一种黄曲霉素b1快速检测试纸条及其制备方法与应用的制作方法
【专利摘要】一种黄曲霉素B1快速检测试纸条及其制备方法与应用，本发明之黄曲霉素B1快速检测试纸条，由以下方法制备而成：（1）抗黄曲霉素B1单抗的制备和纯化；（2）胶体金溶液的制备；（3）胶体金标记抗体；（4）喷金；（5）硝酸纤维素膜上包被C,T线；（6）黄曲霉素B1胶体金免疫层析快速检测试纸条的组装。 本发明还包括所述黄曲霉素B1快速检测试纸条的应用。本发明之黄曲霉素B1快速检测试纸条，可大规模地对粮食及其加工产品黄曲霉素毒素进行快速、方便的检测。
【专利说明】一种黄曲霉素BI快速检测试纸条及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种黄曲霉素BI快速检测试纸条及其制备方法与应用，尤其是涉及一种黄曲霉素BI胶体金免疫层析快速检测试纸条及其制备方法与应用。
【背景技术】
[0002]黄曲霉毒素Bl(aflatoxin BI称AFB1)是真菌的次级代谢产物，主要是由黄曲霉(Aspergillus flavus)、寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)和特曲霉(Aspergillusnomius)产生。它易天然存在于花生、棉籽、玉米、小麦和稻米等农作物中，具有强烈的毒性和致癌性；它是目前化学致癌物中最强的一种致癌诱变剂，其毒性比氰化钾强10倍，其致癌性比二甲基亚硝胺强75倍。1993年黄曲霉毒素被世界卫生组织(WHO)的癌症研究机构划定为I类致癌物，其作用的靶器官主要为肝脏。我国国标中规定，大米中的黄曲霉素含量不得高于10 μ g/kg。
[0003]目前，黄曲霉素BI的检测方法主要有:薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)、酶联免疫吸附法(ELISA)。这类方法虽然检测精度较高，但存在仪器昂贵，检测成本高，操作不便捷等问题。
【发明内容】
[0004]本发明要解决的技术问题是，克服现有技术的不足，提供一种黄曲霉素BI快速检测试纸条及其制备方法与应用，可大规模地对粮食及其加工产品黄曲霉素毒素进行快速、方便的检测。
[0005]本发明解决其技术问题采用的技术方案是:
本发明之黄曲霉素BI快速检测试纸条，由以下方法制备而成:
(1)抗黄曲霉素BI单抗的制备和纯化:
用黄曲霉素BI偶联牛血清蛋白(AFB1-BSA)，混合弗氏不完全佐剂免疫BALB/c小鼠，取免疫小鼠脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞融合，筛选出稳定分泌抗镉离子单克隆抗体的阳性细胞株并扩大培养，注射细胞进小鼠体内诱生腹水；
取2-4 ml黄曲霉毒素BI (AFBl)腹水，加入相当于腹水体积1.8 — 2.2倍的摩尔浓度为
0.03-0.08 mol/L的pH 4.5-5.5的乙酸缓冲液，用摩尔浓度为0.08-0.12mol/L的HCl调pH至4.0-5.0，于室温搅拌下逐滴加入辛酸，所述辛酸的加入量为每毫升稀释前的腹水加入30 - 40 μ I 辛酸，搅拌 20-40min，2_8°C静置 l_2h，然后在 2_8°C下，在 8000_12000r/min 转速下离心20-40min，取上清液；上清液经砂芯漏斗过滤后加入相当于上清液体积1/20-1/5的PH为7.0-7.5的磷酸盐缓冲液(PBS)，在2-8°C冷水浴下加入硫酸铵，使硫酸铵的终浓度为 0.25-0.30 g/ml (优选浓度为 0.277 g/ml )，静置 l_2h，2_8°C、8000_12000r/min 离心10-20min,弃上清液，将沉淀溶于摩尔浓度为0.008-0.012mol/L的PBS溶液中进行透析:2-8°C静置过夜，8000-12000r/min离心10_20min，弃沉淀；得上清液抗黄曲霉素BI单抗；
