本发明涉及一种检测方法，具体是一种伊维菌素检测方法及试剂盒。
背景技术：
20世纪90年代以后，绝大多数测定食品中伊维菌素类药物残留的理化检测法主要依靠液相色谱技术进行分离，其次是色／质谱联用技术，气相色谱法、高效薄层色谱法等检测法，因其各自特有的性能，在抗生素残留检测方面稍有应用。色谱法检测牛乳中的药物残留要经过样品处理（包括样品的提取、脱蛋白、离心、层析柱净化、衍生化等步骤）、残留药物的分离和残留药物的检测。理化检测法利用抗生素分子中的基团所具有的特殊反应或性质来测定其含量，能进行定性、定量分析和药物鉴定，可作为乳中抗生素检测的确证方法。该法检测敏感性较高，但仪器及检测费用高、检测程序复杂、较耗时间等，这些不利因素使该法仅限于实验室乳样测定。免疫学分析法是以抗原与抗体的特异性、可逆性结合反应为基础的分析方法，目前药物残留免疫分析技术主要分三大类：相对独立的分析方法、免疫分析技术与常规理化分析技术联用的方法、免疫受体法。1973年荷兰vanweeman、schμrrs及瑞典Engvall、Perlmann分别提出酶联免疫吸附法，30多年来国内外学者对免疫学方法检测食品中抗生素进行了大量研究。但由于抗生素是半抗原，抗原构建技术难度大、免疫特异性强、检测成本高，目前IDEXX实验室公司、Cha瑚Sciences等公司在免分析法方面的研究较为成熟，国内该技术仍处于研究发展中。当前主要是用酶联免疫吸附试验、放射性免疫发光法、荧光免疫法、化学发光法等，对比现有的几种标记免疫技术灵敏度的可知酶免与发光相比较，其酶免灵敏度较低。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种伊维菌素检测方法及试剂盒，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种伊维菌素检测试剂盒，所述的试剂盒包含有：(1)包被伊维菌素抗原的酶联板或包被伊维菌素特异性抗体的酶联板；(2)酶标记伊维菌素特异性抗体或酶标记伊维菌素抗原；(3)伊维菌素标准品溶液；(4)底物显色液；(5)终止液；(6)浓缩洗涤液和(7)浓缩复溶液；所述包被伊维菌素抗原的酶联板或包被伊维菌素特异性抗体的酶联板的制备步骤为：(1)用包被缓冲液将伊维菌素半抗原与载体蛋白偶联物或抗体以0.02-0.08µg/ml浓度稀释成抗原稀释液或抗体稀释液；(2)向酶联板的每孔中加入100µl已经稀释好的抗原稀释液或抗抗体稀释液，37℃温育2h，倾去包被液，用洗涤液洗涤4次，每次15-30s，拍干；(3)向酶联板的每孔中加入150-200µl封闭液，37℃温育1-2h，倾去孔内液体，干燥后用铝膜真空密封保存。
一种伊维菌素检测方法如下：使用伊维菌素系列标准溶液浓度分别为：0.1ng/mL（0标准）、0.5ng/mL、0.8ng/mL、lng/mL、5ng/mL、10ng/mL，向酶联板中加入50μL/孔的伊维菌素系列标准浓度溶液或样品溶液，然后加入伊维菌素抗体工作液50μL/孔，室温（25℃)恒温孵育2.5h；2）洗涤：倾出孔中液体，向酶联板中加入200μL/孔的洗涤液，静置5min后拍干，重复三次；3）加酶标二抗：每孔加入酶标二抗工作液100μL，室温恒温孵育1.5h;4）洗涤：倾出孔中液体，向酶联板中加入280μL/孔的洗涤液，静置5min后拍干，重复三次；5）加发光液：每孔加入发光液l00μL；6）检测：用化学发光免疫分析仪测定每孔的发光强度；7）结果判定：以所测得的伊维菌素系列标准浓度溶液对应的孔的发光值，除以第一个标准（0标准）的发光值再乘以100，得到抑制率B/B0%，以抑制率为纵坐标，各伊维菌素系列标准浓度溶液浓度的对数为横坐标作标准曲线，根据样品溶液所对应的孔的发光值和所得标准曲线，计算得到样品溶液的浓度。
作为本发明再进一步的方案：缓冲液为pH值9.6、0.05mol/L、含有0.5%甲醇的碳酸盐缓冲液；所述的洗涤液为含有8%-15%吐温-20℃的去离子水或超纯水；所述的封闭液为含有8%-15%的脱脂奶和1%惰性蛋白的溶液；所述的载体蛋白为兔血清蛋白、人血清白蛋白、人血纤维蛋白或血蓝蛋白。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明方法能克服传统的检测方法存在的检测周期长、步骤繁琐、费时费力等缺点，使检测时间大大缩短，操作步骤和劳动强度也大为缩减，达到省时省力、快速灵敏的要求。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
