野菊花uplc指纹图谱的构建方法
【专利摘要】本发明公开了一种野菊花UPLC指纹图谱的构建方法，包括如下步骤：粉碎野菊花药材后精密称定，加入甲醇，称重后超声，微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液；分别取绿原酸、木犀草苷、木犀草素和蒙花苷，精密称定，用甲醇溶解，即得对照品溶液；超高效液相色谱系统分别测定供试品溶液、对照品溶液，生成供试品溶液、对照品溶液的色谱图峰，进而生成野菊花UPLC指纹图谱。本发明涉及的野菊花UPLC指纹图谱的构建方法简单，易于操作，图谱分析能力大大增强，提高了结果的准确度，大大的提高了指纹图谱检测的稳定性和灵敏度。
【专利说明】野菊花UPLC指纹图谱的构建方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及指纹图谱的构建领域，特别是涉及一种野菊花UPLC指纹图谱的构建方法。
【背景技术】
[0002]目前，中草药在中医治疗领域中发挥着巨大的作用，而中草药特别是一些中药颗粒在服用过程中即为方便。而野菊花为菊科多年生草本植物野菊的头状花序，外形与菊花相似，野生于山坡草地、田边路旁。以色黄无梗、完整、气香、花未全开者为佳。野菊花含可广泛用于治疗疔疮痈肿、咽喉肿痛、风火赤眼、头痛眩晕等病症，同时又有很好的降压作用，可用于高血压病的辅助治疗，但是野菊花的质量标准控制却参差不齐。指纹图谱是作为控制中药质量均一性和稳定性的检测手段，但目前传统的野菊花药材HPLC指纹图谱检测所需时间太长，所需样品量较大，检测的精度及灵敏度不高。
【发明内容】
[0003]基于此，有必要提供一种灵敏度高、稳定性好的野菊花UPLC指纹图谱的构建方法。
[0004]一种野菊花UPLC指纹图谱的构建方法，包括如下步骤:
[0005](I)供试品溶液的制备:取野菊花药材，粉碎后精密称定，加入甲醇，称重后超声，过滤，取续滤液，即得供试品溶液，所述野菊花与甲醇的质量体积比为0.5:30-70 (g/mL)；
[0006](2)对照品溶液的制备:分别取绿原酸、木犀草苷、木犀草素和蒙花苷，精密称定，用体积分数为70-80%的甲醇溶液溶解，即得对照品溶液，所述绿原酸、木犀草苷、木犀草素、蒙花苷的浓度分别为 5-20 μ g/mL、10-30 μ g/mL,2-10 μ g/mL 和 20-45 μ g/mL ；
[0007](3)野菊花UPLC指纹图谱的测定:用UPLC系统分别测定供试品溶液、对照品溶液，生成供试品溶液、对照品溶液的色谱图峰，以对照品溶液的色谱图峰为参照物，供试品溶液的色谱图峰与参照物比照得出相对保留时间与相对保留面积，生成野菊花UPLC指纹图谱；所述UPLC系统的条件为:
[0008]流速:0.3?0.5mL.min—1 ;检测波长:220_380nm ;柱温:20?40°C;线性梯度洗脱；流动相为:流动相A为乙腈，流动相B为体积分数为0.02%的磷酸水溶液；线性梯度洗脱的条件为:0 — 27min，流动相为8-12%乙腈一35-40%乙腈。
[0009]在其中一个实施例中，步骤(3)所述UPLC的条件为流速:0.4mL.mirT1 ;检测波长:360nm ;柱温:30°C。
[0010]在其中一个实施例中，所述线性梯度洗脱的条件为:0 — 27min，流动相为10%乙腈一37%乙腈。
[0011]在其中一个实施例中，步骤(I)所述野菊花与甲醇的质量体积比为0.5:45-55 (g/mL) ο
[0012]在其中一个实施例中，步骤(2)所述所述绿原酸、木犀草苷、木犀草素、蒙花苷的浓度分别为 10-15 μ g/mL、20_23 μ g/mL>4-6 μ g/mL 和 38-40 μ g/mL。
[0013]在其中一个实施例中，包括如下步骤:
[0014](I)供试品溶液的制备:取野菊花药材，粉碎后精密称定，加入甲醇，称重后超声，过滤，取续滤液，即得供试品溶液，所述野菊花与甲醇的质量体积比为0.5:50 (g/mL)；
