一种检测弱氧化低密度脂蛋白损伤小鼠肠系膜动脉内皮依赖性舒张功能及机制的方法
【专利摘要】本发明涉及一种检测弱氧化低密度脂蛋白损伤小鼠肠系膜动脉内皮依赖性舒张功能及机制的方法，采用离体微血管张力描记，透射电镜观察血管内皮超微结构。结果显示mmLDL致小鼠肠系膜动脉内皮细胞明显水肿、内弹力膜断裂，显著抑制EDHF介导的舒张；显著抑制NO介导的舒张；对PGI2介导的舒张功能无明显影响，mmLDL损伤内皮细胞超微结构；显著降低内皮依赖性舒张功能与NO-和EDHF途径受损有关。本发明方法灵敏高效，操作简单，且对环境友好。
【专利说明】一种检测弱氧化低密度脂蛋白损伤小鼠肠系膜动脉内皮依赖性舒张功能及机制的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种检测弱氧化低密度脂蛋白损伤小鼠肠系膜动脉内皮依赖性舒张功能及机制的方法。
【背景技术】
[0002]血管内皮细胞广泛分布于血管内层，具有多种生理功能，能分泌血管舒张因子和收缩因子，在调节血管张力和血管内环境稳态方面有重要作用。内皮细胞功能障碍是众多心血管疾病如动脉粥样硬化、高血压等疾病的发病共同环节和关键。内皮依赖性舒张(endothelium-dependent relaxation, EDR)主要由一氧化氮(nitric oxide,NO)-、前列环素(prostacyclin I2, PGI2)-、内皮衍生超极化因子(endothelium derivedhyperpolarizing factor, EDHF)三条途径构成[卜4]。EDHF途径介导血管舒张反应与细胞膜上的钙激活钾通道开放、促进钾离子外流有关。钙激活钾通道主要由小电导钙激活钾通道(smal 1-conductance calcium-activated potassium channel, SKca)、中电导?丐激活钾通道(intermediate-conductance calcium-activated potassium channel, IKca)和大电导?丐激活钾通道(big-conductance calcium-activated potassium channel,BKca)组成。经典的EDHF激活方式有两种，可以通过激活IKca和SKcaw开放引起超极化，继而激活下游微区信号通路1~8]和肌一内皮缝隙连接[9]进而引起血管平滑肌细胞舒张；另一种则不涉及内皮细胞超极化，但涉及到Ν0、ΗΝ0、环氧二十碳三烯酸(epoxyeicosatrienoic acids,EETs)等内皮源性因子的释放，它们直接作用于平滑肌细胞上的BKca等钾离子通道，从而引起血管平滑肌舒 张[1°]。有文献报道NO-，EDHF-，PGI2三条途径对机体不同部位血管张力的调节作用有明显差异[11’12]。
[0003]弱氧化低密度脂蛋白(minimallymodified low density lipoprotein, mmLDL)是指仅有脂质部分被氧化、载脂蛋白中赖氨酸残基结构未被破坏的LDL。mmLDL促进氧化型低密度脂蛋白大量产生，诱导血管内皮细胞损伤和平滑肌细胞的增殖，但机制还不明了。近期我们研究发现，mmLDL可以上调大鼠脑基底动脉[13]和冠状动脉[14]内皮素B受体(endothelin Breceptor,ETbR),在功能上表现为ETbR介导的收缩性增强。mmLDL对整体动物的阻力血管EDR和超微结构的影响尚不清楚。本实验考察尾静脉注射mmLDL对小鼠肠系膜动脉EDR的影响及作用机制，同时观察其对内皮细胞超微结构的影响。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于采用离体微血管张力描记技术，透射电镜观察血管内皮超微结构，提供一种研究mmLDL对小鼠肠系膜动脉EDR的影响及作用机制的方法。
[0005]材料与方法
[0006]1.1 主要试剂 mmLDL>5-轻色胺(5_hydroxytryptamine, 5-HT)、乙酰胆碱(acetylcholine, ACh)、L-Νω -硝基精氨酸甲酯(NG-nitro-L-arginine methyl ester,L-NAME)、吲哚美辛(indomethacin, Indo)、apamin、charybdotoxin (ChTX)、二甲基亚讽(dimethyl sulphoxide,DMS0)均为美国Sigma公司产品。除了 Indo用DMSO初溶外,其余均用Krebs液溶解,并且所有试剂在使用前均用Krebs液稀释到所需浓度。实验中使用的水为超纯水、其它化学试剂均为分析纯。
[0007]1.2 仪器 DMT610M 微小血管张力测定仪(Danish Myo Technology A/S, DMT,丹麦)、Powerlab生物信号采集和分析系统(埃德仪器有限公司，澳大利亚)、欧-卡XSP-C系列生物显微镜(重庆光电仪器有限公司)、显微手术解剖工具(World PrecisionInstruments, WPI，美国)、透射电子显微镜(TEM，H7650, HITACHI,日本)、电子天平(BP211D, Startorius公司)、微量移液器(Dragonmed，芬兰)、HH-2型电热恒温水浴锅(北京科伟永兴仪器有限公司)、SHZ-D循环水式真空泵(巩义予华仪器有限公司)、QL-90IVortex震荡混匀器(海门其林贝尔仪器制造有限公司)、LG冰箱、优普纯水机(成都优普纯水设备有限公司)。[0008]1.3 方法
