乳品真蛋白的sds-page检测方法及其鉴定图谱库的制作方法
【专利摘要】本发明公开乳品真蛋白的SDS-PAGE检测方法及其鉴定图谱库。所述检测方法是将预处理待检样品后，以不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测，并以UVP凝胶成像仪摄像结合Labwork软件进行分析，将泳道的蛋白质斑点密度与样品中真蛋白浓度关联，并对照标准曲线从而计算蛋白含量本发明所述的乳品真蛋白的SDS-PAGE检测方法可以快速灵敏便捷地检测处乳品中真蛋白的组成及其含量，且过程中处理所得样品可直接用于乳品中总蛋白的含量测定。真正实现一次测量得到目标结果。同时采用上述方法建立了乳品真蛋白的SDS-PAGE鉴定图谱库。可用于待测乳品的SDS-PAGE比对，以便直接进行判定与评价。具备非常好的应用前景。
【专利说明】乳品真蛋白的SDS-PAGE检测方法及其鉴定图谱库
【技术领域】
[0001]本发明应用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测技术，建立乳品中真蛋白组份和含量的准确检测方法，同时建立乳品蛋白SDS-PAGE鉴定图谱库。
【背景技术】
[0002]乳品质量问题是关系到国计民生的大事。2008年我国发生“三聚氰胺毒奶粉事件”，严重威胁人民健康生命，中国奶业遭遇最深刻的行业重创以及最严重的信任危机，一些地方名牌和全国名牌也上了 “黑名单”。2011年，“皮革水解蛋白”奶粉卷土重来，“皮革奶”的消息又让人谈奶色变。目前，我国乳制品的突出问题是掺假，不法商人受成本及利益的驱动，利用乳品蛋白检测技术和标准的缺失或局限等原因，除了将化工原料“三聚氰胺”掺入乳品中获取暴利，更在食品中掺入普通方法不易检测出的非乳品蛋白成份。 [0003]目前常规蛋白 质检验方法，不能确切反映乳品蛋白质的含量、来源和组成，对于在乳中掺入廉价的水解蛋白或在牛乳中掺入其他动物乳等新的掺假方式，传统的检测方法难以检出。现行的乳品掺假检验研究，大多针对某假定的单一物质进行定性定量，要实现多个掺假物的检测操作繁琐，尤其是对乳品中可能出现的未知物难以评判。我国乳品检测急需建立适应新掺假情况的快速、准确的检测方法，找到直接测定真蛋白质含量的可靠方法，这是彻底堵住假蛋白掺假的唯一手段。因此，迫切需要建立便捷灵敏的检测方法，来有效鉴别食品中真蛋白的含量，进而堵住了市场监管上的漏洞，使伪劣产品无所遁形。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种快速灵敏的乳品真蛋白含量及检测乳品中蛋白质组分和含量SDS-PAGE检测方法。同时建立各进口和国产乳品品牌蛋白质组分及含量分析的SDS-PAGE电泳图谱库。
[0005]本发明所述的乳品真蛋白的SDS-PAGE检测方法，包括如下步骤:
[0006]①预处理待检样品，制备测试样品，所述待检样品包括待检乳粉样品、待检乳清粉样品和待检含乳饮料样品；
[0007]②向步骤I制备的测试样品中按照Img:20μ L的比例加入浓度为50mmol/L的Tris-HCL缓冲液,振动混合5min, 100°C水浴5min, 10000r/min离心5min,以上清液进行后续检测；所述的Tris-HCL缓冲液的pH值6.8，其还含0.05kg/L SDS,0.lkg/?β-巯基乙醇，体积百分含量为20%的甘油以及0.002kg/L溴酚兰；
[0008]③采用不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳进行样品分析，上样量为30 μ L，25mA恒流电泳5h ;然后取出胶片并用2.5%的考马斯亮兰染色4h，继而使用甲醇-冰醋酸按照体积比30:10混合而成的脱色液脱色至透明；