(2)胶体金溶液的制备:取质量浓度为0.008-0.012%的氯金酸水溶液100ml，搅拌加热至沸腾，一次性快速加入质量浓度为0.8-1.2%的柠檬酸三钠水溶液2.0-2.5ml，继续搅拌加热0.5-24h，直至溶液呈酒红色，室温冷却，得到含有粒径为20 - 40nm的胶体金颗粒的胶体金溶液，胶体金溶液4°C保存；
(3)胶体金标记抗体:取步骤(2)所得胶体金溶液90- 110ml，用摩尔浓度为0.2 一
0.311101/1的碳酸钾溶液将其？!1值调至8.0 — 8.5 ;将步骤(1)所得抗黄曲霉素BI单抗
1.6mg加入到胶体金溶液中，搅拌均匀，静置0.5 — 24小时(优选2 — 3小时)；逐滴加入质量浓度为8 - 12%的无菌牛血清蛋白10 - 12ml，搅拌0.5 一 24h，4°C 一 30°C静置过夜；将标记后的胶体金溶液于12000 — 14000r/min离心30 — 50min,弃上清液,往所得沉淀中加入摩尔浓度为0.01 - 0.02mol/L的磷酸盐缓冲液3 — 5ml重悬，得到抗黄曲霉素BI单抗标记的胶体金溶液；
(4)喷金:将步骤(3)所得抗黄曲霉素BI单抗标记的胶体金溶液按2— 10μ Ι/cm的喷量喷在结合垫上，37°C — 45°C抽风烘干，时间为5 - 24h，得到喷金后的结合垫；
(5)硝酸纤维素膜上包被C，T线:在硝酸纤维素膜上包被C线和T线，其中C线为质控线，包被羊抗鼠免疫球蛋白G，浓度为0.2 — 1.5mg/ml ;T线为检测线，包被偶联抗原黄曲霉素BI偶联牛血清蛋白(AFB1-BSA)，浓度为0.2-0.5mg/ml ；37°C- 45°C抽风烘干，时间为2 - 24h ;得到包被后的硝酸纤维素膜；
(6)黄曲霉素BI胶体金免疫层析快速检测试纸条的组装:将聚氯乙烯底板、样品垫、步骤(4)所得喷金后的结合垫、步骤(5)所得包被后的硝酸纤维素膜和吸水纸组装，切割成条，得到黄曲霉素BI胶体金免疫层析快速检测试纸条；
组装方式如下:以聚氯乙烯为底部支撑，将样品垫，喷金后的结合垫、包被后的硝酸纤维素膜和吸水纸以依次连接的方式粘贴在聚氯乙烯底板上制成；其中样品垫和吸水纸位于两端，包被后的硝酸纤维素膜的两端分别位于结合垫和吸水纸的下面，结合垫的一端设置于样品垫的下面，另一端设置于包被后的硝酸纤维素膜的上面；
所述包被后的硝酸纤维素膜上设置检测T线和质控C线，其中检测线T线靠近样品垫一端；所述结合垫和样品垫是将聚酯膜经过混合液浸泡5 - 24h，取出后于37 - 45°C抽风烘干得到；所述混合液为摩尔浓度为0.01 - 0.02mol/L的磷酸盐缓冲液，质量体积比为3g - 6g/ (100ml磷酸盐缓冲液)的非离子表面活性剂(所述非离子表面活性剂优选为脂肪醇聚氧乙烯醚、烷基酚聚氧乙烯醚或脂肪酸聚乙二醇酯)、体积比为Iml - 4ml/ (100ml磷酸盐缓冲液)的吐温20和质量体积比为5g - 20g/ (100ml磷酸盐缓冲液)聚乙二醇6000组成的，所述磷酸盐缓冲液的PH值为7.0 — 7.5。
