一种检测细胞粘附分子的抗体芯片试剂盒的制作方法

本发明涉及生物检测
技术领域：
，具体地，涉及一种检测细胞粘附分子的抗体芯片试剂盒。
背景技术：
：细胞粘附分子(celladhesionmolecules,cam)是众多介导细胞间或细胞与细胞外基质(extracellularmatrix,ecm)间相互接触和结合分子的统称，是位于细胞表面或细胞基质中的糖蛋白，并以受体和配体结合的形式发挥作用。粘附分子使细胞与细胞间，细胞与基质间发生粘附，参与细胞的识别，活化和信号传导，细胞增值与分化，细胞的伸展与运动，使免疫应答，炎症发生，凝血，肿瘤转移，创伤愈合等一系列重要生理和病理过程的分子基础。细胞粘附分子不仅具有多种生理功能，在一定条件下也与病理过程的发生密切相关。在细胞因子、炎症介质以及其它因素的作用下，细胞表面粘附分子表达的水平和构型可以发生改变，导致细胞粘附能力的变化。体内某些粘附分子的表达是组成性(constitutive)的，即通常状态下细胞表面就有一定水平的表达，如cd11/cd18、icam-1、icam-2和l-selectin等粘附分子在相应细胞的静止状态下有一定水平的表达，在某些因素的作用下，这些粘附分子的表达也可发生上调或下调(up-regulationordown-regulation)。另外一些粘附分子的表达可以是非组成性(non-constitutive)的，即通常状态下这些粘附分子在细胞表面表达很少或不表达，但在某些因素的作用下可诱导表达，如e-selectin、vcam-1在内皮细胞的表达即属此类。e-cadherin与肿瘤浸润的关系包括大肠癌、乳腺癌等在内的多种肿瘤细胞e-cadherin分子表达明显减少或缺失，e-cadherin分子表达水平降低与肿瘤细胞恶性程度显著相关。e-cadherin分子在恶性程度低的乳腺癌细胞的表达水平明显高于恶性程度高的肿瘤细胞，而且其表达水平与腺小管形成成正比。integrin家族粘附分子在肿瘤细胞的表达水平也明显改变，既可表达数量减少或缺失，也可以表达升高，分布在极性亦可能不同于正常细胞。integrin分子在肿瘤细胞表达变化的不一致性可能与integrin分子的不同作用有关。同一种粘附分子可以在转移和附着两个不同的过程中发挥作用，因此integrin分子表达的增加或减少都可能与肿瘤细胞浸润及转移有关。对肿瘤血行转移的研究多采用小鼠尾静脉注射黑素瘤细胞造成肺转移的模型，已知黑素瘤细胞表达的cd44分子、层粘连蛋白受体等都可以促进黑素瘤细胞有肺部形成转移灶，用相应粘附分子的抗体或可溶性配体则可减少黑素瘤的肺部形成转移灶。杀伤细胞与肿瘤细胞的接触由两种细胞表面粘附分子的相互作用来介导，lfa-1/icam-1的相互作用具有重要地位。多种肿瘤细胞表达icam-1分子，肿瘤细胞icam-1分子的表达可能与肿瘤组织内淋巴细胞的浸润有关。细胞因子如ifn-γ、ifn-α、il-4、tnf-α可促进某些肿瘤细胞icam-1分子的表达，从而增加其对杀伤细胞作用的敏感性。毛细胞白血病细胞不表达lfa-1和icam-1分子，使其对ctl的杀伤作用更为敏感。肿瘤患者血清中可溶性icam-1水平往往高于正常人，可能抑制nk对肿瘤细胞的杀伤作用。癌胚抗原相关细胞粘附分子1(ceacam1)是广泛表达于中性粒细胞、巨噬细胞、上皮细胞及淋巴细胞表面的跨膜糖蛋白,属癌胚抗原家族免疫球蛋白超家族粘附分子，其生物学功能包括促进血管的形成,调节血管的重塑，参与细胞凋亡的调控、促进腺体管腔的形成及调控胰岛素的清除以维持细胞对胰岛素的敏感性，同时ceacam1也是致病微生物的粘着受体。恶性肿瘤一个重要生物学特征是其对邻近正常组织的浸润及远处转移。目前已知肿瘤的浸润与转移与其粘附分子表达的改变有关。一方面肿瘤细胞某些粘附分子表达的减少可以使细胞间的附着减弱，肿瘤细胞脱离与周围细胞的附着，这是肿瘤浸润及转移的第一步；另一方面，肿瘤细胞表达的某些粘附分子使已入血的肿瘤细胞得以粘附血管内皮细胞，造成血行转移。检测细胞粘附因子常用的方法包括生物学检测法，免疫法，分子生物学及流式细胞术。上述四种方法，各有优缺点，在实际应用中，根据各自的实验目的和实验室条件进行选择。生物学检测法比较敏感，又可直接测定生物学功能，是最可靠的方法，适用于各种实验目的，是科研部门最常用的技术，但需要长期培养依赖性细胞株，检测耗时长，步骤繁杂，影响因素多，不容易熟练掌握。