[0009]1.3.1动物及实验设计
[0010]动物ICR小鼠(8-10周龄)，SPF级，(20-24) g，雌、雄各半，由西安交通大学医学院实验动物中心提供，动物使用许可证:SYXK(陕)2012-005。实验组以lmg/kg尾静脉注射mmLDL，第1次注射即开始计时，以后每12h重复一次，并分别于24h(0h，12h各注射一次)、48h (Oh, 12h, 24h, 36h 各注射一次)、72h (Oh, 12h, 24h, 36h, 48h, 60h 各注射一次)、96h (Oh,12h，24h，36h，48h，60h，72h，84h各注射一次)将小鼠颈部脱臼处死后观察mmLDL对血管EDR的影响。考察mmLDL对血管EDR影响的量效关系时，设立0.5mg/kg、lmg/kg、2rmg/kgmmLDL组。实验设2个对照组，分别为尾静脉注射生理盐水组或者LDL组。
[0011]1.3.2血管环收缩、舒张功能检测
[0012]小鼠脱白处死后，迅速取出含有肠系膜动脉的组织，浸入冷Na+-Krebs液(含mmol/L:NaC1119、NaHCO315, KC14.6、MgCl2L 2、NaH2PO4L 2、无水 CaCl2L 5 和葡萄糖 5.5)中，在显微镜下剔除肠系膜动脉周围的结缔组织，将处理好的血管剪切成约l_2mm长的圆筒环，并在显微镜下将动脉环套在DMT的两根金属丝上，其中一根连接张力换能器，另一根连接微调装置(可调节负荷张力)，通过张力换能器与PowerLab系统相连，记录血管收舒曲线。血管环置于充满Na+-Krebs液的37°C恒温水浴槽中，并持续接通混合气体(95% O2,5% CO2)，使氧饱和，pH维持在7.4[15]。保持静息张力为lmN，每隔20min更换一次Krebs液，平衡 1.5h。加 K+-Krebs 液(含 mmol/L:NaC160、NaHC0315、KC163.5,MgCl2L 2,NaH2PO4L 2、CaCl2L 5和葡萄糖5.5)检验血管环的收缩活性，冲洗3次后，重复上一步骤。当两次收缩高度大于ImN并且两次收缩幅度相差在10%以内者才可用于后续实验。
[0013]浓度累加法加入5-HT (10_9~10_4mol/L)，考察mmLDL对5-HT收缩血管功能的影响。预实验显示与对照组比较，mmLDL基本不影响5-HT诱导的收缩量效曲线，而且20 μ mol/L5-HT可以引起血管强而稳定的收缩达lh，我们选择5-HT为预收缩剂。20 μ mol/!^-肌预收缩血管环’浓度累加法加入八⑶^父川，~^)—4!^^/!)可诱导血管环产生EDR，当舒张值低于预收缩值的85%时，认为血管EDR受损。浓度累加法加入硝普钠(sodiumnitroprusside，SNP3X10-n~l(T5mol/L)诱导血管非内皮依赖性舒张，考察血管平滑肌的舒张功能。[0014]为考察mmLDL影响血管EDR的作用机制，我们使用了三条途径的拮抗剂。在浴槽中预先加入PGI2途径抑制剂Indo(10-5mol/L)、NO途径抑制剂L-NAME(ΙΟΛιοΙ/?、大电导和中电导钙激活钾通道抑制剂ChTX(5X10_8mOl/L)、小电导钙激活钾通道抑制剂apamin (10_6mol/L)可以完全阻断累加ACh引起的血管EDR[15_17]。在浴槽中预先分别加入通路抑制剂，孵育30min，加入5-HT预收缩，浓度累加法加入ACh，分别考察N0_、PGI2_和EDHF途径介导的内皮舒张功能；并考察EDHF途径中SKca，IKca和BKca介导的舒张功能。
[0015]1.4血管内皮完整性的形态学检查
[0016]mmLDL组和生理盐水组肠系膜动脉取出、分离后切开，立即放置在2.5%的戊二醛固定液中，并于4°C环境中固定6h。0.1M磷酸缓冲液洗涤，I %四氧化锇固定2h后洗涤、脱水；70%乙醇醋酸双氧铀块染色过夜后环氧丙烷置换；环氧树脂Epon812浸透、包埋，聚合后作半超薄切片1-2 μ，美兰染色后光学显微镜下定位，用透射电镜(日本日立Η-600)观察、拍照。
[0017]1.5统计学分析
[0018]用Rmax (最大松弛百分率)和PlCstl (产生一半最大松弛百分率时所需要ACh浓度的负对数)来描述EDR反应的特征性。
[0019]
【权利要求】
1.一种检测弱氧化低密度脂蛋白损伤小鼠肠系膜动脉内皮依赖性舒张功能及机制的方法，包括采用离体微血管张力描记和透射电镜观察血管内皮超微结构。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述方法包括以下具体步骤:动物实验、检测血管环收缩和舒张功能、检测血管内皮完整性以及统计学分析。
【文档编号】G01N33/50GK103940984SQ201410174962
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年4月29日 优先权日:2014年4月29日
【发明者】李洁, 陈根, 林杰, 王俊杰, 阳建军, 黄晓亮 申请人:李洁, 林杰, 王俊杰