[0006]本发明之黄曲霉素BI快速检测试纸条的应用，包括以下步骤:
(1)样品检测液的制备:准确称量5g大米或者米制品，研磨粉碎，加入提取液20ml，每100mL提取液由60ml甲醇、40ml蒸馏水和4g氯化钠组成，在振荡器上震荡3min，5000转/分离心5min,吸取上清液15ml真空干燥至2.5ml,用0.01mol/L的PBS稀释一倍，定容至5ml即为样品待检测液；
(2)用滴管吸取步骤(1)所得待检样品溶液80- 100μΙ，滴加于试纸条的样品垫上，滴加样品后开始计时；
(3)在滴加样品后3— 5min读取结果，读取时，将试纸条以样品垫一端向下的方式垂直置于观察者正面； (4)结果判断:C线显示为红色线条，当T线显色，结果为阴性，待测样品中的黄曲霉素BI浓度小于50ng/ml ;当T线不显色，结果为阳性，待测样品溶液中的黄曲霉素BI浓度大于50ng/ml ;即待测大米或米制品中黄曲霉素超过国家标准10 μ g/kg的标准。
[0007]本发明之黄曲霉素BI快速检测试纸条，可大规模地对粮食及其加工产品黄曲霉素毒素进行快速、方便的检测。
【具体实施方式】
[0008]以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。
[0009]实施例1
本实施例之黄曲霉素BI快速检测试纸条，其制备方法，包括以下步骤:
(1)抗黄曲霉素BI单抗的制备和纯化:
用黄曲霉素BI偶联牛血清蛋白(AFB1-BSA );选取8周龄BALB/C雄性小鼠，用AFB1-BSA纯品进行5次免疫，初次免疫，每只小鼠免疫剂量为100 μ g，与等量弗氏不完全佐剂充分乳化进行背部皮下多点注射；此后每间隔两周免疫一次每次每只免疫剂量100 μ g与等量弗氏不完全佐剂混匀后采用相同方式免疫，进行细胞融合前3天，再加强免疫一次，剂量为120 μ g，腹腔直接注射；
将SP2/0细胞复苏后，注射到小鼠颈部，IOd后，小心取出瘤组织，用玻璃匀浆器匀浆至混悬液(无可见块状),缓慢加入到等体积的淋巴细胞分离液上层，1700r/min离心lOmin、中间层细胞即为实体瘤细胞悬液，两次离心洗涤后备用；
将未经免疫的小鼠处死后，75%的酒精体表消毒，小心注射IOmL HAT不完全培养液〔不含有次黄嘌呤(H)、氨基蝶呤(A)、胸苷(T)和甘氨酸的培养基〕于其腹腔内，避免针头刺到内脏，并反复洗涤腹腔，将巨噬细胞尽可能完全取出，然后无菌取出脾脏，匀浆后与巨噬细胞悬液混合，离心洗涤2次后作为饲养细胞备用；将加强免疫后的小鼠无菌取出脾脏后经玻璃匀浆器匀浆制备出免疫脾细胞悬液，离心洗涤后备用；
取I X IO7个已在细胞瓶中调整好状态的SP2/0细胞与I X IO8正常脾细胞混合离心，在37°C恒温水浴下，在90S内缓慢加入0.8mL聚乙二醇(PEG) 1450，反应60S后，立即加入37°C温浴的不完全培养液,开始Imin内缓慢加入ImL,然后第2min,第3min,第4min内分别加入4mL，15mL，25mL离心后，去掉上清，加入含有饲养细胞的1% HAT完全培养液重悬；
于BALB/C小鼠腹腔内注射0.5mL不完全福氏佐剂，24h后注射0.5mL含106个杂交瘤细胞的不完全培养液，12d后见小鼠腹部膨胀收集腹水；
取2 ml黄曲霉毒素BI (AFBl)腹水，加入4ml 0.06 mol/L pH 5.0的乙酸缓冲液，用