免疫学检测法比较简单，迅速，重复性好，但假阳性率高，每次只能检测一个细胞粘附因子。分子生物学法只能检测基因表达情况，不能直接提供有关因子的浓度及活性等资料，主要用于机制探讨。流式细胞术是以高能量激光照射高速流动状态下被荧光色素染色的单细胞或颗粒，测量其产生的散射光和发射荧光的强度，从而对细胞进行定性或定量检测的一种细胞分析技术。由于流式细胞术需要昂贵的仪器和专业的操作人员，所以并没有得到广泛应用。有鉴于此，有必要开发一种新型的细胞粘附因子定量检测试剂盒，以克服现有技术中亟待解决的问题，实现多种受体的高通量、高灵敏度、高特异性和低成本检测。技术实现要素：本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种检测细胞粘附分子的抗体芯片试剂盒，该试剂盒能同时检测多个临床常用的细胞粘附因子，克服了现有技术操作繁琐、检测指标单一、灵敏度低等缺陷，具有廉价、便利、灵敏、准确、高通量、标本用量少、能在普通实验室推广和规模化等优点。为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：一种检测多种细胞粘附分子的抗体芯片试剂盒，包括抗体芯片，细胞粘附因子标准品混合物，生物素标记的细胞粘附因子检测抗体混合物；和荧光素cy3标记的链霉亲和素；其中，所述抗体芯片以含有烷基糖苷的亲水试剂处理的玻片作为固相载体，且多种细胞粘附因子的特异性抗体混合物在20～26℃、35～45％的湿度条件下点样到固相载体上。以没有空间限制的标准组织玻片作为载体，可使点在同一微阵列上检测细胞粘附因子的数目不受空间的限制，另外，玻片具有非常低的自身荧光，而且荧光信号不具扩散性，不同点间的荧光信号不会彼此干扰，所以一次可以同时检测多个细胞粘附因子。但是，以不同的方法来处理标准组织玻片，会影响玻片的背景、检测灵敏度，本发明通过比较多种处理玻片的方法，发现以含有烷基糖苷的亲水试剂处理的玻片背景低，检测灵敏度高，实现了不仅一次可以检测十几个细胞粘附因子，并且所检测的细胞粘附因子灵敏度可达单因子的elisa检测灵敏度。优选地，所述细胞粘附因子检测抗体混合物为活性白细胞粘附分子，基底细胞粘附分子，癌胚抗原相关细胞粘附因1子，钙粘附蛋白e，上皮细胞粘附分子，人e-选择素，细胞间粘附分子-1，细胞间粘附分子-2，细胞间粘附分子-3，人l-选择素，神经细胞粘附分子-1，神经细胞粘附分子，钙粘附蛋白p，人p-选择素，血小板内皮细胞粘附分子-1，血管细胞粘附分子-1，血管内皮钙粘蛋白的特异性抗体的混合物。更优选地，所述亲水试剂为质量分数为0.01～0.2％的烷基糖苷、0.01～0.1％的甘油，0.01～0.05％的聚乙二醇4000的超纯水溶液；亲水试剂处理玻片的方法为将玻片在亲水试剂中浸泡3～5分钟，晾干即可。最优选地，所述亲水试剂为质量分数为0.1％的烷基糖苷、0.05％的甘油，0.01％的聚乙二醇4000的超纯水溶液；亲水试剂处理玻片的方法为将玻片在亲水试剂中浸泡3分钟，晾干即可。更优选地，所述细胞粘附因子检测抗体混合物在24℃、40％的湿度条件下点样到固相载体上。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：以不同的方法来处理标准组织玻片，会影响玻片的背景、检测灵敏度，本发明通过比较多种处理玻片的方法，发现以含有烷基糖苷的亲水试剂处理的玻片背景低，检测灵敏度高，实现了不仅一次可以检测十几个细胞粘附因子，并且所检测的细胞粘附因子灵敏度可达单因子的elisa检测灵敏度。本发明的抗体芯片试剂盒克服了现有技术操作繁琐、检测指标单一、灵敏度低等缺陷，具有廉价、便利、灵敏、准确、高通量、标本用量少、能在普通实验室推广和规模化等优点。本发明的抗体芯片试剂盒尤其适用于活性白细胞粘附分子，基底细胞粘附分子，癌胚抗原相关细胞粘附因1子，钙粘附蛋白e，上皮细胞粘附分子，人e-选择素，细胞间粘附分子-1，细胞间粘附分子-2，细胞间粘附分子-3，人l-选择素，神经细胞粘附分子-1，神经细胞粘附分子，钙粘附蛋白p，人p-选择素，血小板内皮细胞粘附分子-1，血管细胞粘附分子-1，血管内皮钙粘蛋白，这17种细胞粘附因子对应特异性抗体的组合方式。