本发明属于医学检验测定技术领域，特别是涉及基于核酸适体荧光探针的糖化血红蛋白GHb试剂盒及其检测方法。
背景技术：
糖尿病是人类健康的世界性公共卫生问题，糖尿病是一种终生性疾病，其并发症是至残至死的主要原因，所以人们希望能尽早发现和治疗糖尿病。传统的糖尿病诊断和治疗监测采用空腹血糖、餐后血糖和口服葡萄糖耐量试验等，但是血糖参数仅代表抽血时的瞬间血糖水平，而糖化血红蛋白(GHb)作为反映长期血糖水平的金标准，也是监测糖尿病治疗的重要指标。GHb是红细胞中血红蛋白与葡萄糖缓慢、持续且不可逆地进行非酶促蛋白糖化反应的产物。形成两周后不易分开。当血液中葡萄糖浓度较高时，人体所形成的GHb含量也会相对较高.正常生理条件下，非酶促糖化反应产物的生成量与反应物的浓度成正比。由于蛋白质浓度保持相对稳定，糖化水平主要决定于葡萄糖浓度，也与蛋白质与葡萄糖接触的时间长短有关。GHb可以反映最近2—3个月的平均血糖水平。2002年美国糖尿病协会已明确规定应定期检测GHb，并将其作为监测糖尿病血糖控制的金标。普及糖尿病知识，更新治疗理念，监测并保持GHb达标，更早、更合理地使用胰岛素等药物治疗，对于控制糖尿病并发症的发生发展尤为重要。目前常用的糖化血红蛋白GHb的检测方法有以下几种类型：高压液相方法(HPLC)：可全自动分离测定GHb及血蛋白的变异体和亚型，但仪器的操作保养要求较高，CV值1%以内，难以在比较基层的医院和实验室普及；微柱法手工操作步骤繁琐，层析时间和微柱的质量不易控制，易产生操作技术误差，重复性欠佳；而且干扰因素很多，尤其对pH值和温度的变化敏感，HbF及变异血红蛋白(HbS、HbC、HbE等)对结果干扰，扰程度根据柱的分离能力而定，且要仔细观察图谱，所以该法得不到普遍采用。免疫方法：免疫方法是目前采用比较多的检测手段，主要包括以下几种检测方式。（1）比浊法：利用抗原、抗体反应的原理进行测定。GHb的B链N末端提供了一个容易被抗体识别的抗原表位，用单克隆抗体特异识别GHb的B链N末端最后4～6个氨基酸组成的抗原表位，结合比浊法测定。（2）离子捕获法：应用抗原抗体反应原理，并联以荧光标志物，通过连接带负电的多阴离子复合物，吸附到带正电的的纤维表面，经过一系列彻底清洗等步骤后，测定荧光强度变化率，计算GHb浓度。（3）胶乳凝集法：利用抗原抗体反应直接测定总lib中HbAlc的百分含量的方法。样品中总Hb和GHb与胶乳有相同的非特异性吸附而固相化，当加入HbAlc的特异性单克隆抗体后形成胶乳一GHb．鼠抗人GHb单克隆抗体的复合物，此复合物由于羊抗鼠抗体而形成凝集，凝集量因胶乳表面固相化的GHb量的不同而不同。通过测定其吸光度并与GHb百分浓度的标准曲线比较后即可求出样品中GHb所占Hb的百分含量。免疫法测定糖化血红蛋白其准确性和重复性均有欠缺，测定受高浓度葡萄糖、高三酰甘油、高胆红素等物质的干扰，由于样本的浊度会使光度计测定产生错误。另外，抗体由动物免疫获得，成本高且筛选周期长，批与批之间存在差异；抗体对温度湿度敏感，易变性难保存等缺点。亲和层析法：利用硼化亲和试验作为检测原理。该法的试剂能溶解红细胞并特异性沉淀血红蛋白因子，其中蓝色的硼酸缀合物能和糖化血红蛋白上的Cis-diols相结合。血液加入试剂中，红细胞立即溶解，使全部的血红蛋白都沉淀，硼酸缀合物就和GHb中的cis-diol结构相结合。血液和试剂混合后加入滤膜装置，所有沉淀的血红蛋白，不管是和缀合物结合的或未结合的都保留在滤膜的顶部。过量的显色缀合物就被洗涤液洗掉。通过金标定量仪测定蓝色（糖化血红蛋白）和红色（总血红蛋白）的强度，可以计算样品中的GHb的百分比。