一种血小板标记物及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种血小板标记物，它是连接有血小板特异性抗体和荧光分子的2～6G?PAMAM。本发明还提供了前述血小板标记物的制备方法。本发明血小板标记物制备方法简单，可有效地标记血小板，应用前景良好。
【专利说明】一种血小板标记物及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种血小板标记物及其制备方法，属于生物医学【技术领域】。
【背景技术】
[0002]血小板是体内血栓形成的关键成分之一，在心血管疾病(增殖、血栓形成和血栓栓塞)、炎症和部分肿瘤等多种病理生理进程中扮演重要角色。
[0003]然而，长期以来一直缺乏血小板的标记物，导致临床上难以直接有效检测血小板的聚集部位和聚集程度，使得血栓类疾病的研究停滞不前，因此，急需寻找一种血小板的标记物。
【发明内容】
[0004]为了解决上述问题，本发明提供了一种血小板标记物及其制备方法。
[0005]本发明血小板标记物，它是连接有血小板特异性抗体和荧光分子的2?6GPAMAM0
[0006]PAMAM:聚酰胺-胺型树枝状高分子，是一种高度枝化的球状单分散大分子，其分子结构中心由中心核、重复单元以及末端基团构成，具有高度的几何对称性，其中心核为乙二胺结构，以中心核为起始中心，由丙烯酸甲酯等原料在外面接枝，每完成反应增长一代(Generation,简称G),每增长一代末端氨基数目增长一倍，2?6G PAMAM表不第二代?第六代聚酰胺-胺型树枝状高分子。
[0007]本发明制备前述血小板标记物的方法，具体步骤为:将2?6G PAMAM和血小板特异性抗体连接，再用荧光分子标记，即得连接了血小板特异性抗体和荧光分子的2?6GPAMAM0
[0008]所述2?6GPAMAM是由下述方法制备的:取PAMAM，溶于甲醇中，加入甲醇钠，在氮气保护下逐滴加入丙烯酸甲酯，搅拌60?80h，蒸去甲醇和过量的丙烯酸甲酯，得到黄色油状液体，即为2?6G PAMAM ;其中，甲醇的用量为PAMAM的40?60倍(v/w)，甲醇钠用量为PAMAM的0.06?0.08倍(v/w);丙烯酸甲酯的总用量为PAMAM的2?2.3倍(v/w)。
[0009]优选地，所述甲醇的用量为PAMAM的50倍(v/w)，甲醇钠用量为PAMAM的0.07倍(v/w);丙烯酸甲酯的总用量为PAMAM的2.14倍(v/w)。
[0010]所述的血小板特异性抗体为抗⑶41抗体。优选地，所述的抗⑶41抗体为抗⑶41
单克隆抗体。
[0011]2?6G PAMAM与血小板特异性抗体连接的方法为:取2?6G PAMAM,在室温下，力口Λ(4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐)、血小板特异性抗体，反应1.5?2.5小时，去除剩余试剂，再加入N-乙基顺丁烯二酰亚胺，反应0.5?1.5h，超过滤净化，即可；其中，2?6G PAMAM、(4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷_1_羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐)、血小板特异性抗体、N-乙基顺丁烯二酰亚胺与的用量比(v/w/w/w)为(30 ?50): (0.18 ?0.20): (0.003 ?0.005): (0.18 ?0.20)。[0012]优选地，所述2?6G PAMAM、4-(N_马来酰亚胺甲基)环己烷_1_羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐)与血小板特异性抗体的反应时间是2小时，加入N-乙基顺丁烯二酰亚胺后的反应时间是Ih;所述2?6G PAMAM、(4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷_1_羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐)、血小板特异性抗体、N-乙基顺丁烯二酰亚胺与的用量比(v/w/w/w)为40:0.192:0.004:0.192。
[0013]所述突光分子是波长为680nm的近红外光染料。
[0014]所述荧光分子标记的方法为:在2?6G PAMAM和血小板特异性抗体连接产物中，加入0.0005?0.0015倍重量(w/v)的荧光分子，暗光孵化0.5?1.5h，即可。优选地，所述荧光分子的用量为2?6G PAMAM和血小板特异性抗体连接产物的0.001倍(w/v);所述暗光孵化时间为Ih。
[0015]本发明血小板标记物的标记效果优良，可直接有效地鉴定血小板的聚集部位和聚集程度，进而检测临床血栓类疾病，同时，标记物的制备方法简单，成本低廉，具有良好的应用前景。
[0016]显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0017]以下通过实施例形式的【具体实施方式】，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
[0018]说明书附图
[0019]图1荧光显微镜显示标记的血小板，红色为本发明标记物标记的血小板
【具体实施方式】
