一种羊棘球蚴elisa抗体检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种羊棘球蚴ELISA抗体检测试剂盒，所述检测试剂盒包括羊棘球蚴重组抗原Eg95预包被酶标板、样品稀释液、阳性对照液、阴性对照液、酶结合物、洗涤液、底物显色液和终止液；所述羊棘球蚴重组抗原Eg95是通过以下方法制备的：首先PCR扩增EG95基因片段，然后采用EcoRI和XhoI同时酶切PCR产物和原核表达载体pET-32a，胶回收目的片段和载体后进行连接，构建重组质粒pET-EG95，将重组质粒转化到大肠杆菌，经IPTG诱导表达，经Ni-NTA纯化。本发明以重组蛋白Eg95为抗原来检测羊棘球蚴病抗体，该抗体检测试剂盒特异性强、灵敏度高、试剂盒稳定性好。
【专利说明】
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程技术和诊断试剂领域，具体涉及一种羊棘球蚴ELISA抗体检 测试剂盒。 -种羊棘球蚴ELISA抗体检测试剂盒
【背景技术】
[0002] 棘球蚴病又称包虫病，是由寄生于犬、狼、狐狸等动物小肠的细粒棘球绦虫中绦 期一棘球蚴感染中间宿主而引起的一种严重的人兽共患病。棘球蚴寄生于、羊、猪、马、骆驼 等家畜及多种野生动物和人的肝、肺及其他器官内。由于蚴体生长力强，体积大，不仅压迫 周围组织使之萎缩和功能障碍，还易造成继发感染，如蚴体破裂，还可引起过敏反应，往往 给人畜造成严重的病症，甚至死亡。
[0003] 1996年Lightowler等研制成功抗细粒棘球绦虫虫卵感染的基因工程重组抗原疫 苗一Eg95疫苗，为包虫病的免疫预防带来新的希望。初步的动物实验表现了不错的抗感染 能力（96%?98%)，Eg95疫苗由此也被认为是最有前途的抗细粒棘球绦虫疫苗。经过多年 的发展，EG95重组蛋白疫苗作为目前控制棘球蚴病唯一的疫苗，完全能够用于动物的免疫 预防，且已实现商品化生产。但目前尚无简单有效、特异性、敏感性强的免疫学检测试剂盒， 以评价疫苗的免疫效果、促进EG95重组蛋白疫苗的应用。
【发明内容】
[0004] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种羊棘球蚴ELISA抗体检测试剂盒，能够用 于羊棘球蚴病抗体的定性检测，具有特异性好、灵敏度高、重复性好的优点。
[0005] 为达到上述目的，本发明提供如下技术方案： 本发明公开了一种羊棘球蚴ELISA抗体检测试剂盒，所述检测试剂盒包括羊棘球蚴重 组抗原Eg95预包被酶标板、样品稀释液、阳性对照液、阴性对照液、酶结合物、洗涤液、底物 显色液和终止液。
[0006] 进一步，所述羊棘球蚴重组抗原Eg95是通过以下方法制备的：首先PCR扩增EG95 基因片段，然后采用EcoR I和Xho I同时酶切PCR产物和原核表达载体pET-32a，胶回收目 的片段和载体后进行连接，构建重组质粒PET-EG95,将重组质粒转化到大肠杆菌，经IPTG 诱导表达，经Ni-NTA纯化。
[0007] 进一步，所述抗原包被的方法为：将纯化的重组蛋白Eg95用pH9. 6的碳酸盐缓冲 液稀释至lOKg/ml，包被酶标板，每孔10〇μ1，4?过夜，用洗涤液洗5次，每次3min ;加入含 5% wt.脱脂奶粉的PBS封闭液，每孔20〇μ1，37°C孵育2h，随后用洗涤液洗5次，每次3min， 真空包装后置于4°C保存备用。
[0008] 进一步，所述样品稀释液为含5%wt. BSA和0. 5%。wt. Tween-20的磷酸盐缓冲液。
[0009] 进一步，所述阴性对照液为健康未免疫棘球蚴疫苗的羊血清，所述阳性对照液为 含有Eg95抗体的羊血清。
[0010] 进一步，所述酶结合物为辣根过氧化物酶标记的兔抗山羊IgG酶标抗体。
[0011] 进一步，所述洗漆液为含〇. 5%。wt. Tween-20的磷酸盐缓冲液。
[0012] 进一步，所述底物显色液包括溶液A和溶液B，溶液A的配方为：每500ml加醋酸 钠13. 6g、柠檬酸1. 6g和30%双氧水0. 3ml，溶液B的配方为：每500ml加乙二胺四乙酸二 钠0. 2g、柠檬酸0. 95g、甘油50ml和TMB粉末0. 15g。
[0013] 进一步，所述终止液为2mol/L的硫酸溶液。