因为，不同的细胞粘附因子的特异性抗体在本发明所述芯片检测系统中的灵敏性是不同的，所以，如果将一些低灵敏性的细胞粘附因子抗体与一些高灵敏性的细胞粘附因子抗体组合，会造成低灵敏性的细胞粘附因子的漏检。附图说明图1为抗体芯片点阵图。图2为粘附因子的标准曲线图。具体实施方式下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。实施例1抗体芯片载体的筛选：常规的抗体芯片多以硝酸纤维素膜为载体，由于硝酸纤维素膜是多层结构，芯片的洗涤难度大，以致芯片的背景高，结果波动大。同时硝酸纤维素膜易碎，不易于大规模的操作，用于大规模临床样本的使用还不普遍。而传统的玻片价廉背景低，这给诊断和研究领域的广泛使用带来了突破。我们筛选了市面上不用活性方法处理的玻片，无论是醛基化还氨基化的玻片点样效果不稳定。经过大量的筛查得出温度及玻片表面的活性试剂成分才是决定玻片点样效果的关键。采用以下5组的玻片：第1组为氨基化玻片，购自康宁公司，货号为ultragaps40019；第2组为醛基化玻片：将第1组玻片加入戊二醛浸泡40分钟制作醛基化玻片；第3组为apes玻片：将普通玻片加入丙酮稀释的apes中浸泡0.5～1分钟，再用纯丙酮清洗制成apes玻片；第4组为多聚赖氨酸玻片：将普通玻片加入pbs稀释的多聚赖氨酸浸泡0.5～1个小时，再用纯水清洗制成多聚赖氨酸玻片；第5组为经亲水试剂处理的玻片：将普通玻片用亲水试剂浸泡3～5分钟，室温晾干即可；所述亲水试剂为质量分数为0.01～0.2％的烷基糖苷、0.01～0.1％的甘油，0.01～0.05％的聚乙二醇4000的超纯水溶液。优选地，所述亲水试剂为质量分数为0.1％的烷基糖苷、0.05％的甘油，0.01％的聚乙二醇4000的超纯水溶液；亲水试剂处理玻片的方法为将玻片在亲水试剂中浸泡3分钟，晾干即可。各种玻片的点样效果不尽相同，加入亲水涂层的玻片点样效果较明显，点样效果较未处理过的高。其中经过氨基化及亲水处理的玻片较其他的类型效果较高。在20～26℃条件下，膜/玻片点样效果较清晰，背景值低；而在27～30℃条件下，无论何种膜/玻片的点样效果都出现扩散现象，温度湿度越高，扩散越明显。上述5组玻片结合抗体后加入二抗及底物，在不同的温度及湿度条件下的灵敏度筛选结果如下表1，表1中表示灵敏度的指标是最低检测线，单位ng/ml。表1综合以上指标，最终选择经过上述含有烷基糖苷的亲水试剂处理的玻片作为固相载体。实施例2一种同时定量检测多个细胞粘附因子的抗体芯片试剂盒的制备：为了检测样品中是否存在相应的受体，制备固定有17种细胞粘附因子对应特异性抗体的玻片，17种细胞粘附因子对应特异性抗体为普通市售产品。抗体芯片的制备与保存：将100～1000pl的含特异性抗体的pbs缓冲液(含有0.01～10g/100ml牛白蛋白)用全自动点样仪点样于玻片上。具体的芯片点阵以生物素标记的牛igg作为阳性对照。17种抗体及两种不同浓度的阳性对照在每个阵列中都有四个重复点。在本实施例中芯片阵列采用如图1所示的排布方式，但事实上，在其他实施例中，芯片阵列还可以以其它的排布方式进行组合，并不局限于图1所表示的形式。每张玻片上有16个相同的芯片阵列。将点样好的玻片放于室温条件下静置过夜，然后在干燥器中抽气干燥2小时。干燥后的玻片装上配套的16孔框架把一张玻片分割成16个互不干扰的小区。u形框夹从两侧将16孔框架，硅胶垫与标准载玻片卡贴紧在一起，以致标准载玻片贴紧封闭16孔框架的底部，使16孔框架上的每个小格形成一个小的反应孔，16孔框架边缘分别按照孔的位置标注1至16的凹陷数字以方便辨认。用粘性膜封闭框架后，把整张芯片用不透气的小袋封装然后于2℃到8℃保存备用。细胞粘附因子标准品的制备：制备细胞粘附因子的标准品。将17种细胞粘附因子用含0.1％小牛白蛋白的磷酸缓冲液稀释后按照一定的量混合在一起，分装后用冷冻干燥法干燥并于-80℃保存。在本实施例中，用于做标准曲线用的每种细胞粘附因子的最终使用浓度如表2所示。