[0015](2)对照品溶液的制备:分别取绿原酸、木犀草苷、木犀草素和蒙花苷，精密称定，用体积分数为70-80%的甲醇溶液溶解，即得对照品溶液，所述绿原酸、木犀草苷、木犀草素、蒙花苷的浓度分别为12、22.6、5.6和39.3 μ g/mL ；
[0016](3)野菊花UPLC指纹图谱的测定:用UPLC系统分别测定供试品溶液、对照品溶液，生成供试品溶液、对照品溶液的色谱图峰，以对照品溶液的色谱图峰为参照物，供试品溶液的色谱图峰与参照物比照得出相对保留时间与相对保留面积，生成野菊花UPLC指纹图谱；所述UPLC系统的条件为:
[0017]流速:0.—L.min—1 ;检测波长:360nm ;柱温:30°C ;线性梯度洗脱；流动相为:流动相A为乙腈，流动相B为体积分数为0.02%的磷酸水溶液；线性梯度洗脱的条件为:
O—27min,流动相为10%乙腈一37%乙腈。
[0018]在其中一个实施例中，步骤(I)所述的过滤使用微孔滤膜，所述微孔滤膜的尺寸为 0.2-0.25 μ m。
[0019]在其中一个实施例中，步骤(I)所述超声的条件为功率150-170W，频率55_60kHz。
[0020]本发明涉及的一种野菊花UPLC指纹图谱的构建方法具有以下有益效果:
[0021](I)本发明采用UPLC (超高效液相色谱系统)，首次将UPLC系统引进指纹图谱的测定领域，确定了制备供试品溶液和对照品溶液，及超高效液相色谱仪的色谱条件的最优参数，使得图谱分析能力大大增强，提高了结果的准确度。
[0022](2)本发明经发明人的大量实验和研究，得出野菊花指纹图谱的检测方法，并确定绿原酸、木犀草苷、木犀草素、蒙花苷作为对照品溶液，进一步地确定出各对照品溶液的最优选的浓度分别为12、22.6,5.6和39.3 μ g/mL ;同时确定出野菊花指纹图谱的检测所采用的UPLC系统的参数，并进一步地确定出最优参数。
[0023](3)本发明所述的野菊花UPLC指纹图谱的检测方法所需的样品量较少，远远少于现有技术要求的量，大大的提高了指纹图谱检测的稳定性和灵敏度。
[0024](4)本发明所述的野菊花UPLC指纹图谱的检测方法简单，UPLC的线性梯度洗脱的条件简单，便于操作，也进一步的节省检测时间。
【专利附图】
【附图说明】
[0025]图1为实施例6中野菊花药材共有峰色谱图；
[0026]图2为实施例6中11批野菊花药材UPLC指纹图谱；
[0027]图3为实施例6中对照品的UPLC色谱图。
【具体实施方式】
[0028]以下将结合实施例对本发明做进一步的说明。且各实施例中使用到的试剂和器材如下:
[0029]1.仪器[0030]KQ-100B型超声波清洗器购自昆山超声仪器有限公司JA51002型电子分析天平购自岛津公司；WatersAcquityUPLCH_Class超高效液相色谱系统、Empower工作站含四元梯度泵、自动进样器、紫外检测器均购自Waters公司，色谱柱为ACQUITYUPLCBEHC18 (2.1mmX 100mm, 1.7 μ m)。
[0031]试剂
[0032]甲醇(色谱纯，TEDIA公司)，乙腈(色谱纯，TEDIA公司)，水为哇哈哈纯净水，磷酸(色谱纯,北京化工厂)。
[0033]3.对照品及样品
[0034]对照品木犀草苷、木犀草素和芹菜素，购于成都植标化纯生物技术有限公司，供含量测定用，批号分别为 PCS0625-lotl20411、PCS0626_lotl20316 和 PCS0751_lotl20425 ；对照品绿原酸和蒙花苷购于中国食品药品检定研究院，批号分别为0753-200111和111528-200202。不同产地的野菊花药材11批，均由湖南中医药大学生药学教研室肖冰梅教授鉴定为菊料植物野菊(Chrysanthemum indicumL.)的干燥头状花序,具体信息见表1。
[0035]表1野菊花药材来源
[0036]
【权利要求】
