本发明涉及阿尔兹海默症蛋白标志物的用途。具体而言，本发明涉及利用转基因小鼠模型和质谱分析获得的与人阿尔兹海默症疾病严重程度相关的尿蛋白标志物的用途。
背景技术：
在疾病研究中，生物标志物一般是指可供客观监测和评价的生理、病理或治疗过程中的某种特征性的生化指标，通过对其测定可以获知机体当前所处的生物学过程中的进程。监测一种疾病特异性的生物标志物，对于该疾病的早期筛查、诊断、预防及治疗过程中的监控可能起到非常重要的辅助作用。
阿尔兹海默症(alzheimer'sdisease，ad)是常见的以记忆和认知功能障碍为主要特征的进行性神经变性疾病，约占到痴呆患者总数的60-80％。ad多发于老年群体，60岁以上人群中ad的患病率约为5-10％，而在85岁以上人群中ad的患病率急剧增加，高达40-50％。随着人口老龄化的加剧及缺乏有效的预测与治疗手段，ad患者数量一直在增加，预计到2050年全球ad患者数量将达到1.15亿，在美国65岁以上的ad患者将增加三倍之多，而中国也面临这一挑战。ad患者的平均生存期仅为5.5年，该病已成为继心脏病、癌症、中风之后，导致老年人死亡的第四大病因。因此，研发可以用于早期诊断的生物标志物具有重要意义。
血液是机体内环境的重要组成部分，有多种机制来维持血液成分的相对稳定。而尿液是血液经过肾脏滤过生成，经由泌尿系统及尿路排出体外的液体排泄物，完全没有保持稳定的必要性。当某种变化被引入到血液后，机体会通过各种机制把这个变化尽可能地缩小，以保持其成分相对稳定。经肾脏排泄至尿液是其中的主要机制之一，尿液会将这种变化累积，有可能比血液更灵敏地反映这个变化。因此，尿液有可能会成为生物标志物研究的金矿(youhegao.canurinebethegoldmineforbiomarkerdiscovery？.scichinalifesci2013；43.)。
近期研究表明尿液可以很好地反映出机体的多种生理变化，比如年龄、性别、激素水平、昼夜节律、饮食及运动等等，而通常情况下疾病所引起的变化往往远超过机体的生理变化范围，因此认为尿液也应该能够比较灵敏地反映出机体疾病状态下的变化(jiangqiangwuandyouhegaophysiologicalconditionscanbereflectedinhumanurineproteomeandmetabolome.expertrevproteomics.2015；12(6):623-36.)。此外，还有研究表明尿液可以作为多种脑部疾病的生物标志物研究来源，比如抑郁症、精神分裂症、脑中风、帕金森综合症及老年痴呆症等(manxiaanandyouhegaourinarybiomarkersofbraindiseases.genomicsproteomicsbioinformatics.2015dec；13(6):345-54.)。
尿液的成分容易受到多种因素的影响，比如年龄、性别、药物、激素水平、昼夜节律、饮食及运动等，成为尿液生物标志物研究过程中的一大挑战。为了寻找到疾病特异性的生物标志物，我们必须尽可能地消除这些非疾病因素的影响，因此我们提出了通过疾病动物模型的体系来研究尿液生物标志物。在疾病动物模型体系中，动物具有非常相似的遗传背景及相同的生活环境，在各种因素都可控的条件下，能够非常容易地寻找疾病特异的尿液生物标志物。因此本专利通过阿尔兹海默症转基因小鼠模型(app/ps1双转基因小鼠)，该小鼠模型是目前国内外较公认、应用最广泛、研究最深入的ad转基因模型之一。
技术实现要素：
因此，本发明的技术目的在于利用app/ps1双转基因小鼠模型和质谱分析获得的人阿尔兹海默症相关的尿蛋白标志物，以利用其检测受试者健康状态、监测阿尔兹海默症严重程度以及治疗进程和/或预后评估。
