一种抗体修饰的纳米银及其试剂盒与应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种抗体修饰的纳米银(AgNPs)，它以直径为10～30nm的纳米银球为内核，银球外表面静电吸附有羊抗鼠IgG抗体。本发明还公开了上述抗体修饰的纳米银的制备方法、包含该抗体修饰的纳米银的试剂盒、及该抗体修饰的纳米银在制备检测鼠IgG的试剂中的应用。本发明的抗体修饰的纳米银(纳米银-抗体)相比商品化的纳米金-抗体具有与目标物反应时间快，显色时间短，检测浓度范围宽且价格便宜的优势。此种纳米银-抗体具有取代纳米金-抗体的能力。
【专利说明】一种抗体修饰的纳米银及其试剂盒与应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物检测【技术领域】，具体涉及一种用于检测IgG的抗体修饰的纳米银及其试剂盒与应用。
【背景技术】
[0002]免疫诊断试剂常规应用的检测方法有放射免疫分析(RIA)，酶联免疫吸附分析法(ELISA)，化学发光免疫分析法，纳米标记物免疫分析法。与酶标记物相比，纳米标记物具有良好的化学稳定性和制备可控性，因此基于纳米材料标记的免疫测定技术灵敏度高、特异性强、精密度好、结果准确、操作简便、快速、无污染，该技术正在进入微量物质测定的各个领域。其中，纳米金标记物由于其显色效果突出、检测方便而被广泛应用于各类试纸条，纳米金催化银增强显色反应也被进一步应用于免疫分析中。
[0003]近年来，具有优良光学特性的纳米银正被越来越多地应用于蛋白质和DNA等生物分子的检测分析。首先，纳米银相比于纳米金成本更低廉，可以大大降低生产的成本；其次，由于纳米银具有更高的摩尔消光系数，其颜色变化会更灵敏；最后，纳米银具有很强的催化性能。可见，纳米银具有摩尔消光系数高、表面增强拉曼散色效应强和催化活性好等独特的物理化学性能。然而，纳米银标记物用于免疫显色分析的报道并不多，研究和发展纳米银标记物及其相应的显色分析系统是十分有必要的。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的技术问题是提供一种适用于IgG检测的抗体修饰的纳米银试剂。
[0005]本发明还要解决的技术问题是提供包含上述纳米银材料的试剂盒，用于IgG的检测。
[0006]本发明最后要解决的技术问题是提供上述试剂盒在检测IgG中的应用。
[0007]为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下:
[0008]一种抗体修饰的纳米银，它以直径为10?30nm的纳米银球为内核，纳米银球外表面吸附有羊抗鼠IgG。
[0009]本发明还提供了上述抗体修饰的纳米银的制备方法，包括如下步骤:
[0010](I)在冰浴条件下,将聚乙烯卩比咯烧酮(Polyvinylpyrrolidone,PVP)溶液加入硼氢化钠溶液中，搅拌并逐滴加入硝酸银溶液，继续搅拌至室温，得纳米银溶液；
[0011](2)将羊抗鼠IgG抗体溶液加入至纳米银溶液中，于冰箱中过夜反应；
[0012](3)将步骤(2)反应体系的上清液离心，沉淀加入BSA缓冲溶液重悬，重复离心与重悬的步骤I?3次；最后离心得到的沉淀用lmg/mL BSA溶液重悬即得。
[0013]其中步骤(I)中，硝酸银溶液浓度为2-20mmol/L ;硼氢化钠溶液的浓度为3-30mmol/L ;聚乙烯吡咯烷酮的浓度为O?5%，优选0.1?1% ;硝酸银溶液、硼氢化钠溶液、聚乙烯卩比咯烧酮(Polyvinylpyrrolidone, PVP)溶液的体积比为I: (1-10): (0-1),优选1:(1-10):(0.1-1)。
[0014]步骤⑵中，羊抗鼠IgG抗体溶液的浓度为1-lOmg/mL ;羊抗鼠IgG抗体溶液与纳米银溶液的体积比为(0.1?10):10o