1.一种野菊花UPLC指纹图谱的构建方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)供试品溶液的制备:取野菊花药材，粉碎后精密称定，加入甲醇，称重后超声，过滤，取续滤液，即得供试品溶液，所述野菊花与甲醇的质量体积比为0.5:30-70 (g/mL)； (2)对照品溶液的制备:分别取绿原酸、木犀草苷、木犀草素和蒙花苷，精密称定，用体积分数为70-80%的甲醇溶液溶解，即得对照品溶液，所述绿原酸、木犀草苷、木犀草素、蒙花苷的浓度分别为 5-20 μ g/mL、10-30 μ g/mL,2-10 μ g/mL 和 20-45 μ g/mL ； (3)野菊花UPLC指纹图谱的测定:用UPLC系统分别测定供试品溶液、对照品溶液，生成供试品溶液、对照品溶液的色谱图峰，以对照品溶液的色谱图峰为参照物，供试品溶液的色谱图峰与参照物比照得出相对保留时间与相对保留面积，生成野菊花UPLC指纹图谱；所述UPLC系统的条件为: 流速:0.3~0.5mL.min—1 ;检测波长:220-380nm ;柱温:20~40°C ;线性梯度洗脱；流动相为:流动相A为乙腈，流动相B为体积分数为0.02%的磷酸水溶液；线性梯度洗脱的条件为:0 — 27min,流动相为5-15 乙臆一35-60 %乙臆。
2.根据权利要求1所述的野菊花UPLC指纹图谱的构建方法，其特征在于，步骤(3)所述UPLC的条件为流速:0.4mL.min—1 ;检测波长:360nm ;柱温:30°C。
3.根据权利要求1所述的野菊花UPLC指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述线性梯度洗脱的条件为:0 — 27min，流动相为10%乙腈一37%乙腈。
4.根据权利要求1所述的野菊花UPLC指纹图谱的构建方法，其特征在于，步骤(1)所述野菊花与甲醇的质量体积比为0.5:45-55 (g/mL)。
5.根据权利要求1所述的野菊花UPLC指纹图谱的构建方法，其特征在于，步骤(2)所述所述绿原酸、木犀草苷、木犀草素、蒙花苷的浓度分别为10-15yg/mL、20-23yg/mL、4-6 μ g/mL 和 38-40 μ g/mL。
6.根据权利要求1-5任一项所述的野菊花UPLC指纹图谱的构建方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)供试品溶液的制备:取野菊花药材，粉碎后精密称定，加入甲醇，称重后超声，过滤，取续滤液，即得供试品溶液，所述野菊花与甲醇的质量体积比为0.5:50 (g/mL)； (2)对照品溶液的制备:分别取绿原酸、木犀草苷、木犀草素和蒙花苷，精密称定，用体积分数为70-80%的甲醇溶液溶解，即得对照品溶液，所述绿原酸、木犀草苷、木犀草素、蒙花苷的浓度分别为12、22.6、5.6和39.3 μ g/mL ； (3)野菊花UPLC指纹图谱的测定:用UPLC系统分别测定供试品溶液、对照品溶液，生成供试品溶液、对照品溶液的色谱图峰，以对照品溶液的色谱图峰为参照物，供试品溶液的色谱图峰与参照物比照得出相对保留时间与相对保留面积，生成野菊花UPLC指纹图谱；所述UPLC系统的条件为: 流速:0.4mL.HiirT1 ;检测波长:360nm ;柱温:30°C ;线性梯度洗脱；流动相为:流动相A为乙腈，流动相B为体积分数为0.02%的磷酸水溶液；线性梯度洗脱的条件为:0 — 27min,流动相为10%乙腈一37%乙腈。
7.根据权利要求1~5任一项所述的野菊花UPLC指纹图谱的构建方法，其特征在于，步骤(1)所述的过滤使用微孔滤膜，所述微孔滤膜的尺寸为0.2-0.25 μ m。
8.根据权利要求1~5任一项所述的野菊花UPLC指纹图谱的构建方法，其特征在于，步骤(1)所述 超声的条件为功率150-170W，频率55-60kHz。
【文档编号】G01N30/86GK103926355SQ201410189404
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2014年5月6日 优先权日:2014年5月6日
【发明者】姚江雄, 许招懂, 蒋莉娟, 方铁铮, 黎志坚, 林丽美 申请人:广州白云山星群(药业)股份有限公司