[0009]④脱色后的电泳胶片置于UVP凝胶成像仪摄像，采用Labwork软件，分析记录每泳道的蛋白质斑点密度，对照标准曲线I计算蛋白含量；所述标准曲线I由标准蛋白的含量对以相同方法获得的蛋白斑点密度作图所得。[0010]本发明的乳品真蛋白的SDS-PAGE检测方法中所述的不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳优选浓缩胶浓度为4%，分析胶浓度为12.5%。
[0011]本发明的乳品真蛋白的SDS-PAGE检测方法中所述的待检乳粉样品的预处理方法是:取Ig待检乳粉样品加入至10mL60°C蒸馏水中，溶解后加入浓度为0.6mol/L的三氯乙酸水溶液ImL,振动混合5min ;然后分3次加入共5mL乙醚，1500r/min离心5min ;倾去醚层和水层，以浓度为50mmol/L、pH值为8.0的Tris-HCI溶液洗涤沉淀物洗涤3次，真空干燥成粉，即得测试样品。
[0012]本发明的乳品真蛋白的SDS-PAGE检测方法中所述的待检乳清粉样品的预处理方法是:取Ig待检乳清粉样品加入至IOmL蒸馏水中，溶解后过0.45 μ针头式过滤，滤液真空干燥成粉，即得测试样品。
[0013]本发明的乳品真蛋白的SDS-PAGE检测方法中所述的含乳饮料样品的预处理方法是:取标识蛋白质含量< 2.9%的待检含乳饮料样品500 μ L或者标识蛋白质含量> 2.9%的待检含乳饮料样品200 μ L，加入lml-20°C冷丙酮过夜，10000r/min离心15min，沉淀以体积浓度为80%的_20°C冷丙酮洗涤3次，真空干燥成粉即得测试样品。
[0014]本发明的乳品真蛋白的SDS-PAGE检测方法中，步骤④所述的标准蛋白是α _乳白蛋白和β-乳球蛋白。当然，还可以包括但不限于a sl-CN、a s2_CN、β-CN等酪蛋白。
[0015]本发明的乳品真蛋白的SDS-PAGE检测方法中，还可以包括蛋白质总含量的检测步骤:向步骤①所或得的测试样品中加入ImL浓度为lmol/L的NaOH溶液，溶解后吸取20 μ L样品,加入6mL双缩脲试剂,反应30min后，以蒸懼水做空白，在540nm波长下测定吸光值，并对照标准曲线II计算含量；所述标准曲线II的制备方法是:配制lmg/mL牛血清蛋白溶液，取O，10，20，40，60，80 μ L，分别加入6mL双缩脲试剂，反应30min后，以蒸馏水为空白，测定540nm处吸光值，以浓度关联吸光值作图得标准曲线。
[0016]另一方面，本发明基于上述方法建立了乳品真蛋白的SDS-PAGE鉴定图谱库，所述图谱库具体通过下述方法建立:
[0017]①采集有效量的乳品样本，所述样本包括足够数量的乳粉样品、乳清粉样品和待检含乳饮料样品；
[0018]②预处理所选择的乳品样本，制备测试样品:
[0019]所述的待检乳粉样品的预处理方法是:取Ig待检乳粉样品加入至10mL60°C蒸馏水中，溶解后加入浓度为0.6mol/L的三氯乙酸水溶液ImL,振动混合5min ;然后分3次加入共5mL乙醚，1500r/min离心5min ;倾去醚层和水层，以浓度为50mmol/L、pH值为8.0的Tris-HCI溶液洗涤沉淀物洗涤3次，真空干燥成粉，即得测试样品；
[0020]所述的待检乳清粉样品的预处理方法是:取Ig待检乳清粉样品加入至IOmL蒸馏水中，溶解后过0.45 μ针头式过滤，滤液真空干燥成粉，即得测试样品；
[0021]所述的待检含乳饮料样品的预处理方法是:取标识蛋白质含量< 2.9%的待检含乳饮料样品500 μ L或者标识蛋白质含量≤2.9%的待检含乳饮料样品200 μ L，加入lml-20°C冷丙酮过夜，10000r/min离心15min，沉淀以体积浓度为80%的_20°C冷丙酮洗涤3次，真空干燥成粉即得测试样品；
[0022]③向步骤②制备的测试样品中按照Img:20μ L的比例加入浓度为50mmol/L的Tris-HCL缓冲液,振动混合5min, 100°C水浴5min, 10000r/min离心5min,以上清液进行后续检测；所述的Tris-HCL缓冲液的pH值6.8，其还含0.05kg/L SDS,0.lkg/?β-巯基乙醇，体积百分含量为20%的甘油以及0.002kg/L溴酚兰；
