]所述的烘干温度为60°C，时间为24h。
[0015]一种基于核酸适体的生物传感器的制备方法，包括以下步骤:
[0016](I)十八硫醇在金膜上自组装:将清洗后的金膜置于IOml0.lmg/ml十八硫醇的乙醇溶液中，2h后取出，用水清洗，再用氮气吹干；
[0017](2)羧基功能化氧化石墨烯与十八硫醇相结合:将自组装有十八硫醇的金膜置于IOml0.lmg/ml羧基功能化氧化石墨烯的悬浮液中，2?2.5h后取出，用水清洗,再用氮气吹干;
[0018](3)核酸适体在羧基功能化氧化石墨烯上的固定:将自组装有羧基功能化氧化石墨烯的金膜活化后置于I?IOOOnM核酸适体溶液中，12?24h取出，清洗，再用氮气吹干，即可。
[0019]所述步骤(I)中金膜清洗的方法为:取浓硫酸和30%H202按照体积比为3: (5?8)配制混合液；用混合液浸泡金膜20~60s，再用水清洗；重复浸泡、清洗操作3~4次，用氮气吹干，即可。
[0020]所述步骤⑵中羧基功能化氧化石墨烯的制备方法为:将NaOH和ClCH2COONa加入到氧化石墨烯悬浮液中，NaOH, ClCH2COONa与氧化石墨烯的质量比为(30~70):(30~70):(0.5~5)，分散；分散后将悬浮液的pH值调节至中性，用水反复离心洗涤3~5次；将洗涤后的悬浮液用水透析36~60h，烘干，研磨即得。
[0021]所述的分散为水浴超声2h。
[0022]所述的烘干温度为60°C，时间为24h。
[0023]所述步骤(3)中核酸适体溶液的制备方法为:所述步骤(3)中核酸适体溶液的制备方法为:将核酸适体加入电解质溶液中配制IOOnM核酸适体溶液，即可。抑或将IOD的核酸适体加入到电解质溶液中配成0.01mM核酸适体溶液，再将浓度稀释至IOOnM即可。
[0024]所述电解质溶液的制备方法为:每100ml pH值为7.4的PBS缓冲液中加入
1.1688gNaCl、6.585g K3Fe(CN)6 和 8.4478g K4Fe(CN)6 ? 3H20，混匀即可。
[0025]所述pH值为7.4的PBS缓冲液的制备方法为:每200ml水中加入
4.6548gNa2HP04 ? 12H20、0.4g KH2PO4'16g NaCl 和 0.4g KC1，混匀即可。
[0026]所述步骤(3)中自组装有羧基 功能化氧化石墨烯的金膜的活化方法为:以pH值为7.4的PBS缓冲液为溶剂，分别配制摩尔浓度为0.2M的1-(3- 二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺溶液及摩尔浓度为0.SM的N-羟基丁二酰亚胺溶液，同体积混合得混合液，将自组装有羧基功能化氧化石墨烯的金膜置于混合液中，静置I~1.5h。该方法即可使羧基功能化氧化石墨烯的羧基活化为酯基，使氨基改性的核酸适体中的氨基与之反应生成酰胺键，从而使核酸适体固定其表面上。
[0027]所述步骤(3)中的核酸适体为凝血酶核酸适体、免疫球蛋白E核酸适体或抗腺苷核酸适体，具体如下所述:
[0028]凝血酶核酸适体(35mer):5 ' -NH2-TCTCT CAGTC CGTGG TAGGG CAGGT TGGGGTGACT-3'；
[0029]免疫球蛋白E 核酸适体(45mer):5' -NH2-GCG CGG GGC ACG TTT ATC CGT CCCTCC TAG TGG CGT GCC CCG CGC-3'；
[0030]抗腺苷核酸适体(42mer):5' -NH2-GTG CTT GGG GGA GTA TTG CGG AGG MA GCGGCC CTG CTG AAG-3'。
[0031]上述核酸适体均为市售商品，如郑州创生生物工程有限公司均有售。
[0032]所述步骤(3)中清洗采用的溶液为去离子水。
[0033]一种基于核酸适体的生物传感器在检测凝血酶方面的应用，包括如下步骤:(I)在盛有生物传感器的石英晶体微天平流通池中通入牛血清蛋白溶液，以消除体系的非特异性吸附，吸附达到平衡后，通入PH值为7.4的PBS缓冲液进行冲洗；⑵再通入凝血酶溶液，待吸附达到平衡后，通入PH值为7.4的PBS缓进行冲洗，记录石英晶体振荡频率变化，计算即得凝血酶的吸附质量。