换言之，本研究结合蛋白质组学技术和动物模型，研究阿尔兹海默症相关的生物标志物，用于该疾病的早期发现，治疗过程中的监测，和预后评价。本发明发现了一系列用于阿尔兹海默症早期诊断、治疗过程中检测和预后评估的蛋白生物标志物。
本发明为了寻找到人阿尔兹海默症相关的蛋白标志物，利用app/ps1双转基因小鼠模型，在疾病进展过程中获得实验动物尿液，利用质谱技术对疾病发生过程中的尿蛋白组进行鉴定，获得阿尔兹海默症潜在的尿液蛋白标志物。对所获得的蛋白质组数据经过严格的生物信息学分析，获得能够用于该疾病早期诊断、治疗过程中检测和预后评估的蛋白生物标志物。
本发明发现与人阿尔兹海默症相关的尿蛋白标志物，其中未被报道的以蛋白uniprot号显示为43个。
本发明提供了选择性结合至一种或多种蛋白的结合部分在用于制备阿尔兹海默症的诊断试剂中的用途，其中，所述一种或多种蛋白选自阿尔兹海默症转基因小鼠模型与野生型小鼠质谱分析获得的差异蛋白相对应的人源蛋白。
进一步地，所述一种或多种蛋白选自气味结合蛋白2b、酸性哺乳动物壳多糖酶、酸性鞘磷脂磷酸二酯酶3a、甲基多巴-a-α亚基、类胰岛素生长因子结合蛋白7、原骨胶原c内切酶增强子1、乳凝集素、半乳糖脑苷脂酶、α-n-乙酰葡糖胺糖苷酶、膜联蛋白a11、蛋白afamin、溶酶体-prox-羧肽酶、n-乙酰半乳糖-6-硫酸酯酶、脱氧核糖核酸酶-1、氨基肽酶n、血管紧张素转化酶、β-氨基己糖苷酶β亚基、鞘脂激活蛋白原、激肽释放酶-1、胰腺α淀粉酶、血红素结合蛋白、血清转铁蛋白、α1酸性糖蛋白1、纤连蛋白、富亮氨酸-α2-糖蛋白、β2糖蛋白1、免疫球蛋白γ-2链c区、多聚免疫球蛋白受体、补体蛋白c3、α2巨球蛋白、α-1抗胰凝乳蛋白酶、α2抗胰蛋白酶、尿激酶型纤溶酶原激活物、血纤维蛋白溶酶原、补体蛋白d、凝血素、血浆铜蓝蛋白、天冬氨酸蛋白酶a。其中所述一种或多种蛋白对应的uniprot号为q9nph6、q9bzp6、q92484、q16819、q16270、q15113、q08431、p54803、p54802、p50995、p43652、p42785、p34059、p24855、p15144、p12821、p07686、p07602、p06870、p04746、p02790、p02787、p02763、p02751、p02750、p02749、p01859、p01833、p01024、p01023、p01011、p01009、p00749、p00747、p00746、p00734、p00450、o96009。
其中，“结合部分”意思是能够结合至上述蛋白或编码所述蛋白质的mrna的分子或实体。
可选地，所述结合部分包含多肽或由多肽组成。
可选地，所述结合部分包含抗体或其抗原结合片段或抗体或抗原结合片段的变体，或由抗体或其抗原结合片段或抗体或抗原结合片段的变体组成。
我们定义“选择性结合”包括相对于另外的多肽更强地结合至所述蛋白的结合部分；优选所述结合为强至少10倍，优选强至少50倍和甚至更优选强至少100倍。优选结合部分只结合至所述蛋白。
本文使用的术语“多肽”意思是多种氨基酸通过肽键连接在一起。术语“肽”可以与术语“多肽”交换使用，但是肽可以由两种或两种以上的多肽组成。
可选地，所述诊断试剂用于检测受试者健康状态、监测阿尔兹海默症严重程度以及治疗进程和/或评估疾病预后。
优选地，所述一种或多种蛋白是受试者尿液中的蛋白。
在一个具体的实施方案中，前述用途包括：
a)获得受试者的尿液，
b)分离尿液中的蛋白，
c)确定正常人和病人尿液中的蛋白中的前述一种或多种蛋白的水平，
d)其中所述一种或多种蛋白的表达水平是阿尔兹海默症严重程度、治疗进程和/或预后评估的指征；
其中步骤c)使用定量质谱方法、elisa方法或western方法检测。