本发明实施例中，一种伊维菌素检测试剂盒，所述的试剂盒包含有：(1)包被伊维菌素抗原的酶联板或包被伊维菌素特异性抗体的酶联板；(2)酶标记伊维菌素特异性抗体或酶标记伊维菌素抗原；(3)伊维菌素标准品溶液；(4)底物显色液；(5)终止液；(6)浓缩洗涤液和(7)浓缩复溶液；所述包被伊维菌素抗原的酶联板或包被伊维菌素特异性抗体的酶联板的制备步骤为：(1)用包被缓冲液将伊维菌素半抗原与载体蛋白偶联物或抗体以0.02-0.08µg/ml浓度稀释成抗原稀释液或抗体稀释液；(2)向酶联板的每孔中加入100µl已经稀释好的抗原稀释液或抗抗体稀释液，37℃温育2h，倾去包被液，用洗涤液洗涤4次，每次15-30s，拍干；(3)向酶联板的每孔中加入150-200µl封闭液，37℃温育1-2h，倾去孔内液体，干燥后用铝膜真空密封保存。本发明伊维菌素检测方法如下：使用伊维菌素系列标准溶液浓度分别为：0.1ng/mL（0标准）、0.5ng/mL、0.8ng/mL、lng/mL、5ng/mL、10ng/mL，向酶联板中加入50μL/孔的伊维菌素系列标准浓度溶液或样品溶液，然后加入伊维菌素抗体工作液50μL/孔，室温（25℃)恒温孵育2.5h；2）洗涤：倾出孔中液体，向酶联板中加入200μL/孔的洗涤液，静置5min后拍干，重复三次；3）加酶标二抗：每孔加入酶标二抗工作液100μL，室温恒温孵育1.5h;4）洗涤：倾出孔中液体，向酶联板中加入280μL/孔的洗涤液，静置5min后拍干，重复三次；5）加发光液：每孔加入发光液l00μL；6）检测：用化学发光免疫分析仪测定每孔的发光强度；7）结果判定：以所测得的伊维菌素系列标准浓度溶液对应的孔的发光值，除以第一个标准（0标准）的发光值再乘以100，得到抑制率B/B0%，以抑制率为纵坐标，各伊维菌素系列标准浓度溶液浓度的对数为横坐标作标准曲线，根据样品溶液所对应的孔的发光值和所得标准曲线，计算得到样品溶液的浓度。缓冲液为pH值9.6、0.05mol/L、含有0.5%甲醇的碳酸盐缓冲液；所述的洗涤液为含有8%-15%吐温-20℃的去离子水或超纯水；所述的封闭液为含有8%-15%的脱脂奶和1%惰性蛋白的溶液；所述的载体蛋白为兔血清蛋白、人血清白蛋白、人血纤维蛋白或血蓝蛋白。
实施例1：
本发明伊维菌素检测试剂盒，所述的试剂盒包含有：(1)包被伊维菌素抗原的酶联板或包被伊维菌素特异性抗体的酶联板；(2)酶标记伊维菌素特异性抗体或酶标记伊维菌素抗原；(3)伊维菌素标准品溶液；(4)底物显色液；(5)终止液；(6)浓缩洗涤液和(7)浓缩复溶液；所述包被伊维菌素抗原的酶联板或包被伊维菌素特异性抗体的酶联板的制备步骤为：(1)用包被缓冲液将伊维菌素半抗原与载体蛋白偶联物或抗体以0.02µg/ml浓度稀释成抗原稀释液或抗体稀释液；(2)向酶联板的每孔中加入100µl已经稀释好的抗原稀释液或抗抗体稀释液，37℃温育2h，倾去包被液，用洗涤液洗涤4次，每次15s，拍干；(3)向酶联板的每孔中加入200µl封闭液，37℃温育1-2h，倾去孔内液体，干燥后用铝膜真空密封保存。本发明伊维菌素检测方法如下：使用伊维菌素系列标准溶液浓度分别为：0.1ng/mL（0标准）、0.5ng/mL、0.8ng/mL、lng/mL、5ng/mL、10ng/mL，向酶联板中加入50μL/孔的伊维菌素系列标准浓度溶液或样品溶液，然后加入伊维菌素抗体工作液50μL/孔，室温（25℃)恒温孵育2.5h；2）洗涤：倾出孔中液体，向酶联板中加入200μL/孔的洗涤液，静置5min后拍干，重复三次；3）加酶标二抗：每孔加入酶标二抗工作液100μL，室温恒温孵育1.5h;4）洗涤：倾出孔中液体，向酶联板中加入280μL/孔的洗涤液，静置5min后拍干，重复三次；5）加发光液：每孔加入发光液l00μL；6）检测：用化学发光免疫分析仪测定每孔的发光强度；7）结果判定：以所测得的伊维菌素系列标准浓度溶液对应的孔的发光值，除以第一个标准（0标准）的发光值再乘以100，得到抑制率B/B0%，以抑制率为纵坐标，各伊维菌素系列标准浓度溶液浓度的对数为横坐标作标准曲线，根据样品溶液所对应的孔的发光值和所得标准曲线，计算得到样品溶液的浓度。缓冲液为pH值9.6、0.05mol/L、含有0.5%甲醇的碳酸盐缓冲液；所述的洗涤液为含有8%-15%吐温-20℃的去离子水或超纯水；所述的封闭液为含有8%-15%的脱脂奶和1%惰性蛋白的溶液；所述的载体蛋白为兔血清蛋白、人血清白蛋白、人血纤维蛋白或血蓝蛋白。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。