一种利用荧光光谱监控酶法制备降血糖肽的方法与流程

本发明属于食品生物技术领域，具体涉及一种利用荧光光谱监控酶法生产降血糖肽的方法。

背景技术：

随着经济水平的不断提高，人们饮食条件越来越好，然而缺乏运动以及不合理的生活作息，导致糖尿病的发病率逐年增加。长期高血糖会导致蛋白尿、高血压、动脉粥样硬化、神经系统病变和感染等并发症状，严重影响着人类健康。

α-葡萄糖苷酶抑制剂是一类抑制小肠内α-葡萄糖苷酶活性的物质，可以显著降低人们的餐后血糖。开发新型α-葡萄糖苷酶抑制剂是众多研究人员的努力方向。近年来，已有利用山杏、杂色蛤、蚕丝、蛋清和乳清原料制备降血糖肽的报道。

蛋白质酶解是一个复杂的变化过程。由于受底物浓度、蛋白酶浓度、外界因素(超声波、微波等)影响，导致酶解反应终点控制难以进行。因此，研发一种用于酶解制备降血糖肽的过程监控方法，对于制备高活性降血糖肽的质量控制有重要的意义。此外，对于节能减排也有重要的意义，并且在其他酶解反应也有广阔的应用前景。

随着研究的深入，寻找合适的原料，制备高活性的降血糖肽成为研究重点。2011年，我国将牡丹籽油正式批准成为新型食用油，油料牡丹的种植面积逐年递增，榨油后废弃物(牡丹籽粕)产量也不断增加。牡丹籽粕中蛋白含量高达28.34％(w/w)，含有18种天然氨基酸，其中8种人体必须氨基酸占30.44％，具有极大的开发和应用前景。小麦是我国的主要粮食作物之一，麦胚是小麦加工过程中的副产品，是小麦籽粒中最重要的精华部分，麦胚中含有优质蛋白。从麦胚中提取胚芽油后的麦胚蛋白占全部麦胚质量的30％，长期以来没有得到很好的利用，因此是巨大的资源浪费，目前人们开始越来越关注脱脂麦胚的后加工处理。以麦胚蛋白和牡丹籽蛋白为原料制备高活性的降血糖肽，能够提高这两种蛋白资源的利用率。

制备降血糖肽的酶解反应体系，到达特定的反应时间时终止反应。目前，在酶解法制备降血糖肽过程中，尚无有效的监控方法，导致产品的质量难以稳定可靠，这与现代工业化生产极不相称。因此迫切需要建立一种快速监控酶解目标产物含量或活性的方法，以期获得更多高效的目标产物。

技术实现要素：

发明目的：为了解决上述问题，本发明通过获取内源性色氨酸荧光峰位变化，并将此变化与酶解产物的活性建立关联，从而建立一种利用荧光光谱监控酶法制备降血糖肽的方法，从而实现提高降血糖肽的产率，便于工业化大规模生产应用。

技术方案：为实现上述技术目的，本发明的利用荧光光谱监控酶法生产降血糖肽的方法包括如下步骤：

(1)采集不同时间下酶解反应液的荧光光谱：

使用荧光光谱仪获得酶解反应液的荧光光谱，设置激发波长280nm，发射波长300～500nm，在酶解反应的0～60min内选取若干时间节点对酶解反应液进行荧光光谱扫描；

(2)获取荧光光谱的峰位：

采用二次一阶多项式的1阶导数法方法，宽度为5～21点，计算出导数值为0时的波长值，即为荧光光谱的峰位；

(3)建立荧光光谱峰位与酶解反应液对α葡萄糖苷酶活性的抑制率的关系：根据方程y＝ax²+bx+c对数据进行拟合，获得参数a、b、c，其中y是对α葡萄糖苷酶活性的抑制率，x是荧光光谱的峰位；

(4)蛋白酶解液对α葡萄糖苷酶抑制率的实时监控：

在酶解过程中，对酶解反应液进行荧光光谱扫描，获得荧光光谱，根据步骤(2)中的方法获得荧光光谱的峰位x，将峰位x代入步骤(3)所获的方程，计算得到酶解产物对α葡萄糖苷酶活性的抑制率。

优选地，所述的酶解反应液为牡丹籽蛋白酶解液或麦胚蛋白酶解液。

对于步骤(1)中，节点个数的选取根据经验，节点越多，做出来的方法越好，也越准确。但太多，试验复杂，也会增加工作量。优选地，步骤(1)中，在酶解反应的0～60min内选取3～15个节点。

当所述酶解反应液为牡丹籽蛋白酶解液时，步骤(1)中分别在酶解0、3、6、9、12、15、20、30、45、60min时对酶解反应液进行荧光光谱扫描；当所述酶解反应液为麦胚蛋白酶解液时，步骤(1)中分别在酶解0、2.5、5、7.5、10、12.5、15、17.5、20、25、30、40、50min时对酶解反应液进行荧光光谱扫描。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

(1)本发明通过采集降血糖肽的制备过程中荧光光谱，对其进行分析计算，能够得到酶解反应产物对α葡萄糖苷酶活性的制率，具有方便、速度快的优点。此外，在检测过程中，无需化学试剂，检测成本低，并且不会对环境造成污染。这些优点是湿化学检测方法无可比拟的。