核酸适配体是近年发展起来的一类新型识别分子，近年来受到科学家的广泛关注，大量针对重要生理活性分子的核酸适配体被筛选出来；各种基于核酸适配体的分析方法和技术已被报道；核酸适配体药物“Macugen”也已于2005年被FDA正式批准上市。SELEX技术筛选得到的寡核苷酸序列被称为适配子,国内其翻译为核酸适体、核酸适配子、核酸识体或核酸适配体等。SELEX技术是指应用化学法合成大容量的随机寡核苷酸(由两端的固定序列和中间的随机序列组成)文库,通过施加选择压力(结合靶目标，淘选与靶目标高度特异结合片段的过程),并结合体外扩增技术,经过多轮的循环选择富集,获得与靶物质高度特异结合的寡核苷酸分子,可以是RNA也可以是DNA,长度一般为25~60个核苷酸。芘是一种可燃的淡黄色单斜晶体有机化合物，其分子结构如下图1，不溶于水，易溶于乙醇、乙醚。可进行亲电取代，如卤化、硝化、磺化等反应。芘主要存在于煤焦油沥青的蒸馏物中。芘为有机合成原料，经氧化可制取1,4,5,8-萘四甲酸，用于染料、合成树脂、分散性染料和工程塑料；酰化后可制还原染料艳橙GR及其他多种染料；还可制杀虫剂、增塑剂等；目前芘分子可作为荧光探针用于基于核酸适体的检测方法中。荧光染料芘，当一个激发态分子（*Py）和另一个基态分子（Py）近距离遭遇的时候能形成激发态二聚体（*Py+Py），能在比芘单体波长更长的位置释放一个光子。芘激发态二聚体在480到500nm处有一个宽的平的发射峰，这个发射峰很容易鉴别；因为即使芘单体的发射峰也很宽，但芘单体的发射峰在370到400nm之间。与荧光共振能量转移类似，形成激发态二聚体具有严格的距离依赖性，有利于发展新型核酸探针。将两个芘分子分别连接在分子信标的两端，设计成“激发态二聚体-单体转换型”分子信标，对目标DNA进行检测；将两个芘分子连接到分子信标的一端作为荧光基团，另一端连接荧光淬灭基团，核酸适体与被测目标的结合引起其空间结构发生改变，使两端的芘分子靠近而形成激发态二聚体，通过检测核酸适体探针的荧光强度和荧光寿命，从而实现了对被测目标的高灵敏检测。核酸适体与靶物质结合所呈现的高敏感性和高特异性,使其在疾病诊断中具有良好的应用前景,尽管目前成熟的临床应用报道较少,但应用适体检测靶蛋白的研究却不断增多,基于适体的检测新技术也不断出现。核酸适体由于其独特的化学抗体特性成为新一代针对特定蛋白的分子药物或靶向载体，以及用于检测其特异性识别的靶分子物质。但是目前基于核酸适体的针对于糖化血红蛋白GHb诊断试剂还很缺乏，且针对于糖化血红蛋白GHb的核酸适体荧光探针检测试剂盒的开发尚未见有报道。
技术实现要素：
本发明的目的是针对现有的易产生操作技术误差、重复性欠佳、干扰因素很多、操作繁琐、测试成本高等不足，提供一种基于核酸适体荧光探针的糖化血红蛋白GHb试剂盒及其检测方法。本发明的方案是通过这样实现的：一种基于核酸适体荧光探针的糖化血红蛋白试剂盒，其特征在于，主要成分包括：含NH4Cl、Tris、EDTA-Na2的红细胞裂解液；含MgCl2的0.2M磷酸缓冲液；糖化血红蛋白标准品；糖化血红蛋白核酸适体荧光探针；所述糖化血红蛋白核酸适体荧光探针为5'和3'两端分别标记荧光芘分子单体的核苷酸单链，该核苷酸单链序列为SEQIDNO:1~SEQIDNO:4中的任意一条DNA片段序列，其序列为：SEQIDNO:1：gggaggcatgtgtgctaaggcgtagcagggttggaaccc；SEQIDNO:2：gggaggcatgtgatttaaggcgcggcagatgttggaaccc；SEQIDNO:3：gggaggcatgagacctatggcgttgcattggttggaaccc；SEQIDNO:4：gggaggcatgggaaacaatgcgccgcagagttggaaccc。