[0034]石英晶体微天平(quartz crystal microbalance,QCM)是一种可检测纳克级质量变化的超高灵敏仪器，测定的基本原理是逆电压效应和著名的Sauerbrey方程，如下式(I)所示:[0035]AF=-[2f02/(u q * P q)1/2A] Am(I)
[0036]式中:A F:QCM振荡器频率的变化；
[0037]f0:QCM振荡器在没有任何物质吸附时的起始频率，为8.0 X IO6Hz ；
[0038]A m:吸附的质量变化；
[0039]A =QCM石英晶体片的面积，为0.196cm2。
[0040]因此，-1Hz的频率变化相当于1.34ng的质量变化值。
[0041]核酸适体是一种单链DNA，用于检测凝血酶十分灵敏和快速。在羧基功能化氧化石墨烯表面上固定后可用作凝血酶检测的生物传感器。核酸适体先在羧基功能化氧化石墨烯表面固定，当凝血酶出现时，核酸适体将改变构型与凝血酶结合，从而能有效的检测凝血酶固定后的存在。
[0042]本发明的有益效果:
[0043]本发明中的生物传感器采用羧基功能化氧化石墨烯，具有良好的电化学活性，且能较好的固定核酸适体，可用于多种目标蛋白的检测，能用于生物医学、食品安全和环境监测等领域。该生物传感器，能实现快速体外检测，检测的目标专一性强，检测准确度高，诊断时间短等，能有效的提高 检测水平，有良好的经济效益。具体来说:(1)大大简化复杂样本的分析过程，并很快取得结果。(2)容易实现微型化，整合进检测系统后可进行连续分析。
(3)得到的数据有助于储存、处理，还可以通过电脑进行系统的分析研究。能广泛的应用于疾病诊断、食品安全检测和 水质检测等具体领域。
[0044]本发明通过自组装法先将十八硫醇固定在金膜上，再将羧基功能化氧化石墨烯固定在十八硫醇上，最后将核酸适体与羧基功能化氧化石墨烯上的功能基团发生反应，将其固定后制备生物传感器，该方法简单、易操作，适于大规模生产应用。其中，本发明采用NaOH和ClCH2COONa将氧化石墨烯上的羟基、环氧基转化为羧基，使得羧基功能化氧化石墨烯中的C/0元素含量比为0.19，含有大量的COOH功能团，具有良好的电化学活性。
[0045]本发明采用牛血清蛋白来消除非目标蛋白与生物传感器之间的非特异性吸附，能够提高目标蛋白的检测准确度，使核酸适体与目标蛋白之间具有一一识别作用；同时采用石英晶体微天平技术检测目标蛋白，计算目标蛋白的含量，能够对目标蛋白进行准确定量分析。
【专利附图】
【附图说明】
[0046]图1为本发明实施例1中G0-C00H的Cls的XPS图；
[0047]图2为实施例1中G0-C00H在不同扫描速率下的循环伏安曲线图；
[0048]图3为实施例1中核酸适体在G0-C00H膜上的固定及凝血酶检测前后的电化学循环伏安曲线图；
[0049]图4为核酸适体在G0-C00H膜上的固定及凝血酶检测的实验流程图；
[0050]图5为核酸适体在G0-C00H膜上的固定及凝血酶与核酸适体结合过程的动力学曲线图。
【具体实施方式】
[0051]下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。[0052]实施例1
[0053]本实施例中基于核酸适体的生物传感器，在金膜上自组装有十八硫醇，十八硫醇通过分子间作用力结合有羧基功能化氧化石墨烯，羧基功能化氧化石墨烯烃活化处理使羧基转化为活化酯基基团，再通过活化酯基基团与核酸适体分子上的氨基酸形成酰胺键使核酸适体固定在羧基功能化氧化石墨烯表面。
[0054]本实施例中基于核酸适体的生物传感器的制备方法，包括以下步骤:
[0055](I)配制 PBS 缓冲液及电解质溶液:将 4.6548g Na2HPO4 ? 12H20、0.4g KH2P04、16gNaCl和0.4g KCl溶于200mL去离子水中，混匀即得pH值为7.4的PBS缓冲液(生物缓冲溶液)；每 200ml 水中加入 4.6548g Na2HPO4 ? 12H20、0.4g KH2PO4'16g NaCl 和 0.4g KCl，混匀即得电解质溶液；