[0023]④采用不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳进行样品分析，上样量为30 μ L，25mA恒流电泳5h ;然后取出胶片并用2.5%的考马斯亮兰染色4h，继而使用甲醇-冰醋酸按照体积比30:10混合而成的脱色液脱色至透明；
[0024]⑤脱色后的电泳胶片置于UVP凝胶成像仪摄像，采集所有样品的SDS-PAGE电泳图谱入库，建立乳品真蛋白的SDS-PAGE鉴定图谱库。
[0025]本发明所述的乳品真蛋白的SDS-PAGE检测方法可以快速灵敏便捷地检测处乳品中真蛋白的组成及其含量，且过程中处理所得样品可直接用于乳品中总蛋白的含量测定。真正实现一次测量得到目标结果。本发明所建立的乳品真蛋白的SDS-PAGE鉴定图谱库，可以直接将待测乳品样品的SDS-PAGE图谱与电泳图谱库中该品牌的电泳图谱进行比对，直接进行该品牌乳品质量的判定与评价。如果样品本身质量优良，那就不必进一步进行假蛋白筛查；如果真蛋白检测指标有可疑，产品可能有掺假，就要进行掺假检测。因此具备非常好的应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0026]本发明附图5幅，分别是:
[0027]图1是实施例1的各种乳品蛋白质组成的SDS-PAGE分析结果；其中，1、全脂乳粉；
2、乳清粉；3、β -乳球蛋白；4、α -乳白蛋白；5、含乳饮料i ;6、含乳饮料ii。
[0028]图2是实施例2的β -LG、α -LA标准样品和含乳饮料的SDS-PAGE分析结果。
[0029]图3是实施例3乳品蛋白SDS-PAGE鉴定图谱库1_10号建库样品的SDS-PAGE图
[0030]图4是实施例3乳品蛋白SDS-PAGE鉴定图谱库11_18号建库样品的SDS-PAGE图 [0031]图5是实施例3乳品蛋白SDS-PAGE鉴定图谱库19-22号建库样品的SDS-PAGE图
【具体实施方式】
[0032]下面为本发明的具体实施例，其对本方法的建立及其应用作进一步的说明，但并不以任何形式限制本发明的内容。
[0033]若无特殊说明，`本部分所使用的主要试剂、仪器及其商品来源如上述方法。
[0034]如无特殊说明，本发明中所使用的试剂包括:标准品α-乳白蛋白(a-LA)、i3-乳球蛋白(β-LG)，低分子量标准蛋白(15.5-97ku)，大连宝生物工程公司；大豆蛋白粉、明胶、乳清粉分析纯，北京鼎国生物技术有限责任公司；酪蛋白(CN)优级纯，美国sigma公司；丙烯酰胺(Acr)优级纯，美国Amresc0公司；Tris，西安西京制药厂；N_N甲叉双丙烯酰胺(Bis)优级纯，美国Arnresco公司；TEMED，上海前进化学试剂厂；十二烷基硫酸钠(SDS)优级纯，USB公司；过硫酸铵(Ap)分析纯，北京化学试剂厂；四甲基乙二胺(TEMED)优级纯，北京化学试剂厂；巯基乙醇，天津市登峰化学试剂厂；BCA优级纯，美国sigma公司；碳酸钠、酒石酸二钠、氢氧化钠、碳酸氢钠、硫酸铜、乙酸、过硫酸铵、甘油、溴酚蓝、甘氨酸、盐酸、甲酸等均为分析纯。
[0035] 仪器包括:SDS—PAGE电泳仪；电泳槽HoeferminiVE型，美国AmershamBiosciences (SF)Corp ；电泳仪BG.Power600型，北京百晶生物技术有限公司；捷达图像分析系统JD ;高速冷冻离心机；727分栅分光光度计，上海精密科学有限公司；DYY-6C电泳仪，北京市六一仪器厂；DYCZ-24D型垂直板电泳槽,北京市六一仪器厂。
[0036]本发明中所有的样品，均采用下述方法进行检测前的预处理:
[0037]待检乳粉样品的预处理:取Ig待检乳粉样品加入至10mL60°C蒸馏水中，溶解后加入浓度为0.6mol/L的三氯乙酸水溶液ImL,振动混合5min ;然后分3次加入共5mL乙醚，1500r/min离心5min ;倾去醚层和水层，以浓度为50mmol/L、pH值为8.0的Tris-HCI溶液洗涤沉淀物洗涤3次，真空干燥成粉，即得测试样品。