[0014] 本发明的有益效果在于：本发明以重组蛋白Eg95为抗原来检测羊棘球蚴病抗体， 经试验证明，该抗体检测试剂盒特异性强、灵敏度高、试剂盒稳定性好，可用于羊棘球蚴病 抗体的定性检测。
【专利附图】
【附图说明】
[0015] 为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行 说明： 图1 :棘球蚴重组蛋白Eg95表达的SDS-PAGE分析结果。1.蛋白Marker ;2-7.重组 蛋白Eg95 ; 图2:棘球蝴重组蛋白Eg95表达的Western blotting分析结果。1.蛋白Marker ;2·阴 性对照；3.重组蛋白Eg95 ; 图3 :棘球蚴重组蛋白Eg95纯化结果。1.蛋白Marker ;2-11重组蛋白Eg95 ; 图4 :羊棘球蚴ELISA抗体检测试剂盒的灵敏性试验结果。
【具体实施方式】
[0016] 为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面将对本发明的优选实 施例进行详细的描述。
[0017] 实施例1 :羊棘球蚴ELISA抗体检测试剂盒的制备 羊棘球蚴ELISA抗体检测试剂盒包括羊棘球蚴重组抗原Eg95预包被酶标板、样品稀释 液、阳性对照液、阴性对照液、酶结合物、洗涤液、底物显色液和终止液。
[0018] 羊棘球蚴ELISA抗体检测试剂盒的制备方法为： 1.羊棘球蚴重组抗原Eg95的表达与纯化：首先PCR扩增EG95基因片段，然后采用 EcoR I和Xho I同时酶切PCR产物和原核表达载体pET-32a，胶回收目的片段和载体后进 行连接，构建重组质粒PET-EG95。将酶切鉴定和测序鉴定成功的重组质粒转化到大肠杆菌 BL21，筛选阳性菌落并接入含Amp的LB液体培养基，IPTG诱导后，表达产物进行SDS-PAGE 电泳分析，在约35kDa处出现特异性条带，与预期一致。重组菌裂解后，lOOOOrpm离心5min， 分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳，结果显示目的蛋白主要以不溶性形式表达（图1)。 经Western blotting分析，表达产物能与羊棘球蝴（包虫）阳性血清反应（图2)。重组蛋 白经Ni-NTA纯化后，纯度达90%以上（图3)。
[0019] 2.抗原包被：将纯化的重组蛋白Eg95用pH9. 6的碳酸盐缓冲液稀释至lOPg/ml， 包被96孔酶标板，每孔10〇μ1，4°C过夜，用洗涤液洗5次，每次3min ;加入含5% wt.脱脂奶 粉的PBS封闭液，每孔20〇μ1，37°C孵育2h，随后用洗涤液洗5次，每次3min，真空包装后置 于4°C保存备用。
[0020] 3.试剂配制：①磷酸盐缓冲液：每1000ml加磷酸氢二钠19. lg，磷酸二氢钾 1. 815g，氯化钠8g ;②样品稀释液：含5%wt. BSA和(λ 5%。wt. Tween-20的磷酸盐缓冲液；③ 洗涤液：含〇. 5%。wt. Tween-20的磷酸盐缓冲液；④阴性对照液：健康未免疫棘球蚴疫苗的 羊血清，阳性对照液：含有Eg95抗体的羊血清；⑤酶结合物：辣根过氧化物酶标记的兔抗山 羊IgG酶标抗体；⑥底物显色液：溶液A :每500ml加醋酸钠13. 6g、柠檬酸1. 6g和30%双 氧水0. 3ml，溶液B :每500ml加乙二胺四乙酸二钠0. 2g、柠檬酸0. 95g、甘油50ml和TMB粉 末0· 15g ;⑦终止液：2mol/L的硫酸溶液。
[0021] 实施例2 :羊棘球蚴ELISA抗体检测试剂盒的使用操作步骤 1. 取抗原包被板，分别将稀释好的待检血清和对照各取1〇〇 μ 1加入到抗原包被板孔 中，待检样品做1孔，阴性对照和阳性对照各设2孔，每孔100 μ 1 ;轻轻振匀孔中样品(勿溢 出），置37°C温育60分钟； 2. 甩掉板孔中的溶液，每孔加入稀释好的洗涤液200 μ 1，静置3分钟倒掉，再在吸水 纸上拍干，共计洗涤5次； 3. 每孔加兔抗山羊酶标二抗100 μ 1，置37°C温育60分钟； 4. 洗涤5次，方法同2,切记每次在干净吸水纸上拍干； 5. 每孔先加底物显色液Α 5〇μ1、再加底物显色液Β 5〇μ1，室温避光显色10分钟； 6. 每孔加终止液5〇μ1，10分钟内测定结果； 7. 利用酶标仪在0D450nm测定光吸收（0D)值； 8. 结果判定：试验成立的条件是阳性对照孔平均0D450nm值> 0. 6,阴性对照孔平均 0D450nm值必须< 0. 3 ;样品0D450nm值> 0. 6,判为阳性；样品0D450nm值< 0. 3,判为阴 性；0.3、. 6之间为可疑。