[0056](2)配制核酸适体溶液和活化剂溶液:将IOD的核酸适体加入到电解质溶液中配成0.01mM核酸适体溶液，再将浓度稀释成IOOnM核酸适体溶液；将0.1lg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和0.76gl-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)分别溶于5ml pH值为7.4的PBS缓冲液中，使用前混合即可；
[0057](3)制备羧基功能化氧化石墨烯(G0-C00H):将50mg NaOH和50mg ClCH2COONa加入到Imllmg/ml的氧化石墨烯悬浮液中，水浴超声2h ;将悬浮液的pH值调节至中性，用去离子水反复离心洗涤3次；将洗涤后的悬浮液用去离子水透析48h以去除杂质粒子，在60°C的烘箱中干燥24h，再研磨即得；
[0058](4)清洗金膜:取浓硫酸和30%H202按照体积比为7: 3配制混合液；用混合液滴在金膜表面，浸泡金膜30s，再用去离子水清洗；重复浸泡、清洗操作3次，至金膜表面不再悬挂水珠，用高纯氮气吹干；
[0059](5)十八硫醇在金膜上自组装:将清洗后的金膜置于IOmL0.lmg/mL十八硫醇的乙醇溶液中，2h后取出，用去离子水清洗，再用氮气吹干；
[0060](6)羧基功能化氧化石墨烯与十八硫醇相结合:将自组装有十八硫醇的金膜置于IOml0.lmg/ml羧基功能化氧化石墨烯的悬浮液中，2h后取出，用水清洗,再用氮气吹干；
[0061](7)自组装有羧基功能化氧化石墨烯的金膜的活化:将步骤(2)制备的NHS溶液和EDC溶液按照同体积IOOy L混合，将自组装有羧基功能化氧化石墨烯的金膜置于混合液中，静置lh，即可；
[0062](8)核酸适体在羧基功能化氧化石墨烯上的固定:将自组装有羧基功能化氧化石墨烯的金膜置于IOnM核酸适体溶液中，24h取出，清洗，再用高纯氮气吹干即得。
[0063]本实施例中基于核酸适体的生物传感器在检测凝血酶方面的应用，包括如下步骤:(1)在盛有生物传感器的石英晶体微天平流通池中通入牛血清蛋白溶液，以消除体系的非特异性吸附，吸附达到平衡后，通入PH值为7.4的PBS缓冲液进行冲洗；(2)再通入凝血酶溶液，待吸附达到平衡后，通入PH值为7.4的PBS缓进行冲洗，记录石英晶体振荡频率变化，计算即得凝血酶的吸附质量。
[0064]实施例2
[0065]本实施例中基于核酸适体的生物传感器，在金膜上自组装有十八硫醇，十八硫醇通过分子间作用力结合有羧基功能化氧化石墨烯，羧基功能化氧化石墨烯烃活化处理使羧基转化为活化酯基基团，再通过活化酯基基团与核酸适体分子上的氨基酸形成酰胺键使核酸适体固定在羧基功能化氧化石墨烯表面。
[0066]本实施例中基于核酸适体的生物传感器的制备方法，包括以下步骤:
[0067](I)配制 PBS 缓冲液及电解质溶液:将 4.6548g Na2HPO4 ? 12H20、0.4g KH2PO4'16gNaCl和0.4g KCl溶于200mL去离子水中，混匀即得pH值为7.4的PBS缓冲液(生物缓冲溶液)；每 200ml 水中加入 4.6548g Na2HPO4 ? 12H20、0.4g KH2PO4'16g NaCl 和 0.4g KCl，混匀即得电解质溶液；
[0068](2)配制核酸适体溶液和活化剂溶液:将IOD的核酸适体加入到电解质溶液中配成0.01mM核酸适体溶液，再将浓度稀释成IOOnM核酸适体溶液；将0.1lg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和0.76gl-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)分别溶于5ml pH值为7.4的PBS缓冲液中，使用前混合即可；
[0069](3)制备羧基功能化氧化石墨烯:将70mg NaOH和30mg ClCH2COONa加入到