[0020]名词解释:
[0021]sulfo-SMCC:(4_ (N-马来酰亚胺甲基)环己烷_1_羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐)；N-ethylmaleimide:N-乙基顺丁烯二酰亚胺
[0022]PAMAM:聚酰胺-胺型树枝状高分子
[0023]实验材料:
[0024]PAMAM、甲醇、甲醇钠、丙烯酸甲酯、sulfo-SMCC、抗CD41单克隆抗体、N-ethylmaleimide、波长为680nm的近红外光染料均为市售品。
[0025]实施例1本发明血小板标记物的制备
[0026](I) 2G ?6G PAMAM 的合成:
[0027]取1.4g PAMAM溶于70ml甲醇，加入IOOul甲醇钠，在氮气保护下逐滴加入3ml丙烯酸甲酯。搅拌72小时，蒸去甲醇和过量的丙烯酸甲酯，得到黄色油状液体，即为2G?6GPAMAM0
[0028](2) 2G?6G PAMAM与抗⑶41单克隆抗体的结合:
[0029]取步骤(I)制得的2G ?6G PAMAM40ul，在室温下，加入 sulfo_SMCC40ul (4.8mg/mL)、抗⑶41单克隆抗体20ul (200 μ g/ml),反应2小时，剩余试剂通过凝胶过滤去除；在2h以后，加入N-ethylmaleimide40ul (4.8mg/mL),反应lh,得到反应混合物；超过滤(MWC0100, 000)净化，PBS洗涤后，即得连接了抗⑶41单克隆抗体的2G?6G PAMAM。[0030](3)取步骤(2)得到的连接了抗⑶41单克隆抗体的2?6GPAMAM20 μ L，加入20 μ I与波长为680nm的近红外光染料(50 μ g/ml, Invitrogen),暗光孵化I小时，即得本发明血小板标记物。
[0031]实施例2本发明血小板标记物的制备
[0032](I) 2G ?6G PAMAM 的合成:
[0033]取1.4g PAMAM溶于56ml甲醇，加入84ul甲醇钠，在氮气保护下逐滴加入2.8ml丙烯酸甲酯。搅拌60小时，蒸去甲醇和过量的丙烯酸甲酯，得到黄色油状液体，即为2G?6G PAMAM0
[0034](2) 2G?6G PAMAM与抗⑶41单克隆抗体的结合:
[0035]取步骤(I)制得的2G ?6G PAMAM:30ul，在室温下，加入 sulfo_SMCC40ul (4.5mg/mL)、抗CD41单克隆抗体20ul (150 μ g/ml)，反应1.5小时,剩余试剂通过凝胶过滤去除；在2h以后，加入N-ethylmaleimide40ul (5.0mg/mL),反应0.5h,得到反应混合物；超过滤(MWC0100, 000)净化，PBS洗涤后，即得连接了抗⑶41单克隆抗体的2G?6G PAMAM。
[0036](3)取步骤(2)得到的连接了抗⑶41单克隆抗体的2G?6G PAMAM20yL，加入20 μ I与波长为680nm的近红外光染料(25 μ g/ml, Invitrogen)，暗光孵化0.5小时，即得本发明血小板标记物。
[0037]实施例3本发明血小板标记物的制备
[0038](I) 2G ?6G PAMAM 的合成:
[0039]取1.4g PAMAM溶于84ml甲醇，加入112ul甲醇钠，在氮气保护下逐滴加入3.22ml丙烯酸甲酯。搅拌60小时，蒸去甲醇和过量的丙烯酸甲酯，得到黄色油状液体，即为2G?6G PAMAM0
[0040](2) 2G?6G PAMAM与抗⑶41单克隆抗体的结合:
[0041]取步骤(I)制得的2G ?6G ΡΑΜΑΜδΟιιΙ，在室温下，加入 sulfo_SMCC40ul (5.0mg/mL)、抗CD41单克隆抗体20ul (250 μ g/ml)，反应2.5小时，剩余试剂通过凝胶过滤去除；在2h以后，加入N-ethylmaleimide40ul (5.0mg/mL),反应2h,得到反应混合物；超过滤(MWC0100, 000)净化，PBS洗涤后，即得连接了抗⑶41单克隆抗体的2G?6G PAMAM。
[0042](3)取步骤(2)得到的连接了抗⑶41单克隆抗体的2G?6G PAMAM20yL，加入20 μ I与波长为680nm的近红外光染料(75 μ g/ml, Invitrogen)，暗光孵化1.5小时，即得本发明血小板标记物。
[0043]以下根据具体的实验来说明本发明的有益效果:
[0044]实验例I本发明管腔内激活的血小板标记物对小鼠血小板的标记
[0045]1、实验方法
[0046]1.1小鼠血小板的分离
[0047]取小鼠静脉血，置于抗凝离心管中，静置30min后离心，800rpm李欣lOmin，上清液极为富含血小板的血浆。吸出上清液，置于干净试管中，3500rpm离心lOmin，弃去上清液，管底沉淀物为血小板，向试管中滴加50?100 μ I质量浓度为1%草酸铵溶液，以玻璃棒轻轻搅拌，再加入质量浓度为1%草酸铵溶液2?3ml，静置5min，使红细胞溶解。3500rpm离心IOmin,弃去伤情,加入血小板洗漆液(130mM NaCl, 6mM葡萄糖,9mM NaHCO3, IOmM朽1檬酸钠，IOmM Tris，3mM氯化钾，0.8mM磷酸二氢钾，0.9mM MgCl)并反复吹打，是成为血小板混悬液，3300rpm离心lOmin，弃去上清，加入少量血小板洗涤液并反复吹打使之成为混悬液。