[0038]待检乳清粉样品的预处理:取Ig待检乳清粉样品加入至IOmL蒸馏水中，溶解后过
0.45 μ针头式过滤，滤液真空干燥成粉，即得测试样品。
[0039]待检含乳饮料样品的预处理:取标识蛋白质含量< 2.9%的待检含乳饮料样品500 μ L或者标识蛋白质含量≥2.9%的待检含乳饮料样品200 μ L，加入lml-20°C冷丙酮过夜，10000r/min离心15min，沉淀以体积浓度为80%的_20°C冷丙酮洗涤3次，真空干燥成粉即得测试样品。
[0040]以预处理所得的待测样品进行以下实施例的试验。
[0041]实施例中述及的蛋白质含量测定是指双缩脲比色法:向测试样品中加入ImL浓度为lmol/L的NaOH溶液，溶解后吸取20 μ L样品，加入6mL双缩脲试剂，反应30min后，以蒸馏水做空白，在540nm波长下测定吸光值，并对照标准曲线II计算含量；所述标准曲线II的制备方法是:配制lmg/mL牛血清蛋白溶液，取0，10，20，40，60，80 μ L，分别加入6mL双缩脲试剂，反应30min后，以蒸馏水为空白，测定540nm处吸光值，以浓度关联吸光值作图得标准曲线。
[0042]实施例中述及的SDS-PAGE分析方法是指:向所制备的测试样品中按照Img:20 μ L的比例加入浓度为50mmol/L的Tris-HCL缓冲液，振动混合5min，100°C水浴5min，10000r/min离心5min,以上清液进行后续检测；所述的Tris-HCL缓冲液的pH值6.8,其还含0.05kg/L SDS，0.lkg/L β -巯基乙醇，体积百分含量为20%的甘油以及0.002kg/L溴酚兰；
[0043]进而，采用不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳(不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳的浓缩胶浓度为4%，分析胶浓度为12.5%)进行样品分析，上样量为30 μ L，25mA恒流电泳5h ;然后取出胶片并用2.5%的考马斯亮兰染色4h，继而使用甲醇-冰醋酸按照体积比30:10混合而成的脱色液脱色至透明；脱色后的电泳胶片置于UVP凝胶成像仪摄像，采用Labwork软件，分析记录每泳道的蛋白质斑点密度，对照标准曲线I计算蛋白含量；所述标准曲线I由标准蛋白的含量对以相同方法获得的蛋白斑点密度作图所得。所述标准蛋白包括α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、a S1-酪蛋白(a sl-CN)、a s2_酪蛋白(a S2_CN)以及β-酪蛋白(β-CN)。
[0044]实施例1、全脂乳粉、乳清粉和含乳饮料各蛋白组分的相对含量
[0045]选择市面上常见的全脂乳粉、乳清粉和含乳饮料作为测试对象，分析了 20种全脂乳粉中的蛋白组成(图1)。根据标准分析量外推，测定出全脂乳粉中a sl-CN、as2-CN、β -CN等 3 种酪蛋白的含量比例分别为(34.4±1.64)%，(8.35 ±0.25)%和(38.50 ±2.32)%，α-乳白蛋白和乳球蛋白的含量比例为(9.57±0.54)%，(1.33±0.37)%;[0046]检测的乳清粉(WPI)中的各蛋白组成(图1中2)，WPI中牛血清白蛋白(BSA)、a s2_CN、a sl-CN, β -CN、β -LG 和 α -LA 的相对含量依次分别为(3.542±0.105)%、(18.532 + 1.203)%, (6.303 ± 2.4) %、(22.513 + 2.77)%, (33.848 + 0.32)% 和(12.446±0.158)%ο