(2)本发明方法能够提高工业化生产牡降血糖肽的质量，因而产品能够更好的降低糖尿患者的血糖浓度，提高了人们的健康水平，有极大的社会价值，同时也有巨大的经济价值。

(3)本发明方法不仅对于降血糖肽的制备有效，也对酶解方法制备其他功能性肽也有借鉴作用。

附图说明

图1为实施例1的荧光光谱图；

图2为实施例2所获的荧光光谱；

图3为实施例3所获荧光强度；

图4为实施例1拟合结果；

图5为实施例2拟合结果；

图6为实施例3拟合结果。

具体实施方式

本发明提供了一种荧光光谱监控酶解法生产降血糖肽的方法，实现对降血糖肽制备过程的实时监控，便于工业化的高效生产和管理，对于产品质量稳定性、可靠性有重要的保障作用。

以下通过具体的实施例详细说明本发明。

其中，α-葡萄糖苷酶抑制率的检测方法如下：

(1)鼠源性α-葡萄糖苷酶制备

脱臼处死小鼠，用0℃生理盐水洗去杂物，液氮研磨。将pbs与研磨粉混合，按照体积质量比10∶1配比，涡旋提取60s，4℃8000r/min离心15min，取上清。

(2)α-葡萄糖苷酶抑制率检测方法

水浴37℃反应15min，405nm处检测吸光值；

抑制率计算方法如下：

(3)所需试剂

pbs：0.05mol/lph6.8磷酸盐缓冲液

pnpg溶液：准确称取50mg的pnpg(对硝基苯酚-α-d-吡喃葡萄糖苷)，溶于10mlpbs。

酶溶液：提取鼠源性酶溶液在1.6mlpbs+0.2mlpnpg+0.2ml酶溶液反应体系中，水浴37℃反应15min，od405在0.4～0.45之间。

实施例1

取0.8％(w/v)牡丹籽蛋白溶液50ml，加胰蛋白酶量5000u/g，保持ph8.0，温度37℃，分别在0、3、6、9、12、15、20、30、45、60min时取样20μl，加入4mlph8.0、0.05mol/l的pbs缓冲液稀释。

使用f-4600荧光光谱仪进行光谱扫描，激发波长280nm，发射波长300～500nm，波长分辨率0.2nm，扫描速度1200nm/min，延迟时间0.5s，电压700v，获得荧光光谱，如图1所示。

对所获荧光光谱进行求1阶导数，窗口宽度21点，通过数值计算得到导数值是0时的波长值，即为荧光光谱的峰位值，如表1所示。

表1超声酶解与普通酶荧光解峰位与时间对照表

实施例2

浓度0.8％(w/v)的牡丹籽蛋白溶液50ml，加胰蛋白酶量5000u/g。采用超声酶解方法，超声波频率28khz，功率100w，分别在0、3、6、9、12、15、20、30、45、60min时取样20μl，加入4mlph8.0浓度0.05mol/l的pbs缓冲液稀释。

使用f-4600荧光光谱仪进行荧光光谱扫描。激发波长280nm，发射波长300～500nm，波长分辨率1nm，扫描速度1200nm/min，延迟时间0.5s，电压700v，采集荧光光谱，结果如图2所示。

对所获荧光光谱进行求1阶导数，窗口宽度5点，通过数值计算得到导数值是0时的波长值，即为荧光光谱的峰位值，如表1所示。

表2实施例2荧光光谱的峰位值

实施例3

0.8％(w/v)麦胚蛋白溶液50ml，使用功率为60w，频率为65khz的超声波，在48℃下处理超声预处理27min，实现对麦胚蛋白的预处理。加胰蛋白酶酶解，加酶量25000u/g。在0、2.5、5、7.5、10、12.5、15、17.5、20、25、30、40、50min时分别取样50μl，加入4mlph8.0浓度0.05mol/l的pbs缓冲液稀释。

使用f-4600荧光光谱仪检测，激发波长280nm，发射波长300～500nm，扫描速度1200nm/min，延迟时间0.5s，发射波长间隔0.2nm，电压700v进行扫描。光谱结果如图3所示。

对所获荧光光谱进行求导数，窗口宽度11点，通过数值计算得到导数是0时的波长值，即为荧光光谱的峰位值，如表2所示。

表3实施例3荧光光谱的峰位值

实施例4

将实施例1的荧光峰位与α-葡萄糖苷酶抑制率数据进行拟合，得到方程y＝-1.2081x²+833.72x_143814，结果见图4，r²为0.9669，表示拟合效果好，可以用于降血糖肽的实时监控。

实施例5

将实施例2的荧光峰位与α-葡萄糖苷酶抑制率数据进行拟合，得到方程y＝-1.8749x²+1290.3x-221987，结果见图5，r²为0.9624，表示拟合效果好，可以用于降血糖肽的实时监控。

实施例6

将实施例3的荧光峰位与α-葡萄糖苷酶抑制率数据进行拟合，得到方程y＝-0.358x²+247.84-42862，结果见图6，r²为0.9810，表示拟合效果好，可以用于降血糖肽的实时监控。

实施例7

取1％(w/v)牡丹籽蛋白溶液50ml，加胰蛋白酶量5000u/g，保持ph8.0，温度37℃，取样50μl，加入4mlph8.00.05mol/l的pbs缓冲液稀释。

使用f-4600荧光光谱仪进行光谱扫描，激发波长280nm，发射波长300～500nm，波长分辨率0.2nm，扫描速度1200nm/min，延迟时间0.5s，电压700v，获得荧光光谱。对所获荧光光谱进行求1阶导数，窗口宽度9点，通过数值计算得到导数值是0时的波长值347.3，即为荧光光谱的峰位值。利用实施例4所得方程，计算得到y为28.5％，通过化学方法检测到的降血糖肽对α-葡萄糖苷酶抑制率为27.8％，两者很相近，可以用于降血糖肽的生产的监控。