[0048]将上述混悬液，用3.7%多聚甲醛固定在载玻片上，固定时间为30min。
[0049]1.2小鼠血小板的标记
[0050]取经多聚甲醛固定的血小板，在含lmg/ml BSA的PBS溶液中孵育30mins，PBS连续洗涤3次，在黑暗加入含20 μ I实施例1制备的本发明血小板标记物，孵化I小时。
[0051]1.3标记结果的观察
[0052]使用Leica DM750荧光倒置显微镜观察，所有图象在256X256像素和200毫秒的曝光时间条件下获得。图象使用Image J.软件分析。
[0053]2、结果
[0054]如图1所示，荧光倒置显微镜观察标记后的小鼠血小板呈红色，说明血小板被本发明血小板标记物标记。
[0055]实验结果说明，本发明血小板标记物可以有效标记血小板。
[0056]综上，本发明制备得到了能够有效标记血小板的标记物，可直接有效地鉴定血小板的聚集部位和聚集程度，进而检测临床血栓类疾病，同时，标记物的制备方法简单，成本低廉。
【权利要求】
1.一种血小板标记物，其特征在于:它是连接有血小板特异性抗体和荧光分子的2~6G PAMAM0
2.一种制备权利要求1所述血小板标记物的方法，其特征在于:其步骤如下:将2~6GPAMAM和血小板特异性抗体连接，再用荧光分子标记，即得连接了血小板特异性抗体和荧光分子的2~6G PAMAM。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于:所述2~6GPAMAM由下述方法制备: 将PAMAM溶于甲醇中，加入甲醇钠，在氮气保护下逐滴加入丙烯酸甲酯，搅拌60~80h，蒸去甲醇和过量的丙烯酸甲酯，得到黄色油状液体，即为2~6G PAMAM ； 其中，甲醇的用量为PAMAM的40~60倍(v/w)，甲醇钠用量为PAMAM的0.06~0.08倍(v/w);丙烯酸甲酯的总用量为PAMAM的2~2.3倍(v/w)。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于:所述甲醇的用量为PAMAM的50倍(v/w)，甲醇钠的用量为PAMAM的0.07倍(v/w);丙烯酸甲酯的总用量为PAMAM的2.14倍(v/w)。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于:所述的血小板特异性抗体为抗CD41抗体。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于:所述抗CD41抗体为抗CD41单克隆抗体。
7.根据权利要求2所述 的方法，其特征在于:所述2~6GPAMAM与血小板特异性抗体连接的方法为: 取2~6G ?4獻11，加入(4-0-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐)、血小板特异性抗体，反应1.5~2.5小时，去除剩余试剂，再加入N-乙基顺丁烯二酰亚胺，反应0.5~1.5h，超过滤净化，即可； 其中，2~6G PAMAM、(4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷_1_羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐)、血小板特异性抗体、N-乙基顺丁烯二酰亚胺与的用量比(v/w/w/w)为(30~50):(0.18 ~0.20): (0.003 ~0.005): (0.18 ~0.20)。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于: 所述2~6G PAMAM、4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷_1_羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐)与血小板特异性抗体的反应时间是2小时，加入N-乙基顺丁烯二酰亚胺后的反应时间是Ih ； 所述2~6G PAMAM、(4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷_1_羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐)、血小板特异性抗体、N-乙基顺丁烯二酰亚胺与的用量比(v/w/w/w)为40:0.192:0.004:0.192。
9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于:所述荧光分子是波长680nm的近红外光染料。
10.根据权利要求2所述的方法，其特征在于:所述荧光分子标记的方法为:在2~6GPAMAM和血小板特异性抗体连接产物中，加入0.0005~0.0015倍重量(w/v)的荧光分子，暗光孵化0.5~1.5h，即可； 优选地，所述荧光分子的用量为2~6G PAMAM和血小板特异性抗体连接产物的0.001倍(w/V);所述暗光孵化时间为lh。
【文档编号】G01N33/577GK103675288SQ201310731775
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年12月26日 优先权日:2013年12月26日
【发明者】吴剑波, 罗茂, 李蓉 申请人:泸州医学院