[0047]检测的含乳饮料中的a S2-CN、a sl-CN, β -CN、β -LG和α -LA的相对含量依次分另Ij 为(25.051 ± 1.204)%，(15.939± 1.092)%，(25.524±0.457)%，(12.595±0.768)%，(3.9463±0.431)%。其中β -LG和α -LA的相对含量明显高于全脂乳粉中两者的相对含量，说明含乳饮料A加入了乳清蛋白。因此，利用本方法可快速测定出含乳饮料的蛋白质的组成、相对含量和来源。
[0048]实施例2、含乳饮料B各蛋白组分的绝对含量
[0049]为了准确测定含乳饮料中α -LA和β -LG的绝对含量，本发明利用SDS-PAGE电泳结合凝胶成像分析建立了标准曲线。α-LA和β-LG标准品分别以10mg/mL浓度溶于缓冲液，上样量分别为5，10，15，20 μ L，分别含蛋白质50，100，150，200 μ g，进行电泳，结果如图2所。电泳胶片置于UVP凝胶成像仪分析，获得各蛋白质斑点密度，与a-LA和β-LG的相对含量、绝对含量关联。以标准蛋白的绝对含量对蛋白斑点密度作图得出相应的标准曲线。
[0050]根据检测所得的含乳饮料B中β-LG和a-LA在电泳胶片上的蛋白质斑点密度，在上述标准曲线中查出其绝对含量，经过换算得出该含乳饮料中β-LG的绝对含量为
0.5434mg/mL ； a -LA的绝对含量为0.09mg/mL。本文根据双缩脲比色法计算出该含乳饮料的蛋白质含量为8.075mg/mL。由此可知含乳饮料B中β-LG占总乳蛋白6.6% ； a -LA占总乳蛋白的1.1%。与全脂乳粉中两者的相对含量相当，说明含乳饮料B未加入乳清粉。本文中，a-LA的测值偏低，可能与该蛋白很难被丙酮沉淀有关。a-LA是乳清蛋白中热稳定性最强的一种，具有极闻的未水性。
[0051]实施例3、乳品品牌蛋白质的SDS-PAGE电泳图谱库
[0052]本实施例广泛收集市售奶粉和液态奶，编号为I?22 (仅为部分结果示例)。采用本发明的SDS-PAGE方法检测真蛋白质组分和含量，建立乳品品牌蛋白质的SDS-PAGE电泳图谱库。如附图3-5所示。
【权利要求】
1.乳品真蛋白的SDS-PAGE检测方法，包括如下步骤: ①预处理待检样品，制备测试样品，所述待检样品包括待检乳粉样品、待检乳清粉样品和待检含乳饮料样品； ②向步骤I制备的测试样品中按照Img:20μ L的比例加入浓度为50mmol/L的Tris-HCL缓冲液,振动混合5min, 100°C水浴5min, 10000r/min离心5min,以上清液进行后续检测；所述的Tris-HCL缓冲液的pH值6.8，其还含0.05kg/L SDS,0.lkg/?β-巯基乙醇，体积百分含量为20%的甘油以及0.002kg/L溴酚兰； ③采用不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳进行样品分析，上样量为30μ L，25mA恒流电泳5h ；然后取出胶片并用2.5%的考马斯亮兰染色4h，继而使用甲醇-冰醋酸按照体积比30:10混合而成的脱色液脱色至透明； ④脱色后的电泳胶片置于UVP凝胶成像仪摄像，采用Labwork软件，分析记录每泳道的蛋白质斑点密度，对照标准曲线I计算蛋白含量；所述标准曲线I由标准蛋白的含量对以相同方法获得的蛋白斑点密度作图所得。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳的浓缩胶浓度为4%，分析胶浓度为12.5%。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的待检乳粉样品的预处理方法是:取Ig待检乳粉样品加入至10mL60°C蒸馏水中，溶解后加入浓度为0.6mol/L的三氯乙酸水溶液ImL,振动混合5min ;然后分3次加入共5mL乙醚，1500r/min离心5min ;倾去醚层和水层，以浓度为50mmol/L、pH值为8.0的Tris-HCI溶液洗涤沉淀物洗涤3次，真空干燥成粉，即得测试样品。