[0015]步骤(3)中，BSA缓冲溶液的浓度为lmg/mL，BSA缓冲溶液每次的加入体积为待加入的混合体系体积的0.1?5倍。
[0016]本发明还提供了上述抗体修饰的纳米银在IgG检测中的应用。
[0017]本发明还提供了一种用于检测IgG的试剂盒，包括磷酸盐缓冲液、羊抗鼠IgG、链霉亲和素、银增强试剂A和银增强试剂B、牛血清白蛋白溶液、抗体修饰的纳米银。
[0018]本发明还提供了上述用于检测IgG的试剂盒在检测鼠IgG中的应用。
[0019]所述应用，包括以下步骤:
[0020](I)配制溶液:
[0021 ] 洗涤液:将20 X PBS用二次水稀释20倍至I X PBS，加入0.05 %体积比的Tween-20即得PBST洗涤液；
[0022]探针和样品稀释液:将0.1g牛血清白蛋白溶解于10mLlXPBS溶液中即得Img/ml BSA ；
[0023]封闭液:将Ig牛血清白蛋白溶解于10mLl XPBS溶液中即得10mg/ml BSA封闭液；
[0024]目标物:用lmg/ml BSA配制不同浓度的IgG ；
[0025]探针:用BSA溶液配制所需浓度的探针；
[0026]显色液:将银增强试剂A和银增强试剂B按体积比1:1的混合液；
[0027](2)将目标物、阴性对照物、阳性对照物分别在醛基修饰的玻璃片上点样，37°C条件下固定2-4h ；
[0028](3)每孔加入10?50μ L封闭液，在20_37°C条件下封闭I?3小时，用洗涤液荡洗5?15min,洗漆3?4次,吹干；
[0029](4)每孔加入20?50 μ L纳米银-抗体探针，在20-37°C条件下反应10?60分钟，用洗涤液荡洗5?15min，洗涤3?4次，并用去离子水冲洗3?4次，吹干；
[0030](5)每孔加入20?50 μ L显色液,避光反应5?20min,去离子水冲洗3?4遍，吹干；
[0031](6)用CCD生物芯片扫描仪扫描，根据得到的灰度值信号做标准曲线，得到IgG的线性范围。
[0032]有益效果:利用本发明的纳米银-抗体进行IgG的检测，相比纳米金-抗体，具有灵敏度更高，检测时间更短的优势，且此显色方法操作简单易行，检测结果可视化，无需特殊昂贵的检测仪器，目视即可达到孔内半定量检测；成本低廉，可实现大批量检测，适于推广使用。
[0033]本发明通过两种检测IgG的方法的比较，第一种方法是以纳米银-抗体作为检测探针，第二种方法是以纳米金-抗体作为检测探针，证明了纳米银-抗体作为检测探针检测的浓度范围宽，显色时间短，与目标物反应快。
【专利附图】
【附图说明】
[0034]图1为本发明抗体修饰的纳米银的制备及检测鼠IgG的原理图；
[0035]图2为纳米银及本发明抗体修饰的纳米银的紫外-可见光谱图(UV-Vis)；
[0036]图3为本发明抗体修饰的纳米银的透射电镜图(TEM)；
[0037]图4纳米金-抗体检测鼠IgG的结果图，反应时间为30min ；
[0038]图5为纳米银-抗体检测鼠IgG的结果图，反应时间为30min ；
[0039]图6纳米金-抗体检测鼠IgG的结果图，反应时间为15min ；
[0040]图7及纳米银-抗体检测鼠IgG的结果图，反应时间为15min。
【具体实施方式】
[0041]根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
[0042]实施例1:抗体修饰的纳米银的制备。
[0043]在冰浴条件下，首先将2mL0.25% PVP加入至20mL3mmol/L硼氢化钠溶液中，然后将10mL2mmol/L的硝酸银溶液逐滴加入，不断搅拌至反应完全，继续搅拌至室温，即可得到纳米银溶液。得到的纳米银的表征图如图2。