进一步地，胰腺α淀粉酶、甲基多巴-a-α亚基、补体蛋白d、免疫球蛋白γ-2链c区、血红素结合蛋白、血清转铁蛋白、天冬氨酸蛋白酶a、多聚免疫球蛋白受体、氨基肽酶n、尿激酶型纤溶酶原激活物、类胰岛素生长因子结合蛋白7、凝血素、α1酸性糖蛋白1、血纤维蛋白溶酶原、纤连蛋白、激肽释放酶-1、酸性哺乳动物壳多糖酶、原骨胶原c内切酶增强子1、乳凝集素、膜联蛋白a11、蛋白afamin、β2糖蛋白1、补体蛋白c3在尿液中的表达量增加是阿尔兹海默症严重的指征。
进一步地，α2巨球蛋白、血管紧张素转化酶、脱氧核糖核酸酶-1、α2抗胰蛋白酶、富亮氨酸-α2-糖蛋白、α-1抗胰凝乳蛋白酶、血浆铜蓝蛋白、鞘脂激活蛋白原、β-氨基己糖苷酶β亚基、气味结合蛋白2b、α-n-乙酰葡糖胺糖苷酶、酸性鞘磷脂磷酸二酯酶3a、半乳糖脑苷脂酶、溶酶体-prox-羧肽酶、n-乙酰半乳糖-6-硫酸酯酶在尿液中的表达量降低是阿尔兹海默症严重的指征。
具体实施方式
下面将通过下述非限制性实施例进一步说明本发明，本领域技术人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明做出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。
下述实验方法如无特别说明，均为常规方法，所使用的实验材料如无特别说明，均可容易地从商业公司获取。
实施例
材料与试剂
1)仪器：小鼠代谢笼：购自北京佳源兴业科技有限公司。ltqorbitrapvelos质谱仪：购自thermofisher公司；agilent1200高效液相色谱仪：购自agilent公司；millliqrg超纯水系统：购自millipore公司；c18反相分析柱(rp柱，0.1×150mm，3μm，
2)主要试剂：去离子水来源于millliqrg超纯水系统；色谱级乙腈、甲酸和甲醇为fisher公司生产；碘乙酰铵(iaa)、碳酸氢铵、二硫苏糖醇(dtt)从merck公司购买；测序级胰酶。
3)动物：app/ps1双转基因小鼠(12月龄)由中国医学科学院基础医学研究所马超课题组提供，在标准饲养环境中饲养。
实验方法
1)样品收集流程：12月龄的app/ps1双转基因模型小鼠(相当于人阿尔兹海默症的中晚期)3只及与之年龄和性别相匹配的野生型小鼠3只，放置于小鼠代谢笼中收集器24小时尿液，冻存于-80℃备用。
2)样品处理：
a)尿蛋白提取与保存：各时段尿液于4℃2000g离心20分钟，取上清，置于新ep管内，继续12000g4℃离心20分钟；加入3倍体积预冷的丙酮，混匀后在4℃沉淀过夜；然后4℃2000g离心30分钟，弃掉上清，沉淀晾干后用5倍体积的裂解缓冲液(10ml：4.2尿素，1.54g硫脲，0.05gtris，0.04gdtt重溶)，-80℃保存备用。
b)由于小鼠尿液在15kd处有一丰度非常高的蛋白，严重影响其他低丰度蛋白的鉴定，为了得到更为深度的鉴定，本发明采用了胶内酶切结合lc-ms/ms的方法对小鼠尿液蛋白质组进行鉴定。首先对小鼠的尿蛋白进行一维sds-page，根据电泳的结果按照分子量大小将每个条带切成6份，对其中每一份分别进行反相色谱柱分离，质谱鉴定。
3)反相高效液相色谱分离串联质谱鉴定：
a)色谱方法：酶切后肽段经agilent1200高效液相色谱自动加样器加入安捷伦公司的反相trap柱，通过六通阀转换，进行rp色谱柱(0.1×150mm，magicc18，5μm，
b)质谱方法：从反相柱上洗脱下来的多肽应用ltqorbitrapvelos质谱进行鉴定。
4)数据库检索：
所有质谱结果用mascot软件进行数据库检索。所用数据库为swissprot_2012_07。检索条件为：胰酶酶切；允许有2个漏切位点；半胱氨酸+57da的固定修饰；可变修饰：脱酰胺基的(nq),oxidation(m)。tripletof5600数据质谱数据检索容许误差为：母离子10ppm，子离子0.5da。