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的待`检乳清粉样品的预处理方法是:取Ig待检乳清粉样品加入至IOmL蒸馏水中，溶解后过0.45 μ针头式过滤，滤液真空干燥成粉，即得测试样品。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的待检含乳饮料样品的预处理方法是:取标识蛋白质含量< 2.9%的待检含乳饮料样品500 μ L或者标识蛋白质含量> 2.9%的待检含乳饮料样品200 μ L，加入lml-20°C冷丙酮过夜，10000r/min离心15min，沉淀以体积浓度为80%的_20°C冷丙酮洗涤3次，真空干燥成粉即得测试样品。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤④的标准蛋白是α-乳白蛋白和β -乳球蛋白。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的方法中还包括蛋白质总含量的检测步骤:向步骤①所或得的测试样品中加入ImL浓度为lmol/L的NaOH溶液，溶解后吸取20 μ L样品,加入6mL双缩脲试剂,反应30min后，以蒸懼水做空白，在540nm波长下测定吸光值，并对照标准曲线II计算含量； 所述标准曲线II的制备方法是:配制lmg/mL牛血清蛋白溶液，取0，10，20，40，60，80 μ L，分别加入6mL双缩脲试剂，反应30min后，以蒸馏水为空白，测定540nm处吸光值，以浓度关联吸光值作图得标准曲线。
8.乳品真蛋白的SDS-PAGE鉴定图谱库，其特征在于通过下述方法建立: ①采集有效量的乳品样本，所述样本包括足够数量的乳粉样品、乳清粉样品和待检含乳饮料样品；②预处理所选择的乳品样本，制备测试样品: 所述的待检乳粉样品的预处理方法是:取1g待检乳粉样品加入至10mL60°C蒸馏水中，溶解后加入浓度为0.6mol/L的三氯乙酸水溶液lmL，振动混合5min ;然后分3次加入共5mL乙醚，1500r/min离心5min ;倾去醚层和水层，以浓度为50mmol/L、pH值为8.0的Tris-HCI溶液洗涤沉淀物洗涤3次，真空干燥成粉，即得测试样品； 所述的待检乳清粉样品的预处理方法是:取Ig待检乳清粉样品加入至IOmL蒸馏水中，溶解后过0.45 μ针头式过滤，滤液真空干燥成粉，即得测试样品； 所述的待检含乳饮料样品的预处理方法是:取标识蛋白质含量< 2.9%的待检含乳饮料样品500 μ L或者标识蛋白质含量≥2.9%的待检含乳饮料样品200 μ L，加入lml-20°C冷丙酮过夜，10000r/min离心15min，沉淀以体积浓度为80%的_20°C冷丙酮洗涤3次，真空干燥成粉即得测试样品； ③向步骤②制备的测试样品中按照1mg: 20 μ L的比例加入浓度为50mmo l/L的Tris-HCL缓冲液,振动混合5min, 100°C水浴5min, 10000r/min离心5min,以上清液进行后续检测；所述的Tris-HCL缓冲液的pH值6.8，其还含0.05kg/1 SDS,0.lkg/Lβ-巯基乙醇，体积百分含量为20%的甘油以及0.002kg/L溴酚兰； ④采用不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳进行样品分析，上样量为30μ L，25mA恒流电泳5h ；然后取出胶片并用2.5%的考马斯亮兰染色4h，继而使用甲醇-冰醋酸按照体积比30:10混合而成的脱色液脱色至透明； ⑤脱色后的电泳胶片置于UVP凝胶成像仪摄像，采集所有样品的SDS-PAGE电泳图谱入库，建立乳品真蛋白的SDS-PAGE鉴定图谱库。
【文档编号】G01N27/447GK103616429SQ201310670755
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年12月11日 优先权日:2013年12月11日
【发明者】郑秋月, 曹际娟, 徐君怡, 徐杨 申请人:郑秋月, 曹际娟, 徐君怡, 徐杨