[0044]将2mg/mL50 μ L羊抗鼠IgG抗体加入至0.5mL纳米银溶液中，放于4°C冰箱过夜反应，取上清液离心，14°C 15000r/min20min离心后去除上清，沉淀加入BSA缓冲溶液重悬，重复离心与重悬的步骤2次,每次15minl4°C转速为15000r/min,最后离心得到的沉淀用50 μ L BSA溶液重悬，即得，4°C保存。其中，BSA缓冲溶液的浓度为lmg/mL，BSA缓冲溶液每次的加入体积为待加入的混合体系体积的I倍。
[0045]实施例2:抗体修饰的纳米银的制备。
[0046]在冰浴条件下，首先将2mLl % PVP加入至20mL3mmol/L硼氢化钠溶液中，然后将2mL2mmol/L的硝酸银溶液逐滴加入，不断搅拌至反应完全，继续搅拌至室温，即可得到纳米银溶液。得到的纳米银的表征图与图2—致。
[0047]将4mg/mL50 μ L羊抗鼠IgG抗体加入至0.5mL纳米银溶液中，放于4°C冰箱过夜反应，取上清液离心，14°C 15000r/min20min离心后去除上清，沉淀加入BSA缓冲溶液重悬，重复离心与重悬的步骤2次,每次15minl4°C转速为15000r/min,最后离心得到的沉淀用50 μ L BSA溶液重悬，即得，4°C保存。其中，BSA缓冲溶液的浓度为lmg/mL，BSA缓冲溶液每次的加入体积为待加入的混合体系体积的3倍。
[0048]实施例3:抗体修饰的纳米银的制备。
[0049]在冰浴条件下，首先将2mL0.1 % PVP加入至20mL15mmol/L硼氢化钠溶液中，然后将20mL10mmol/L的硝酸银溶液逐滴加入，不断搅拌至反应完全，继续搅拌至室温，即可得到纳米银溶液。得到的纳米银的表征图与图2—致。
[0050]将lmg/mL0.5mL羊抗鼠IgG抗体加入至0.5mL纳米银溶液中，放于4°C冰箱过夜反应，取上清液离心，14°C 15000r/min20min离心后去除上清，沉淀加入BSA缓冲溶液重悬，重复离心与重悬的步骤2次,每次15minl4°C转速为15000r/min,最后离心得到的沉淀用1uL BSA溶液重悬，即得，4°C保存。其中，BSA缓冲溶液的浓度为lmg/mL，BSA缓冲溶液每次的加入体积为待加入的混合体系体积的0.1倍。
[0051]实施例4:抗体修饰的纳米银的制备。
[0052]在冰浴条件下，首先将2mL5% PVP加入至20mL30mmol/L硼氢化钠溶液中，然后将4mL20mmol/L的硝酸银溶液逐滴加入，不断搅拌至反应完全，继续搅拌至室温，即可得到纳米银溶液。得到的纳米银的表征图与图2—致。
[0053]将lOmg/mLlO μ L羊抗鼠IgG抗体加入至ImL纳米银溶液中，放于4°C冰箱过夜反应，取上清液离心，140C 15000r/min20min离心后去除上清，沉淀加入BSA缓冲溶液重悬，重复离心与重悬的步骤I次，15minl4°C转速为15000r/min,最后离心得到的沉淀用50 μ LBSA溶液重悬，即得，4°C保存。其中，BSA缓冲溶液的浓度为lmg/mL，BSA缓冲溶液每次的加入体积为待加入的混合体系体积的5倍。
[0054]实施例5:抗体修饰的纳米银的制备。
[0055]在冰浴条件下，将20mL3mmol/L的硝酸银溶液逐滴加入至40mL2mmol/L硼氢化钠溶液中，不断搅拌至反应完全，继续搅拌至室温，即可得到纳米银溶液。得到的纳米银的表征图与图2 —致。
[0056]将2mg/mL50 μ L羊抗鼠IgG抗体加入至ImL纳米银溶液中，放于4°C冰箱过夜反应，取上清液离心，140C 15000r/min20min离心后去除上清，沉淀加入BSA缓冲溶液重悬，重复离心与重悬的步骤3次,每次15minl4°C转速为15000r/min,最后离心得到的沉淀用50 μ L BSA溶液重悬，即得，4°C保存。其中，BSA缓冲溶液的浓度为lmg/mL，BSA缓冲溶液每次的加入体积为待加入的混合体系体积的2倍。
[0057]实施例6:用于检测IgG的试剂盒。