5)相对定量分析结果：
所有质谱结果通过初级lc-ms/ms软件进行相对定量结果分析。软件操作根据文献中所示方法使用，参见haucksm,dietterj,kramerrl,等人.decipheringmembrane-associatedmolecularprocessesintargettissueofautoimmuneuveitisbylabel-freequantitativemassspectrometry.molecular&cellularproteomics:mcp2010；9:2292-305。
实验结果
1)来源于6只小鼠(转基因和野生型组各3只)的尿液经过质谱鉴定，基于两肽以上共鉴定的蛋白255个。
2)通过定量分析后，变化倍数大于2，两组间p值小于0.05，且谱图数大于5的差异蛋白共有42个，其中具有人同源蛋白的有38个，按照基因对应关系，将其转换为人的基因后对应的人蛋白包括气味结合蛋白2b、酸性哺乳动物壳多糖酶、酸性鞘磷脂磷酸二酯酶3a、甲基多巴-a-α亚基、类胰岛素生长因子结合蛋白7、原骨胶原c内切酶增强子1、乳凝集素、半乳糖脑苷脂酶、α-n-乙酰葡糖胺糖苷酶、膜联蛋白a11、蛋白afamin、溶酶体-prox-羧肽酶、n-乙酰半乳糖-6-硫酸酯酶、脱氧核糖核酸酶-1、氨基肽酶n、血管紧张素转化酶、β-氨基己糖苷酶β亚基、鞘脂激活蛋白原、激肽释放酶-1、胰腺α淀粉酶、血红素结合蛋白、血清转铁蛋白、α1酸性糖蛋白1、纤连蛋白、富亮氨酸-α2-糖蛋白、β2糖蛋白1、免疫球蛋白γ-2链c区、多聚免疫球蛋白受体、补体蛋白c3、α2巨球蛋白、α-1抗胰凝乳蛋白酶、α2抗胰蛋白酶、尿激酶型纤溶酶原激活物、血纤维蛋白溶酶原、补体蛋白d、凝血素、血浆铜蓝蛋白、天冬氨酸蛋白酶a。各蛋白相对应uniprot号为q9nph6、q9bzp6、q92484、q16819、q16270、q15113、q08431、p54803、p54802、p50995、p43652、p42785、p34059、p24855、p15144、p12821、p07686、p07602、p06870、p04746、p02790、p02787、p02763、p02751、p02750、p02749、p01859、p01833、p01024、p01023、p01011、p01009、p00749、p00747、p00746、p00734、p00450、o96009。
3)其中，23个在阿尔兹海默症的尿液中升高，蛋白名称如下胰腺α淀粉酶、甲基多巴-a-α亚基、补体蛋白d、免疫球蛋白γ-2链c区、血红素结合蛋白、血清转铁蛋白、天冬氨酸蛋白酶a、多聚免疫球蛋白受体、氨基肽酶n、尿激酶型纤溶酶原激活物、类胰岛素生长因子结合蛋白7、凝血素、α1酸性糖蛋白1、血纤维蛋白溶酶原、纤连蛋白、激肽释放酶-1、酸性哺乳动物壳多糖酶、原骨胶原c内切酶增强子1、乳凝集素、膜联蛋白a11、蛋白afamin、β2糖蛋白1、补体蛋白c3；15蛋白个下降，蛋白名称如下α2巨球蛋白、血管紧张素转化酶、脱氧核糖核酸酶-1、α2抗胰蛋白酶、富亮氨酸-α2-糖蛋白、α-1抗胰凝乳蛋白酶、血浆铜蓝蛋白、鞘脂激活蛋白原、β-氨基己糖苷酶β亚基、气味结合蛋白2b、α-n-乙酰葡糖胺糖苷酶、酸性鞘磷脂磷酸二酯酶3a、半乳糖脑苷脂酶、溶酶体-prox-羧肽酶、n-乙酰半乳糖-6-硫酸酯酶。
结果参见表1。
表1：在6只小鼠中(转基因(ad1-ad3)和野生型(wt1-wt3)各3只)具有显著差异的38个蛋白相对应的人同源蛋白uniprot号、蛋白名称，以及在三次实验中变化蛋白的相对定量信息(谱图数)