表2经梯度稀释后用于作标准曲线的粘附因子标准品的浓度(pg/ml)controlstd7std6std5std4std3std2std1alcam0516491484441,3334,000bcam01374121,2353,70411,11133,333100,000ceacam-101374121,2353,70411,11133,333100,000e-cadherin01103299882,9638,88926,66780,000epcam027822477412,2226,66720,000e-selectin01374121,2353,70411,11133,333100,000icam-101374121,2353,70411,11133,333100,000icam-201374121,2353,70411,11133,333100,000icam-301374121,2353,70411,11133,333100,000l-selectin05491,6464,93814,81544,444133,333400,000ncam-101374121,2353,70411,11133,333100,000nrcam01374121,2353,70411,11133,333100,000p-cadherin01374121,2353,70411,11133,333100,000pecam-101374121,2353,70411,11133,333100,000p-selectin027822477412,2226,66720,000vcam-105491,6464,93814,81544,444133,333400,000ve-cadherin02748232,4697,40722,22266,667200,000实施例3用本发明的试剂盒定量检测粘附因子的实验步骤如下：1、玻片芯片的完全干燥：将玻片芯片从盒子中取出来，在室温平衡20～30min后，将包装袋打开，揭开密封条，然后将芯片放在真空干燥器或者室温干燥1～2小时。2、按表2对细胞粘附因子进行梯度稀释2.1、添加500μl的样品稀释液到细胞粘附因子标准混合物的小管中，重新溶解标准品。打开小管前，先快速的离心，轻轻的上下抽打溶解粉末，标记这个小管为std1。2.2、分别标记6个干净的离心管为std2、std3到std7，添加200μl的样品稀释液到每个小管中。2.3、抽取100μl的std1加入到std2中轻轻混合，然后从std2中抽取100μl加入到std3中，如此梯度稀释至std7。2.4、抽取100μl的样品稀释液到另一个新的离心管中，标记为cntrl，作为阴性对照。注：因为每种细胞粘附因子的起始浓度是不同的，所以std1到std7的梯度稀释后，每个细胞因子的系列浓度是不同的，本实施例中，梯度细胞粘附因子稀释液的浓度如表2所示。3、芯片操作流程3.1、每个孔中加100μl的样品稀释液，室温摇床上孵育30分钟，封闭定量抗体芯片。3.2、抽去每个孔中的缓冲液，添加100μl的标准液和样品到孔中，在摇床上4℃过夜孵育。注：不同样品的孵育量不一样：血浆、血清使用前用样品稀释液1：1稀释；细胞上清液可用原液；细胞或组织裂解液经蛋白浓度测定后加入5-50ug的量。3.3、清洗：抽去每个孔中的标准品或样品，1×洗液i清洗5次，每次5min室温摇床震荡，每孔150μl的1×洗液i，每次清洗要抽干净洗液，用去离子水稀释20×洗液i。抽去每个孔中的1×洗液i，加入1×洗液ii清洗2次，每次5min室温摇床震荡，每孔150μl的1×洗液ii，每次清洗要抽干净洗液，用去离子水稀释20×洗液ii。3.4检测抗体混合物的孵育：离心检测抗体混合物小管，然后加入1.4ml的样品稀释液，混合均匀后再次快速离心。添加80μl的检测抗体到每个孔中，室温摇床上孵育2小时。3.5清洗：抽去每个孔中的检测抗体，1×洗液i清洗5次，每次5min室温摇床震荡，每孔150μl的1×洗液i，每次清洗要抽干净洗液，然后加入1×洗液ii清洗2次，每次5min室温摇床震荡，每孔150μl的1×洗液ii，每次清洗要抽干净洗液。3.6cy3-链霉亲和素的孵育：离心cy3-链霉亲和素小管，然后加入1.4ml的样品稀释液，混合均匀后再次快速离心。添加80μl的cy3-链霉亲和素到每个孔中，用铝箔纸包住玻片避光孵育，室温摇床上孵育1个小时。3.7清洗：抽去每个孔中的cy3-链霉亲和素，1×洗液i清洗5次，每次5min室温摇床震荡，每孔150μl的1×洗液i，每次清洗要抽干净洗液。3.8荧光检测1)将玻片框架拆掉，小心不要用手接触到玻片印制抗体的一面。