0.5mllmg/ml的氧化石墨烯悬浮液中，水浴超声2h ;将悬浮液的pH值调节至中性，用去离子水反复离心洗涤3次；将洗涤后的悬浮液用去离子水透析48h以去除杂质粒子，在60°C的烘箱中干燥24h，再研磨即得；
[0070](4)清洗金膜:取浓硫酸和30%H202按照体积比为7: 3配制混合液；用混合液滴在金膜表面，浸泡金膜45s，再用去离子水清洗；重复浸泡、清洗操作3次，至金膜表面不再悬挂水珠，用高纯氮气吹干；
[0071](5)十八硫醇在金膜上自组装:将清洗后的金膜置于IOml0.lmg/ml十八硫醇的乙醇溶液中，2h后取出，用去离子水清洗，再用氮气吹干；
[0072](6)羧基功能化氧化石墨烯与十八硫醇相结合:将自组装有十八硫醇的金膜置于IOml0.lmg/ml羧基功能化氧化石墨烯的悬浮液中，2h后取出，用水清洗,再用氮气吹干；
[0073](7)自组装有羧基功能化氧化石墨烯的金膜的活化:将步骤⑵制备的NHS溶液和EDC溶液按照同体积IOOy L混合，将自组装有羧基功能化氧化石墨烯的金膜置于混合液中，静置lh，即可；
[0074](8)核酸适体在羧基功能化氧化石墨烯上的固定:将自组装有羧基功能化氧化石墨烯的金膜置于IOOnM核酸适体溶液中，18h取出，清洗，再用高纯氮气吹干即得。
[0075]本实施例中基于核酸适体的生物传感器在检测凝血酶方面的应用，包括如下步骤:(1)在盛有生物传感器的石英晶体微天平流通池中通入牛血清蛋白溶液，以消除体系的非特异性吸附，吸附达到平衡后，通入PH值为7.4的PBS缓冲液进行冲洗；(2)再通入凝血酶溶液，待吸附达到平衡后，通入PH值为7.4的PBS缓进行冲洗，记录石英晶体振荡频率变化，计算即得凝血酶的吸附质量。
[0076]实施例3
[0077]本实施例中基于核酸适体的生物传感器，在金膜上自组装有十八硫醇，十八硫醇通过分子间作用力结合有羧基功能化氧化石墨烯，羧基功能化氧化石墨烯烃活化处理使羧基转化为活化酯基基团，再通过活化酯基基团与核酸适体分子上的氨基酸形成酰胺键使核酸适体固定在羧基功能化氧化石墨烯表面。
[0078]本实施例中基于核酸适体的生物传感器的制备方法，包括以下步骤:
[0079](I)配制 PBS 缓冲液及电解质溶液:将 4.6548g Na2HPO4 ? 12H20、0.4g KH2PO4'16gNaCl和0.4g KCl溶于200mL去离子水中，混匀即得pH值为7.4的PBS缓冲液(生物缓冲溶液)；每 200ml 水中加入 4.6548g Na2HPO4 ? 12H20、0.4g KH2PO4'16g NaCl 和 0.4g KCl，混匀即得电解质溶液；[0080] (2)配制核酸适体溶液和活化剂溶液:将IOD的核酸适体加入到电解质溶液中配成0.01mM核酸适体溶液，再将浓度稀释成IOOnM核酸适体溶液；将0.1lg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和0.76gl-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)分别溶于5ml pH值为7.4的PBS缓冲液中，使用前混合即可；
[0081 ] (3)制备羧基功能化氧化石墨烯:将30mg NaOH和70mg ClCH2COONa加入到5mllmg/ml的氧化石墨烯悬浮液中，水浴超声2h ;将悬浮液的pH值调节至中性，用去离子水反复离心洗涤3次；将洗涤后的悬浮液用去离子水透析48h以去除杂质粒子，在60°C的烘箱中干燥24h，再研磨即得；
[0082](4)清洗金膜:取浓硫酸和30%H202按照体积比为7: 3配制混合液；用混合液滴在金膜表面，浸泡金膜lmin，再用去离子水清洗；重复浸泡、清洗操作3次，至金膜表面不再悬挂水珠，用高纯氮气吹干；
[0083](5)十八硫醇在金膜上自组装:将清洗后的金膜置于IOml0.lmg/ml十八硫醇的乙醇溶液中，2h后取出，用去离子水清洗，再用氮气吹干；
[0084](6)羧基功能化氧化石墨烯与十八硫醇相结合:将自组装有十八硫醇的金膜置于IOml0.lmg/ml羧基功能化氧化石墨烯的悬浮液中，2h后取出，用水清洗,再用氮气吹干；