[0022] 实施例3 :羊棘球蚴ELISA抗体检测试剂盒检测结果评价 1.灵敏性试验：取一份阳性血清从1:200倍开始倍比稀释，然后用此试剂盒进行 ELISA试验，当血清稀释度为1:25600时，0D45(I=0. 672,结果仍为阳性(见图4)，证明本发明 试剂盒具有较好的灵敏性。
[0023] 2.阻断试验：用包被抗原蛋白和已知阳性血清进行阻断反应，将阳性血清 分为两份，第一份用样品稀释液按1 :1〇〇稀释，第二份用含〇. lMg/lOOW的Eg95抗原 的稀释液按1 :100稀释，然后按已确立的操作程序进行ELISA试验，结果见表1，结果显示， 经包被抗原处理过的阳性血清，〇D45(l值下降明显，表明了包被抗原具有良好的特异性。
【权利要求】
1. 一种羊棘球蚴ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒包括羊棘球蚴 重组抗原Eg95预包被酶标板、样品稀释液、阳性对照液、阴性对照液、酶结合物、洗涤液、底 物显色液和终止液。
2. 根据权利要求1所述的羊棘球蚴ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于：所述羊棘球 蚴重组抗原Eg95是通过以下方法制备的：首先PCR扩增EG95基因片段，然后采用EcoR I 和Xho I同时酶切PCR产物和原核表达载体pET-32a，胶回收目的片段和载体后进行连接， 构建重组质粒PET-EG95,将重组质粒转化到大肠杆菌，经IPTG诱导表达，经Ni-NTA纯化。
3. 根据权利要求2所述的羊棘球蚴ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于：所述抗原包 被的方法为：将纯化的重组蛋白Eg95用pH9. 6的碳酸盐缓冲液稀释至lOPg/ml，包被酶标 板，每孔1〇〇μ1，4°C过夜，用洗涤液洗5次，每次3min ;加入含5% wt.脱脂奶粉的PBS封闭 液，每孔20〇μ1，37°C孵育2h，随后用洗涤液洗5次，每次3min，真空包装后置于4°C保存备 用。
4. 根据权利要求1至3任意一项所述的羊棘球蚴ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于： 所述样品稀释液为含5%wt. BSA和0. 5%。wt. Tween-20的磷酸盐缓冲液。
5. 根据权利要求1至3任意一项所述的羊棘球蚴ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于： 所述阴性对照液为健康未免疫棘球蚴疫苗的羊血清，所述阳性对照液为含有Eg95抗体的 羊血清。
6. 根据权利要求1至3任意一项所述的羊棘球蚴ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于： 所述酶结合物为辣根过氧化物酶标记的兔抗山羊IgG酶标抗体。
7. 根据权利要求1至3任意一项所述的羊棘球蚴ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于： 所述洗漆液为含〇. 5%。wt. Tween-20的磷酸盐缓冲液。
8. 根据权利要求1至3任意一项所述的羊棘球蚴ELISA抗体检测试剂盒，其特征在 于：所述底物显色液包括溶液A和溶液B，溶液A的配方为：每500ml加醋酸钠13. 6g、柠檬 酸1. 6g和30%双氧水0. 3ml，溶液B的配方为：每500ml加乙二胺四乙酸二钠0. 2g、柠檬酸 0. 95g、甘油 50ml 和 TMB 粉末 0. 15g。
9. 根据权利要求1至3任意一项所述的羊棘球蚴ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于： 所述终止液为2mol/L的硫酸溶液。
【文档编号】G01N33/68GK104101716SQ201410349860
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2014年7月22日 优先权日:2014年7月22日
【发明者】曹政, 李阳春, 田东升, 李春燕 申请人:重庆澳龙生物制品有限公司