2)将玻片放置在玻片清洗管中，添加约30ml的1×洗液i，能整个覆盖住玻片，在室温摇床上震荡15min，弃去1×洗液i，添加约30ml的1×洗液ii，在室温摇床上震荡5min。3)去除玻片的残留洗液。将玻片放置在玻片清洗管/干燥管中，不盖盖子，在1000rpm离心3min。4)采用激光扫描仪例如axongenepix扫描信号，采用cy3或者绿色通道(激发频率＝532nm)。3.9芯片的数据提取以及用分析软件来进行数据分析1)用genepix软件来读取生物芯片的荧光值。2)读数后选用的数值为扣除点周围背景的中间值读数(f532median-localbackground)。用特定的定量芯片软件来作每个粘附因子蛋白的标准曲线如图2所示。实施例4实验体系交叉反应的测试。抗体芯片实验的准确性在一定程度上受限于所选择的抗原或抗体的来源，纯度与特异性，并且蛋白类抗体的生物与应用存在着抗原性，免疫原性的强弱，异源抗体的类风湿因子和自身抗体的干扰，罕见抗体的高工作量筛选，因些筛选抗体对需要大量的实验验证。抗体对间的交叉反应测试是根据以下方法进行的。不同芯片首先与单个抗原浓度为100ng/ml的不同抗原孵育，洗片后再与每种抗原相对应的检测抗体反应.最后经cy3-链霉亲和素孵育，芯片扫描后读数。以每种抗原的捕获抗体为横轴，以加入的抗原和相对应的检测抗体为纵轴可以得到表3的实验结果。表3.抗体对间的交叉反应测试结果实验结果表明每种抗体对可以特异地识别自己的检测抗原而与其他的抗原没有交叉反应。实施例5实验体系的介质回收率。该定量抗体芯片的在不同样品介质中的适用程度通过测定介质回收率来显示。在2倍稀释的正常人血清和2倍稀释的细胞上清液(cm)中分别加入不同浓度的各个细胞粘附因子，用该定量抗体芯片检测，然后计算样品的介质回收率＝(介入样品的粘附因子浓度-对照样品的粘附因子浓度)/理论上介入的粘附因子浓度。实验显示该发明的试剂盒在人血清和细胞上清液中的回收率达31～126％。表4.定量抗体芯片在不同介质中的回收率(pg/ml)spikingcmcm+agcm％serumserum+agserum％alcam2,00001,97399％411,88692％bcam50,000043,54387％030,47761％ceacam-150,000048,17596％39430,16360％e-cadherin40,000012,70832％012,48031％epcam10,00009,13791％06,27463％e-selectin50,000057,754116％30738,57477％icam-150,000041,00482％54,633112,939117％icam-250,000027,27355％14,33032,61737％icam-350,000031,86264％031,51863％l-selectin200,0000137,50669％73,849196,90362％ncam-150,0002,18465,343126％24,68979,904110％nrcam50,000045,91792％030,22160％p-cadherin50,00063047,04493％3,71662,841118％pecam-150,000038,20376％037,33375％p-selectin10,000011,348113％2,02913,415114％vcam-1200,0000228,073114％10,674133,38361％ve-cadherin100,000038,29738％040,05640％综上所述，本发明公开了一种同时定量检测多个粘附因子的抗体芯片试剂盒。该试剂盒一方面克服了常规elisa在受体检测中的检测指标单一，耗时，耗力，耗材等缺点，同时也克服了现有多因子检测技术中的低通量，重复性差等弱点。该系统使用标准组织玻片作为表面载体，可以在玻片表面完成多重夹心elisa的反应。同时抗体芯片的规格符合标准96孔酶标板的尺寸，使得高通量样品操作成为可能。另外，我们也证实用该发明所检测的受体的浓度可以达到单个elisa的检测灵敏度和精确度。最后，通过对该芯片在不同样品中介质回收率的测定确准该发明的芯片试剂盒可以运用于血清，细胞上清液等不同的生物样品。当前第1页12