[0085](7)自组装有羧基功能化氧化石墨烯的金膜的活化:将步骤(2)制备的NHS溶液和EDC溶液按照同体积IOOy L混合，将自组装有羧基功能化氧化石墨烯的金膜置于混合液中，静置lh，即可；
[0086](8)核酸适体在羧基功能化氧化石墨烯上的固定:将自组装有羧基功能化氧化石墨烯的金膜置于1000nM核酸适体溶液中，12h取出，清洗，再用高纯氮气吹干即得。
[0087]本实施例中基于核酸适体的生物传感器在检测凝血酶方面的应用，包括如下步骤:(1)在盛有生物传感器的石英晶体微天平流通池中通入牛血清蛋白溶液，以消除体系的非特异性吸附，吸附达到平衡后，通入PH值为7.4的PBS缓冲液进行冲洗；(2)再通入凝血酶溶液，待吸附达到平衡后，通入PH值为7.4的PBS缓进行冲洗，记录石英晶体振荡频率变化，计算即得凝血酶的吸附质量。
[0088]检测
[0089]一、羧基功能化氧化石墨烯(G0-C00H)膜的元素组成和含量
[0090]取实施例1中自组装有羧基功能化氧化石墨烯膜的金膜进行X-射线光电子能谱对其化学结构及元素组成进行分析。如图1所示，通过XPSpesk软件对所得的图谱进行分峰，在G0-C00H的Cls图中，含有四个峰，约在284.7、286.3、287.7和288.8eV处，分别对应C-C/C-H、C-0、C=O和O-C=O四种基团。G0-C00H中的C/0元素含量比为0.19。
[0091]二、羧基功能化氧化石墨烯膜的电化学性能
[0092]取实施例1中自组装有羧基功能化氧化石墨烯膜的金膜，分别测试其在20、40、60、80和100mV/s扫描频率下的循环伏安曲线。循环伏安曲线面积的大小表明导电性能的好坏，循环伏安特性曲线面积越大，导电性越好。如图2所示，随着扫描速率的增大，循环伏安曲线所包含的面积也趋于变大。说明羧基改性石墨烯具有较好的电话活性。
[0093]三、核酸适体在羧基功能化氧化石墨烯膜上的固定及凝血酶检测前后的电化学性倉泛
[0094]图3为所示实施例1中核酸适体在G0-C00H薄膜上的固定及凝血酶蛋白检测前后的电化学循环伏安曲线图。当核酸适体在G0-C00H固定后，会引起电化学循环伏安曲线面积的减小；当对凝血酶进行检测后，曲线面积进一步减小。说明核酸适体在G0-C00H表面固定后，覆盖复合电极表面，使得电子自由流动困难，从而降低G0-C00H表面的电化学活性；当对凝血酶进行检测后，凝血酶与核酸适体结合，进一步导致电子流动的困难，复合电极的电化学活性降低更为明显。
[0095]四、羧基功能化氧化石墨烯膜的自组装和核酸适体在羧基功能化氧化石墨烯膜表面的固定及凝血酶检测过程的动力学行为
[0096]采用CHI440B系列QCM对固定核酸适体和检测凝血酶过程进行在线检测，实验流程图如图4所示。测定的基本原理是逆电压效应和著名的Sauerbrey方程:AF=-[2f。2/(uq* Pq) 172A] Am0本实验使用QCM的fQ为8.0XlO6Hz, A是0.196cm2，由此可以计算出QCM曲线变化的-1Hz=L 34ng。
[0097]采用石英晶体微天平(QCM)对羧基功能化氧化石墨烯薄膜在金膜上的自组装行为和核酸适体在其表面的固定及凝血酶的检测进行在线检测，如图5所示，当十八硫醇溶液被通入流通池中后，由于十八硫醇在金膜上自组装，造成石英晶体的质量增加，其震荡频率下降，约为1000Hz ;接着通入G0-C00H悬浮液，随着G0-C00H在十八硫醇上自组装，再次引起石英晶体质量增加，其震荡频率下降，约为207Hz ;当核酸适体在G0-C00H膜上固定达到平衡后，用PBS冲洗，石英晶体震荡频率下降约137Hz，即184ng ;接着加入非目标蛋白质牛血清白蛋白(BSA)消除体系非特异性吸附，待BSA吸附平衡后，用PBS冲洗，石英晶体震荡频率下降约230Hz ;最后通入凝血酶溶液，开始几分钟内石英晶体震荡频率下降约62Hz，即质量为83ng。
【权利要求】
1.一种基于核酸适体的生物传感器，其特征在于:在金膜上自组装有十八硫醇，十八硫醇通过分子间作用力结合有羧基功能化氧化石墨烯，羧基功能化氧化石墨烯烃活化处理使羧基转化为活化酯基基团，再通过活化酯基基团与核酸适体分子上的氨基形成酰胺键使核酸适体固定在羧基功能化氧化石墨烯表面。