[0058]用于检测IgG(bs_0296p)的试剂盒，该试剂盒包含如下试剂:
[0059]PBS (SB0627-500mL购自上海生工生物工程有限公司)及Tween-20 (T0777_500mL购自天津科美有限公司)用于配制洗涤液；
[0060]羊抗鼠IgG(bs_0296G)购自北京博奥森；
[0061]牛血清白蛋白(Roche738328)购自北京博奥森生物技术有限公司；
[0062]抗体修饰的纳米银(探针)实施例4或5的方法合成；
[0063]银增强试剂A、B (显色液，S5020-100mL, S5145_100mL)购自 Sigma-Aldrich ；
[0064]所有溶液均用高纯水配制。
[0065]实施例7:检测IgG的方法I。
[0066]利用实施例6的试剂盒检测标准样本中的IgG含量的方法:
[0067](I)探针和样品稀释液:将0.1g牛血清白蛋白溶解于10mL IXPBS溶液中即得lmg/ml BSA ；
[0068]封闭液:将Ig牛血清白蛋白溶解于10mLl XPBS溶液中即得10mg/ml BSA封闭液；
[0069]目标物:用lmg/ml BSA配制不同浓度的IgG ；
[0070]对照物:用lmg/ml BSA配制所需浓度的纳米金-抗体探针；
[0071]探针:用lmg/ml BSA配制所需浓度的纳米银-抗体探针。
[0072]显色液:将银增强试剂A和银增强试剂B按体积比1:1的混合液；
[0073](2)将目标物、阴性对照物、阳性对照物分别在醛基修饰的玻璃片上点样，37°C条件下固定3h ；
[0074](3)每孔加入30 μ L封闭液，在37°C条件下封闭I小时，用洗涤液荡洗5min，洗涤3次，吹干；
[0075](4)每孔加入30 μ L纳米银-抗体探针或者纳米金-抗体探针,在37°C条件下反应30分钟，用洗涤液荡洗5，洗涤3次，并用去离子水冲洗3次，吹干；
[0076](5)每孔加入30 μ L显色液,避光反应纳米银_抗体反应7min,纳米金-抗体显色1min,去离子水冲洗3遍,吹干；
[0077](6)用CCD生物芯片扫描仪扫描，根据得到的灰度值信号做标准曲线与通过纳米金-抗体得到的标准曲线进行比较。
[0078]本实施例方法中，对两种探针的检测性能进行了考察，结果见图4和5。其中，图4为纳米金-抗体的实验数据；图5为纳米银-抗体的检测。从图中可看出纳米银-抗体探针检测的浓度范围更低。
[0079]实施例8:检测IgG的方法II。
[0080]利用实施例6的试剂盒检测标准样本中的IgG含量的方法:
[0081](I)探针和样品稀释液:将0.1g牛血清白蛋白溶解于10mL IXPBS溶液中即得lmg/ml BSA ；
[0082]封闭液:将Ig牛血清白蛋白溶解于10mLl XPBS溶液中即得10mg/ml BSA封闭液；
[0083]目标物:用lmg/ml BSA配制不同浓度的IgG ；
[0084]对照物:用lmg/ml BSA配制所需浓度的纳米金-抗体探针；
[0085]探针:用lmg/ml BSA配制所需浓度的纳米银-抗体探针。
[0086]显色液:将银增强试剂A和银增强试剂B按体积比1:1的混合液；
[0087](2)将目标物、阴性对照物、阳性对照物分别在醛基修饰的玻璃片上点样，37°C条件下固定3h ；
[0088](3)每孔加入30 μ L封闭液，在37°C条件下封闭I小时，用洗涤液荡洗5min，洗涤3次，吹干；
[0089](4)每孔加入30 μ L纳米银-抗体探针或者纳米金-抗体探针,在37°C条件下反应15分钟，用洗涤液荡洗5，洗涤3次，并用去离子水冲洗3次，吹干；
[0090](5)每孔加入30 μ L显色液,避光反应纳米银_抗体反应7min,纳米金-抗体显色9min,去离子水冲洗3遍,吹干；
[0091](6)用CCD生物芯片扫描仪扫描，根据得到的灰度值信号做标准曲线与通过纳米金-抗体得到的标准曲线进行比较。