0.lmol/L的HCl调pH至4.5，于室温搅拌下逐滴加入辛酸，所述辛酸的加入量为每毫升稀释前的腹水加入33 μ I辛酸，搅拌30min，4°C静置2h，4°C 10000r/min离心30min，取上清液；上清液经砂芯漏斗过滤后加入相当于上清液1/10体积的PBS(磷酸盐缓冲液)(pH7.4)，在4°C冷水浴下加入硫酸铵，使硫酸铵的终浓度为0.277 g/ml，静置2h，4°C、10000r/min离心15min，弃上清液，将沉淀溶于0.01mol/L的PBS溶液中进行透析:4°C静置过夜，IOOOOr/min离心15min,弃沉淀；得上清液抗黄曲霉素BI单抗；
(2)胶体金溶液的制备:取质量浓度为0.01%的氯金酸水溶液100ml，搅拌加热至沸腾，一次性快速加入质量浓度为1%的柠檬酸三钠水溶液2.2ml，继续搅拌加热2h，直至溶液呈酒红色，室温冷却，得到含有粒径为20 - 40nm的胶体金颗粒的胶体金溶液，胶体金溶液4°C保存；
(3)胶体金标记抗体:取步骤(2)所得胶体金溶液100ml，用摩尔浓度为0.25mol/L的碳酸钾溶液将其PH值调至8.5 ;将步骤(I)所得抗黄曲霉素BI单抗1.6mg加入到胶体金溶液中，搅拌均匀，静置2小时；逐滴加入质量浓度为10%的无菌牛血清蛋白Ilml，搅拌2h，25°C静置过夜；将标记后的胶体金溶液于13000r/min离心40min，弃去上清液，往所得沉淀中加入摩尔浓度0.015mol/L的磷酸盐缓冲液4ml重悬，得到抗黄曲霉素BI单抗标记的胶体金溶液；
(4)喷金:将步骤(3)所得抗黄曲霉素BI单抗标记的胶体金溶液按2— 10μ Ι/cm的喷量喷在结合垫上，37°C抽风烘干，时间为24h，得到喷金后的结合垫；
(5)硝酸纤维素膜上包被C，T线:在硝酸纤维素膜上包被C线和T线，其中C线为质控线，包被羊抗鼠免疫球蛋白G，浓度为0.5mg/ml ；T线为检测线，包被偶联抗原黄曲霉素BI偶联牛血清蛋白(AFB1-BSA)，浓度为0.3mg/ml ;45°C抽风烘干，时间为12h ;得到包被后的硝酸纤维素膜；
(6)黄曲霉素BI胶体金免疫层析快速检测试纸条的组装:将聚氯乙烯底板、样品垫、步骤(4)所得喷金后的结合垫、步骤(5)所得包被后的硝酸纤维素膜和吸水纸组装，切割成条，得到黄曲霉素BI胶体金免疫层析快速检测试纸条；
组装方式如下:以聚氯乙烯为底部支撑，将样品垫，喷金后的结合垫、包被后的硝酸纤维素膜和吸水纸以依次连接的方式粘贴在聚氯乙烯底板上制成；其中样品垫和吸水纸位于两端，包被后的硝酸纤维素膜的两端分别位于结合垫和吸水纸的下面，结合垫的一端设置于样品垫的下面，另一端设置于包被后的硝酸纤维素膜的上面；
所述包被后的硝酸纤维素膜上设置检测T线和质控C线，其中检测线T线靠近样品垫一端；所述结合垫和样品垫是将聚酯膜经过混合液浸泡24h，取出后于37°C抽风烘干得到；所述混合液为摩尔浓度为0.015mol/L的磷酸盐缓冲液，质量体积比为3g/ (100ml磷酸盐缓冲液)的非离子表面活性剂脂肪醇聚氧乙烯醚、体积比为2ml/ (100ml磷酸盐缓冲液)的吐温20和质量体积比为IOg/ (100ml磷酸盐缓冲液)聚乙二醇6000组成的，所述磷酸盐缓冲液的PH值为7.5。
[0010]本实施例之黄曲霉素BI快速检测试纸条的应用，包括以下步骤:
(1)样品检测液的制备:准确称量5g大米或者米制品，研磨粉碎，加入提取液20ml(每IOOml提取液由60ml甲醇，40ml蒸馏水和4g氯化钠组成)，在振荡器上震荡3min，5000转/分离心5min,吸取上清液15ml真空干燥至2.5ml,用0.01mol/L的PBS稀释一倍，定容至5ml即为样品待检测液；