2.根据权利要求1所述的基于核酸适体的生物传感器，其特征在于:所述的羧基功能化氧化石墨烯的制备方法为:将NaOH和ClCH2COONa加入到氧化石墨烯悬浮液中，NaOH,ClCH2COONa与氧化石墨烯的质量比为(30~70):(30~70):(0.5~5)，分散；分散后将悬浮液的PH值调节至中性，用水反复离心洗涤3~5次；将洗涤后的悬浮液用水透析36~60h，烘干，研磨即得。
3.—种如权利要求1所述的基于核酸适体的生物传感器的制备方法，其特征在于:包括以下步骤: (1)十八硫醇在金膜上自组装:将清洗后的金膜置于IOml0.lmg/ml十八硫醇的乙醇溶液中，2h后取出，用水清洗，再用氮气吹干； (2)羧基功能化氧化石墨烯与十八硫醇相结合:将自组装有十八硫醇的金膜置于IOml0.lmg/ml羧基功能化氧化石墨烯的悬浮液中，2~2.5h后取出，用水清洗,再用氮气吹干; (3)核酸适体在羧基功能化氧化石墨烯上的固定:将自组装有羧基功能化氧化石墨烯的金膜活化后置于I~1000nM核酸适体溶液中，12~24h取出，清洗，再用氮气吹干，即可。
4.根据权利要求3所述的基于核酸适体的生物传感器的制备方法，其特征在于:所述步骤⑴中金膜的清洗方 法为:取浓硫酸和30%H202按照体积比为3: (5~8)配制混合液；用混合液浸泡金膜20~60s，再用水清洗；重复浸泡、清洗操作3~4次，用氮气吹干，即可。
5.根据权利要求3所述的基于核酸适体的生物传感器的制备方法，其特征在于:所述步骤⑵中羧基功能化氧化石墨烯的制备方法为:将NaOH和ClCH2COONa加入到氧化石墨烯悬浮液中，NaOH、ClCH2COONa与氧化石墨烯的质量比为(30~70): (30~70): (0.5~5)，分散；分散后将悬浮液的pH值调节至中性，用水反复离心洗涤3~5次；将洗涤后的悬浮液用水透析36~60h，烘干，研磨即得。
6.根据权利要求3所述的基于核酸适体的生物传感器的制备方法，其特征在于:所述步骤(3)中核酸适体溶液的制备方法为:将核酸适体加入电解质溶液中配制IOOnM核酸适体溶液，即可。
7.根据权利要求6所述的基于核酸适体的生物传感器的制备方法，其特征在于:所述电解质溶液的制备方法为:每100ml pH值为7.4的PBS缓冲液中加入1.1688g NaCl、6.585gK3Fe (CN)6 和 8.4478g K4Fe (CN)6 ? 3H20,混匀即可。
8.根据权利要求3所述的基于核酸适体的生物传感器的制备方法，其特征在于:所述步骤(3)中自组装有羧基功能化氧化石墨烯的金膜的活化方法为:以pH值为7.4的PBS缓冲液为溶剂，分别配制0.2M的1-(3- 二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺溶液及0.8M的N-羟基丁二酰亚胺溶液，同体积混合得混合液；将自组装有羧基功能化氧化石墨烯的金膜置于混合液中，静置I~1.5h，即可。
9.根据权利要求3所述的基于核酸适体的生物传感器的制备方法，其特征在于:所述步骤(3)中的核酸适体为凝血酶核酸适体、免疫球蛋白E核酸适体或抗腺苷核酸适体。
10.一种如权利要求1所述的基于核酸适体的生物传感器在检测凝血酶方面的应用，其特征在于:包括如下步骤:(I)在盛有生物传感器的石英晶体微天平流通池中通入牛血清蛋白溶液，以消除体系的非特异性吸附，吸附达到平衡后，通入PH值为7.4的PBS缓冲液进行冲洗；(2)再通入凝血酶溶液，待吸附达到平衡后，通入pH值为7.4的PBS缓进行冲洗，记录石英晶体振荡频率变化，计 算即得凝血酶的吸附质量。
【文档编号】G01N27/327GK103529113SQ201310531006
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2013年10月30日 优先权日:2013年10月30日
【发明者】张治红, 闫福丰, 康萌萌, 杨光, 彭东来, 王培远, 田志壮 申请人:郑州轻工业学院