[0092]本实施例方法中，在减少与目标物反应时间的情况下，对两种探针的检测性能进行了考察，，结果见图6和7。其中，图6为纳米金-抗体的实验数据；图7为纳米银-抗体的检测。从图中可看出纳米银-抗体探针检测的浓度范围更宽，线性关系更好，纳米银-抗体探针相比纳米金-抗体探针具有明显的优势。
【权利要求】
1.一种抗体修饰的纳米银，其特征在于:它以直径为10?30nm的纳米银球为内核，纳米银球外表面吸附有羊抗鼠IgG。
2.权利要求1所述的一种抗体修饰的纳米银的制备方法，其特征在于:包括如下步骤: (1)在冰浴条件下，将聚乙烯吡咯烷酮溶液加入硼氢化钠溶液中，搅拌并逐滴加入硝酸银溶液，继续搅拌至室温，得纳米银溶液； (2)将羊抗鼠IgG抗体溶液加入至纳米银溶液中，于冰箱中过夜反应； (3)将步骤(2)反应体系的上清液离心，沉淀加入BSA缓冲溶液重悬，重复离心与重悬的步骤I?3次；最后离心得到的沉淀用lmg/mL BSA溶液重悬即得。
3.根据权利要求2所述的一种抗体修饰的纳米银的制备方法，其特征在于:步骤(I)中，硝酸银溶液浓度为2-20mmol/L ;硼氢化钠溶液的浓度为3-30mmol/L ;聚乙烯吡咯烷酮的浓度为O?5%;硝酸银溶液、硼氢化钠溶液、聚乙烯吡咯烷酮溶液的体积比为1:(1-10):(0-1)。
4.根据权利要求2所述的一种抗体修饰的纳米银的制备方法，其特征在于:步骤(2)中，羊抗鼠IgG抗体溶液的浓度为1-lOmg/mL ;羊抗鼠IgG抗体溶液与纳米银溶液的体积比为(0.1 ?10):10ο
5.根据权利要求2所述的一种抗体修饰的纳米银的制备方法，其特征在于:步骤(3)中，BSA缓冲溶液的浓度为lmg/mL，BSA缓冲溶液每次的加入体积为待加入的混合体系体积的0.1?5倍。
6.权利要求1所述的抗体修饰的纳米银在IgG检测中的应用。
7.一种用于检测IgG的试剂盒，其特征在于:包括磷酸盐缓冲液、羊抗鼠IgG、链霉亲和素、银增强试剂A和银增强试剂B、牛血清白蛋白溶液、抗体修饰的纳米银。
8.权利要求7所述的用于检测IgG的试剂盒在检测鼠IgG中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于:包括以下步骤: (1)配制溶液: 洗涤液:将20 X PBS用二次水稀释20倍至1XPBS，加入0.05%体积比的Tween-20即得PBST洗涤液； 探针和样品稀释液:将0.1g牛血清白蛋白溶解于10mLl XPBS溶液中即得lmg/mlBSA ； 封闭液:将Ig牛血清白蛋白溶解于10mLlXPBS溶液中即得10mg/ml BSA封闭液； 目标物:用lmg/ml BSA配制不同浓度的IgG ； 探针:用BSA溶液配制所需浓度的探针； 显色液:将银增强试剂A和银增强试剂B按体积比1:1的混合液； (2)将目标物、阴性对照物、阳性对照物分别在醛基修饰的玻璃片上点样，37°C条件下固定2-4h; (3)每孔加入10?5(^1^封闭液，在20-371:条件下封闭I?3小时，用洗涤液荡洗5?15min,洗漆3?4次,吹干； (4)每孔加入20?50μ L纳米银-抗体探针，在20-37°C条件下反应10?60分钟，用洗涤液荡洗5?15min，洗涤3?4次，并用去离子水冲洗3?4次，吹干；(5)每孔加入20?50μ L显色液,避光反应5?20min,去离子水冲洗3?4遍,吹干； (6)用CCD生物芯片扫描仪扫描，根据得到的灰度值信号做标准曲线，得到IgG的线性范围。
【文档编号】G01N33/552GK104237501SQ201410398798
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年8月13日 优先权日:2014年8月13日
【发明者】许丹科, 李慧, 牛奇奇 申请人:南京大学