(2)用滴管吸取步骤(I)所得待检样品溶液80— 100 μ 1，滴加于试纸条的样品垫上，滴加样品后开始计时；
(3)在滴加样品后3— 5min读取结果，读取时，将试纸条以样品垫一端向下的方式垂直置于观察者正面；
(4)结果判断:C线显示为红色线条，当T线显色，结果为阴性，待测样品中的黄曲霉素BI浓度小于50ng/ml ;当T线不显色，结果为阳性，待测样品溶液中的黄曲霉素BI浓度大于50ng/ml ;即待测大米或米制品中黄曲霉素超过国家标准10 μ g/kg的标准。
【权利要求】
1.一种黄曲霉素BI快速检测试纸条，其特征在于，按照以下方法制备而成: (1)抗黄曲霉素BI单抗的制备和纯化: 用黄曲霉素BI偶联牛血清蛋白，混合弗氏不完全佐剂免疫BALB/c小鼠，取免疫小鼠脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞融合，筛选出稳定分泌抗镉离子单克隆抗体的阳性细胞株并扩大培养，注射细胞进小鼠体内诱生腹水； 取2-4 ml黄曲霉毒素BI腹水，加入相当于腹水体积1.8 — 2.2倍的摩尔浓度为0.03-0.08 mol/L的pH 4.5-5.5的乙酸缓冲液，用摩尔浓度为0.08-0.12mol/L的HCl调pH至4.0-5.0，于室温搅拌下逐滴加入辛酸，所述辛酸的加入量为每毫升稀释前的腹水加入30 - 40 μ I 辛酸，搅拌 20-40min，2-8°C静置 l_2h，然后在 2_8°C下，在 8000-12000r/min 转速下离心20-40min，取上清液；上清液经砂芯漏斗过滤后加入相当于上清液体积1/20-1/5的PH为7.0-7.5的磷酸盐缓冲液，在2-8°C冷水浴下加入硫酸铵，使硫酸铵的终浓度为0.25-0.30 g/ml，静置 l_2h，2_8°C、8000_12000r/min 离心 10_20min，弃上清液，将沉淀溶于摩尔浓度为0.008-0.012mol/L的PBS溶液中进行透析:2_8°C静置过夜，8000_12000r/min离心10-20min,弃沉淀；得上清液抗黄曲霉素BI单抗； (2)胶体金溶液的制备:取质量浓度为0.008-0.012%的氯金酸水溶液100ml，搅拌加热至沸腾，一次性快速加入质量浓度为0.8-1.2%的柠檬酸三钠水溶液2.0 — 2.5ml，继续搅拌加热0.5-24h，直至溶液呈酒红色，室温冷却，得到含有粒径为20 - 40nm的胶体金颗粒的胶体金溶液，胶体金溶液4°C保存； (3)胶体金标记抗体:取步骤(2)所得胶体金溶液90- 110ml，用摩尔浓度为0.2 一0.311101/1的碳酸钾溶液将其？!1值调至8.0 — 8.5 ;将步骤(1)所得抗黄曲霉素BI单抗1.6mg加入到胶体金溶液中，搅拌均匀，静置0.5 — 24小时；逐滴加入质量浓度为8 一 12%的无菌牛血清蛋白10 - 12ml，搅拌0.5 — 24h，4°C 一 30°C静置过夜；将标记后的胶体金溶液于12000 - 14000r/min离心30 — 50min，弃上清液，往所得沉淀中加入摩尔浓度为0.01 - 0.02mol/L的磷酸盐缓冲液3 — 5ml重悬，得到抗黄曲霉素BI单抗标记的胶体金溶液； (4)喷金:将步骤(3)所得抗黄曲霉素BI单抗标记的胶体金溶液按2— 10 μ 1/cm的喷量喷在结合垫上，37°C — 45°C抽风烘干，时间为5 - 24h，得到喷金后的结合垫； (5)硝酸纤维素膜上包被C，T线:在硝酸纤维素膜上包被C线和T线，其中C线为质控线，包被羊抗鼠免疫球蛋白G，浓度为0.2 — 1.5mg/ml ;T线为检测线，包被偶联抗原黄曲霉素BI偶联牛血清蛋白，浓度为0.2-0.5mg/ml ;37°C — 45°C抽风烘干，时间为2 — 24h ;得到包被后的硝酸纤维素膜； (6)黄曲霉素BI胶体金免疫层析快速检测试纸条的组装:将聚氯乙烯底板、样品垫、步骤(4)所得喷金后的结合垫、步骤(5)所得包被后的硝酸纤维素膜和吸水纸组装，切割成条，得到黄曲霉素BI胶体金免疫层析快速检测试纸条； 组装方式如下:以聚氯乙烯为底部支撑，将样品垫，喷金后的结合垫、包被后的硝酸纤维素膜和吸水纸以依次连接的方式粘贴在聚氯乙烯底板上制成；其中样品垫和吸水纸位于两端，包被后的硝酸纤维素膜的两端分别位于结合垫和吸水纸的下面，结合垫的一端设置于样品垫的下面，另一端设置于包被后的硝酸纤维素膜的上面； 所述包被后的硝酸纤维素膜上设置检测T线和质控C线，其中检测线T线靠近样品垫一端；所述结合垫和样品垫是将聚酯膜经过混合液浸泡5 - 24h，取出后于37 - 45°C抽风烘干得到；所述混合液为摩尔浓度为0.01 - 0.02mol/L的磷酸盐缓冲液，质量体积比为3g — 6g/ (100mL磷酸盐缓冲液)的非离子表面活性剂、体积比为Iml — 4ml/ (100mL磷酸盐缓冲液)的吐温20和质量体积比为5g - 20g/ (100mL磷酸盐缓冲液)聚乙二醇6000组成的，所述磷酸盐缓冲液的PH值为7.0 — 7.5。
2.根据权利要求1所述的黄曲霉素BI快速检测试纸条，其特征在于，步骤(3)中，将抗黄曲霉素BI单抗1 .6mg加入到胶体金溶液中，搅拌均匀，静置2 — 3小时。
3.根据权利要求1或2所述的黄曲霉素BI快速检测试纸条，其特征在于，步骤(6)中，所述非离子表面活性剂为脂肪醇聚氧乙烯醚、烷基酚聚氧乙烯醚或脂肪酸聚乙二醇酯。
4.一种如权利要求1 一 3之一所述黄曲霉素BI快速检测试纸条的应用，包括以下步骤: (1)样品检测液的制备:准确称量5g大米或者米制品，研磨粉碎，加入提取液20ml，每100mL提取液由60ml甲醇、40ml蒸馏水和4g氯化钠组成，在振荡器上震荡3min，5000转/分离心5min,吸取上清液15ml真空干燥至2.5ml,用0.01mol/L的PBS稀释一倍，定容至5ml即为样品待检测液； (2)用滴管吸取步骤(1)所得待检样品溶液80- 100μΙ，滴加于试纸条的样品垫上，滴加样品后开始计时； (3)在滴加样品后3— 5min读取结果，读取时，将试纸条以样品垫一端向下的方式垂直置于观察者正面； (4)结果判断:C线显示为红色线条，当T线显色，结果为阴性，待测样品中的黄曲霉素BI浓度小于50ng/ml ;当T线不显色，结果为阳性，待测样品溶液中的黄曲霉素BI浓度大于50ng/ml ;即待测大米或米制品中黄曲霉素超过国家标准10 μ g/kg的标准。
【文档编号】G01N33/569GK104007255SQ201410208109
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2014年5月16日 优先权日:2014年5月16日
【发明者】刘博 , 林亲录, 杨涛, 罗非君, 孙术国, 肖华西, 汪龙 申请人:中南林业科技大学