以上所述的一种基于核酸适体荧光探针的糖化血红蛋白试剂盒，所述含NH4Cl、Tris、EDTA-Na2的红细胞裂解液为含有1~280mmol/LNH4Cl,1~34mmol/LTris,1~2mmol/LEDTA-Na2,pH7.0~7.2；所述含MgCl2的0.2M磷酸缓冲液为含有1~10mmol/LMgCl2。以上任一所述的一种基于核酸适体荧光探针的糖化血红蛋白试剂盒，其特征在于，所述含NH4Cl、Tris、EDTA-Na2的红细胞裂解液、含MgCl2的0.2M磷酸缓冲液、糖化血红蛋白标准品、糖化血红蛋白核酸适体荧光探针为配制好直接使用的液体试剂或是使用前需加水溶解的干粉状态。以上所述的一种基于核酸适体荧光探针的糖化血红蛋白试剂盒，其特征在于，该试剂盒用于检测肝素抗凝全血或末梢血中的糖化血红蛋白浓度。一种用以上任一所述基于核酸适体荧光探针的糖化血红蛋白试剂盒来检测糖化血红蛋白浓度的方法，其特征在于，方法步骤包括：（1）血样裂解：将血样和含NH4Cl、Tris、EDTA-Na2的红细胞裂解液按1:0.5~5体积比混匀，静置5~30min，再中速离心5~10min，收集上清液；（2）混合卵育：混合卵育：取20~100μl步骤1）得到的上清液和30~50ul的用含MgCl2的0.2M磷酸缓冲液，溶解糖化血红蛋白核酸适体荧光探针得到的糖化血红蛋白核酸适体荧光探针试剂混合，室温下卵育5~15min，使糖化血红蛋白核酸适体荧光探针与血样充分结合，得到测试液；（3）荧光检测：荧光检测仪检测步骤2）得到的测试液50ul，在荧光检测仪荧光激发后，读取荧光激发后20至100ns时间段内波长在480~500nm的荧光值；（4）结果计算：使用生物医学作图软件，参照糖化血红蛋白标准样品制作的标准曲线，结合步骤3）中检测到的荧光值计算出血样中糖化血红蛋白的浓度。以上所述的生物医学软件为Sigmaplot软件，于市面上可以购买到。以上所述的一种用基于核酸适体荧光探针的糖化血红蛋白试剂盒来检测糖化血红蛋白浓度的方法，其特征在于，所述糖化血红蛋白核酸适体荧光探针试剂中糖化血红蛋白核酸适体荧光探针浓度为200~400nmol/L，其特性还在于,所述糖化血红蛋白核酸适体荧光探针为5'和3'两端分别标记荧光芘分子单体的核苷酸单链，该核苷酸单链序列为SEQIDNO:1~SEQIDNO:4中的任意一条DNA片段序列，其序列为：SEQIDNO:1：gggaggcatgtgtgctaaggcgtagcagggttggaaccc；SEQIDNO:2：gggaggcatgtgatttaaggcgcggcagatgttggaaccc；SEQIDNO:3：gggaggcatgagacctatggcgttgcattggttggaaccc；SEQIDNO:4：gggaggcatgggaaacaatgcgccgcagagttggaaccc；糖化血红蛋白核酸适体荧光探针不与糖化血红蛋白结合时，核酸适体处于比较松散的结构，5'和3'两端的芘分子单体相互游离,荧光激发后发射波长在370~400nm之间；糖化血红蛋白核酸适体荧光探针与糖化血红蛋白结合时，糖化血红蛋白诱导其发生结构改变，核酸适体5'和3'两端的芘分子单体相互靠近，形成激发态二聚体，荧光激发后激发态二聚体发射波长在480到500nm之间。以上所述的一种用基于核酸适体荧光探针的糖化血红蛋白试剂盒来检测糖化血红蛋白浓度的方法，其特征在于，所述的血样为肝素抗凝全血或末梢血，所述含NH4Cl、Tris、EDTA-Na2的红细胞裂解液为含有1~280mmol/LNH4Cl,1~34mmol/LTris,1~2mmol/LEDTA-Na2,pH7.0~7.2；所述含MgCl2...